YT YouTube2Text

YouTube2Text → Transcripts → T5 IBMC_2026_1c Proteínas 2 Alejandra Guberman (virtual)

T5 IBMC_2026_1c Proteínas 2 Alejandra Guberman (virtual) — Transcript

by Alejandro Colman-Lerner · 25,782 words · 4,100 segments · language en · Watch on YouTube

Open in transcriber Summarize with AI Download SRT/VTT

Full transcript

0:03Bien, ahora vuelvo a compartir entonces.
0:16Ahí va.
0:18arrancamos clase de hoy.
0:20Entonces, para arrancar hacemos la clase
0:23de hoy va a ser justamente cómo podemos
0:25estudiar las estructuras de las
0:26proteínas, que eso, la estructura de las
0:29proteínas, que eso les había adelantado
0:31eh la clase pasada, pero antes un mini
0:35repasito de los conceptos más
0:36importantes como para que estemos todos
0:38en sintonía y si alguno se perdió ahí eh
0:41me avisa y voy a tratar de profundizar
0:43en las preguntas que me hicieron al
0:44principio a ver si termina de quedar
0:47claro. Pero vamos, voy a tratar de que
0:50no sea un plomo este repaso y de ir más
0:52o menos rápido, pero me van frenando
0:53cualquier cosa.
0:55¿Se acuerdan que vamos bien? Genial.
0:58Entonces, ¿se acuerdan que las proteínas
1:00son biomoléculas que son polímeros y los
1:03el monómero que las forma son los
1:05aminoácidos que lo los abreviamos así
1:07como a a se acuerdan? Y cada aminoácido
1:11tiene en general la misma estructura que
1:13es un carbono que tiene un hidrógeno, un
1:16grupo amino, un grupo carboxilo y una
1:18cadena lateral. ¿Sí? Y los aminoácidos
1:21se iban uniendo entre sí justamente por
1:23una unión entre el grupo amino de un de
1:28un aminoácido y el carboxilo del
1:29siguiente. ¿Sí?
1:32Eh, y en esta unión se pierde una
1:34molécula de agua y la unión se llama
1:36unión peptídica, que es un tipo de unión
1:38que se llama químicamente es una unión
1:40amida, pero no importa, solo por si la
1:42leen por ahí, pero es una unión
1:43peptídica. Vamos bien. Y todas las
1:45cadenas laterales eran diferentes y eso
1:49le daba propiedades específicas a cada
1:51aminoácido.
1:53Habíamos habíamos tomado imágenes de
1:56este videío de divulgación donde
1:58representaban a los distintos
1:59aminoácidos como agrupados según las
2:02características en que se parece. Las
2:05cadenas laterales, aunque son distintas,
2:07tienen propiedades químicas parecidas,
2:10¿sí? como los que son positivos o
2:12negativos, polares, algunos casos
2:15especiales, ¿se acuerdan?
2:18Y justamente estas cadenas laterales
2:22son fundamentales en la en el cuando se
2:26forma la estructura tridimensional, de
2:29hecho, la estructura terciaria, que
2:30ahora vamos a ir repasando cómo son los
2:32niveles distintos de la estructura de
2:34una proteína, pero por interacción entre
2:37las cadenas laterales de diferentes
2:38aminoácidos que incluso pueden estar
2:40lejos en eh están lejos, de hecho,
2:44pueden formarse eh estas interacciones
2:47que van definiendo el plegamiento y la
2:51estructura tridimensional de la proteína
2:53en su ambiente nativo y eso es necesario
2:56para que esa proteína pueda funcionar
2:58independientemente de cuál sea la
3:00proteína y su función. Y tenemos en
3:02general uniones débiles de en distintos
3:06tipos de uniones según cuáles sean esas
3:07cadenas laterales. Y también puede estar
3:09esa unión covalente que yo les había
3:11contado que son los puentes de sulfuro.
3:13En los puentes de sulfuro solo se pueden
3:15formar entre cisteínas, que son los
3:17aminoácidos que tienen este grupo
3:20sulfidrilo o SH que puede estar en
3:22estado oxidado.
3:26está formando el puente de insulfuro y
3:28en estado reducido están sin sin formar
3:32ese ese puente. Sí, cuando recién se
3:34sintetiza que está así sin sin unirse
3:37con nadie, ¿sí? Pero si se va a formar
3:40un puente de sulfuro, eso está
3:43ocurre como una modificación
3:44postrauccional que ahora en un ratito la
3:46repasamos. ¿Sí?
3:48Y estos puentes de sulfuro pueden estar
3:50uniendo dos cadenas poliptídicas por
3:52separado o pueden estar participando de
3:54la estructura tridimensional formando
3:57puentes intracatenarios también. Intra o
4:00inter, ¿sí?
4:04Y entonces habíamos dicho que la
4:06estructura proteica tiene cuatro niveles
4:09y vamos a ir con la parte más simple y
4:11después nos metemos en eso de los
4:13motivos y los dominios, que a lo mejor
4:14es un poquito más complicado, pero los
4:16cuatro niveles tenemos eh, perdón,
4:22la estructura primaria que era
4:24justamente la secuencia de aminoácidos,
4:26la cadenita de aminoácidos y entonces
4:29cuáles y cuáles son y cuántos hay de
4:32cada aminoácido, ¿sí? Y que había una
4:33convención que se los escribía desde el
4:35extremo amino al extremo carboxi, que es
4:38la misma dirección en la que se
4:39sintetiza una proteína.
4:42Después podía mostrar la estructura
4:43secundaria
4:45que eh había dos eh estructuras,
4:49dos tipos de plegamientos fundamentales
4:51que son la alfa hélice o las hojas beta
4:54plegadas que había de distintos tipos,
4:57paralela y antiparalela, ¿se acuerdan? y
4:59que en general todos los aminoácidos
5:02podían participar de esas uniones porque
5:05eh perdón de esas estructuras porque se
5:07estabilizaban por uniones entre átomos
5:10que todos los aminoácidos tienen, ¿no?
5:12No participan en las cadenas laterales.
5:14Sí. Y también podíamos tener regiones
5:16sin estructura. Sí. Después teníamos la
5:19estructura terciaria, que es como ahora
5:23eh esta cadena poliptídica ahí sí toma
5:26una estructura tridimensional. Esto ya
5:28es tridimensional, pero es como un
5:30primer nivel de pliegamiento. Y después
5:32tenemos la estructura terciaria, que es
5:33cómo se pliega en el espacio. Y ahí sí
5:35involucra interacción entre eh cadenas
5:38laterales de aminoácidos que están más
5:40lejos, esta zona entre aminoácidos que
5:42están bastante que están cercanos. Y
5:45además podíamos después tener estructura
5:47cuaternaria si la proteína en cuestión
5:51está formada por más de una cadena
5:53poliptídica y en ese caso se la denomina
5:55subunidad.
5:57Sí.
5:58Y entonces acá eh les dejo tablitas
6:01donde tenemos el glosario de lo que
6:03define estructura primaria, secundaria,
6:05terciaria, cuaternaria. Pero además
6:07habíamos visto cosas intermedias y eso
6:09fue lo que un poquito a lo mejor es un
6:12poco más confuso. Y entonces habíamos
6:14visto el concepto de motivos
6:16estructurales
6:17y de dominios. Los motivos estructurales
6:21los definimos como una estructura
6:23sundaria
6:25porque es como algo intermedio entre la
6:27secundaria y la terciaria, pero en
6:29realidad no es más que
6:32combinaciones de elementos con
6:34estructuras secundarias determinadas que
6:36se encuentran repetidos en algunos
6:38casos. Y yo les había dado ejemplos que
6:41creo que ahora tengo unas diapos donde
6:43lo repaso también.
6:45Y entonces simplemente eh se los conoce
6:49como motivos estructurales porque son
6:51algo que se repite y que uno se lo va
6:53encontrando en diferentes proteínas y
6:55asociados a una forma en particular,
6:58pero que si yo ese motivo lo aislo de la
7:00proteína se desarma, ¿sí? No se no llega
7:03a ser una estructura terciaria.
7:06Y después habíamos visto el concepto de
7:08dominios que yo les comentaba cuando
7:10tenemos una pregunta, ¿sí?
7:14¿Los motivos están asociados a una forma
7:16y función o solamente forma?
7:19Principalmente forma. Creo que ahora
7:21tengo una diapo donde justamente hago
7:23esa distinción. Eso te da una forma. Lo
7:25que pasa que a veces uno se encuentra
7:28100 o mucho esa forma asociada a una
7:31función, pero no es siempre. Por eso yo
7:34ahora les les voy a mostrar, yo no me
7:37acuerdo si la diapo que sigue, sí, en la
7:39diapo que sigue tengo unos ejemplos,
7:41pero se acuerdan que yo les conté el
7:43motivo del barrilito beta, que me parece
7:48no puse la diapo de vuelta, pero el
7:50barrilito beta es un motivo donde
7:53teníamos ciertas hojas eh beta de una
7:56forma y había algún alfa hélice por ahí
7:57también y formaba un barril, pero en un
7:59caso era un canal y en el otro caso era
8:01la proteína verde fluorescente.
8:03son otra función completamente y sin
8:06embargo es el mismo motivo estructural.
8:08Entonces, pero los dos tienen la misma
8:10forma. ¿Está bien,
8:14Karina? Me habías preguntado.
8:15Sí, sí,
8:16perfecto.
8:17Gracias.
8:18No, por favor. Eh, bueno, y dominios.
8:22Eh, ahora sí, dominio, ya estamos en
8:25estructura terciaria, pero se le se
8:30reserva el término de dominio para una
8:32región que se que tiene un plegamiento
8:35independiente. Entonces, a veces nos
8:37encontramos con proteínas grandes que
8:39tienen varios dominios. Sí. Y esos sí
8:41suelen estar asociados a una función. Y
8:43ahí sí,
8:45ah, hay alguien. Bueno, todo bien.
8:48¿Alguna duda o
8:52eh ahí si
8:55uno aísla un dominio del resto de la
8:58cadena poliptídica,
9:00se mantiene esa estructura
9:02tridimensional, porque justamente lo que
9:04tiene es un plegamiento independiente
9:06del resto, a diferencia del motivo
9:08estructural. ¿Está bien? Entonces, acá
9:11vuelvo a estos ejemplos de
9:15distintos motivos estructurales que
9:17forman un dominio para repasar esos dos
9:20conceptos. Fíjense que acá no coincide
9:21exactamente dominio con motivo porque
9:25tenemos, bueno, los dedos de zinc o no
9:29hay una
9:31una relación que es unívoca, digamos.
9:33tenemos diferentes dominios eh
9:36diferentes, perdón, motivos
9:37estructurales que son otras formas que
9:39tienen incluso eh varias proteínas que
9:43se unen al ADN, que van a ser eh motivos
9:46estructurales que son conocidos y que se
9:48encuentran en distintas proteínas de
9:49unión al ADN,
9:51pero todas están formando parte del
9:53dominio unión al ADN. Entonces, el
9:54dominio funcional es el dominio unión al
9:56ADN, pero algunos tienen un motivo
9:59estructural con esta formita y que se
10:02llama dedos de zinc. Otros tienen este
10:04motivo estructural que es hélice vuelta
10:06hélice y otros tienen este que me gusta
10:09porque me gusta como ejemplo para
10:11mostrar bien las diferencias porque este
10:14motivo estructural que se llama cierre
10:15de leucinas e que lo tienen varios
10:18proteínas de estas que se unen al ADN y
10:20regulan la expresión de los genes que se
10:22llaman factores de transcripción varias,
10:24no todas, no algunas algunas familias
10:27son con se llama factores de
10:29transcripción con dominio de cierre de
10:31leucina o con motivo estructural cier
10:32cierre de leucinas. Fíjense que este
10:35cierre de leucinas se llama cierre
10:37porque tiene toda una serie de leucinas
10:39así y que son la leucina es hidrofóbica
10:43y se y se ordenan mandando la parte
10:45hidrofóbica hacia adentro cuando se
10:47están formando así estas estructuras,
10:49estos dímeros
10:51y tienen otra partecita así con todo un
10:53montón de aminoácidos positivos. Y
10:56entonces este todo esto se llama cierre
10:58de leucina y lo que tiene es un motivo
11:02estructural pero con dos dominios
11:03funcionales. Un dominio
11:06de dimerización que va a permitir que se
11:09una
11:11de las proteínas con la otra y otro
11:15dominio que es el dominio de unión al
11:17ADN. Entonces, se dan cuenta, en este
11:19caso tenemos un motivo estructural que
11:21representa una forma y una combinación
11:25de estructuras secundarias y de una
11:26combinación de ciertos aminoácidos, de
11:28ciertas secuencias en este caso, que me
11:30la encuentro en varias proteínas y sin
11:32embargo tiene dos dominios. Esto define
11:36dos dominios funcionales distintos.
11:39¿Está bien?
11:41Y ahora para cerrar este tema de los
11:43dominios, que puse varios días pues para
11:46repasarlos porque me imaginé que era un
11:48tema que siempre cuesta un poquito más,
11:50es esta día pues recontra complicada,
11:52pero ahora que ya tuvieron toda la otra
11:53clase entera, capaz la le pueden ver con
11:57un poco más de de cariño, que solo la
12:00puse acá para mostrarles proteínas muy
12:02locas, así que las van a ver después con
12:04Omar, van a ver traducción de señales y
12:06de esto va a aparecer un montón, pero
12:08fíjense que esta, por ejemplo, esta
12:11verde oscura, es una proteína que la
12:13representaron con cuatro dominios
12:16diferentes acá y de hecho cada uno de
12:17estos dominios tiene un nombre, están
12:19escritos acá. Por ejemplo, este que dice
12:23eh SH2
12:26se llama así porque tiene ese nombre,
12:28porque se parece otra cosa, no importa.
12:30Y es un dominio que lo que hace es
12:33unirse a a una tirosina que está
12:36fosforilada.
12:38Este dominio que está acá se llama
12:39dominio quinasa, que es uno que tiene
12:41capacidad de poner fosfatos, por
12:43ejemplo, tirosinas.
12:45Este dominio así se llama eh es un
12:48dominio que ya habíamos visto que se une
12:51a tirosina fosforilada y acá tiene otro
12:52dominio que se une a otra cosa distinta
12:55que es a esto, a a poliprolíneo, por
12:58ejemplo. ¿Se dan cuenta?
13:00Entonces,
13:02todos estos dominios
13:04en realidad son regiones que en un en
13:07una misma cadena poliptídica
13:11tienen plegamiento independiente. ¿Está
13:13bien?
13:15Y esta me viene bien como para repasar
13:18ese esa metáfora que que me había
13:20gustado, que es muy conceptual, como
13:21para cerrar el repasito de la primer
13:23clase
13:25de la oración formada por distintas
13:28palabras. están interactuando de alguna
13:31manera. Fíjense que con distintas
13:32palabras uno puede combinarlas de una
13:35forma o combinarlas de otra, combinarlas
13:37con otras palabras y formar diferentes
13:39oraciones. En este caso, cada una de
13:41estas proteínas estaría siendo una
13:42palabra, está combinándose con las otras
13:45de una manera tal que forma
13:48una oración que es una vía en en
13:54de un proceso celular. Por ejemplo,
13:56llegó esta molécula señal, hizo que se
13:59fosforile este receptor, hizo que
14:01entonces esta proteína venga y se pegue
14:03acá, que esta se active y fosforila esta
14:05otra y que pasen un montón de cosas y
14:07sigue y a lo mejor se modifica la
14:09expresión de genes, una proteína que
14:11estaba en un lugar va para el otro y así
14:13vamos a ir viendo ejemplos a lo largo de
14:15toda la materia.
14:17Y lo último para cerrar el repaso,
14:20habíamos visto que las proteínas podían
14:22tener además modificaciones
14:24postraduccionales, que eran
14:25modificaciones que justamente se hacían
14:28a las proteínas una vez después de haber
14:31sido traducidas. Y vimos un montón de
14:33ejemplos
14:35y habíamos visto que las distintas
14:37modificaciones podían ocurrir en
14:39aminoácidos en particular o en regiones
14:40en particular de la proteína. Y les
14:43conté el ejemplo de la ubicuitinación,
14:45que por ejemplo mandaba a degradar una
14:47proteína.
14:49Eh, la fosforilación,
14:51que les conté este ejemplo de la lámina
14:54nuclear, que cuando las proteínas que
14:56forman esa envoltura por adentro, que se
14:58llaman lamina, se fosforilan, se desarma
15:00y eso permite que ocurra la mitosis. O
15:04también les conté de otro ejemplo de
15:07fosforilación donde les dije que había
15:08un montón de vías de señalización que se
15:10basaban en que una proteína se fosforile
15:13y eso hacía que la reconozca otra y
15:15entonces eso activaba otra que lo van a
15:16ver mucho más en detalle más adelante. Y
15:20esta, por ejemplo, la el clivaje
15:22proteítico o que se formen los puentes
15:24de sulfuro, lo vimos en el ejemplo de la
15:27proinsulina transformándose en insulina
15:30y que recién repasábamos que justamente
15:34son tan importantes que hacen que la
15:35insulina sea funcional y fallas en la
15:39formación de los puentes de sulfuro, por
15:41ejemplo, porque haya mutaciones y que
15:43esas cisteínas estén reemplazadas por
15:45otro aminoácido o que las enzimas que
15:47hacen esos cortes no funcionen por algún
15:50motivo no estén, terminan haciendo que
15:52la proteína se pliegue mal, que no se
15:54pueda secretar, que de hecho se acumule
15:57la proinsulina y ahí donde se queda
15:58acumulada también hace cosas que le
16:00hacen mal a la célula y eso conduce a un
16:03tipo de diabetes.
16:06Y con eso terminamos el repasito.
16:08¿Estamos en sintonía?
16:12¿Quedó alguna duda?
16:12A mí me quedó una última duda.
16:15Ale, sí.
16:18cuando hablamos de dominio que dijimos
16:20que estaban conservados en la evolución.
16:23Sí.
16:25¿Qué quiere decir eso?
16:28Perfecto.
16:30Cuando decimos que algo está conservado
16:32en la evolución, quiere decir que uno se
16:35encuentra a lo mejor con no con eso
16:37idéntico, pero muy parecido en
16:39diferentes especies que surgieron en
16:42distintos momentos en la evolución. Yo
16:44les di, les mostré un ejemplo de eh un
16:47dominio conservado entre creo que era
16:50levadura y mosca. Era levadura, sí, mena
16:54que sí, una levadura y una mosca. Y era
16:58una proteína con la misma que tenía las
17:01mismas alfaélices en los distintos en el
17:04mismo lugar. A una le faltaban unos
17:05aminoácidos, pero esa es esos
17:08aminoácidos que le sobraban en la otra
17:10hacían como una especie de vueltita y no
17:13no le cambiaban significativamente la
17:15forma y con eso de tenía la misma forma
17:19que terminaba dándole eh la función a
17:23esa proteína que era un factor de
17:24transcripción y eso era el dominio unión
17:25al ADN. Entonces, que esté algo esté
17:28conservado en la evolución quiere decir
17:30que te lo encontrás en distintas
17:32especies relacionadas en la evolución,
17:34pero en distintos momentos y que lo más
17:36probable es que haya surgido, que tengan
17:39un ancestro común, que no es que haya
17:41surgido dos veces, sino que se hayan
17:44conservado. Y algo que se conservó
17:47indica, suele ser un indicio de algo con
17:51una función muy relevante, porque las
17:54cosas con funciones poco relevantes a
17:56veces no no se conservan a lo largo de
17:59la evolución porque se pueden perder y
18:02la célula anda igual.
18:04Pero bueno, esto estamos generalizando,
18:06por supuesto, siempre tenés casos
18:08particulares y también hay cosas que uno
18:10se las encuentra en dos organismos y
18:12resulta que
18:14son muy parecidas, pero que no vienen de
18:16un ancestro común y que surgieron dos
18:18veces. También hay esas cosas en
18:19biología, o sea, no se cierren a que
18:22todo viene del mismo lugar porque hay
18:24diferentes cosas, pero cuando uno dice
18:26algo conservado en la evolución, eso es
18:28como una evidencia fuerte de la
18:30importancia que tiene eso en este caso,
18:33esa ese dominio con esa forma y esa
18:36función.
18:38Le contesté, Marina.
18:39Sí, gracias.
18:41No, de nada.
18:41¿Puedo hacerte, perdón, una consulta
18:44sobre dominio también? Sí, obvio.
18:47E porque me surgió la duda cuando
18:49estabas explicando lo de las proteínas
18:51que están como asociadas a la membrana.
18:53Sí,
18:54el dominio siempre tiene que ver con la
18:55estructura más que nada y y o sea,
18:58existen, no hablamos de dominio cuando
19:01hay una proteína que tiene la misma
19:02función, pero otra estructura no.
19:06Bueno, una proteína con la misma
19:08función, pero es otra estructura. Por
19:09ejemplo, yo les dibujé, les mostré o
19:12apareció una un dibujito de una quinasa
19:15que les dije es una proteína que pone
19:17fosfatos, que hace la modificación
19:19postraduccional justamente de
19:20fosforilar, por ejemplo, si es una
19:22quinaa de proteína, fosforila proteína.
19:25Hay distintas quinazas, hay un montón y
19:29todas tienen un dominio con esa
19:31capacidad de ponerle un fosfato y a
19:34veces son distintos. A lo mejor tenemos
19:36familias de quinazas diferentes, pero
19:39todas tienen alguna parte parecida. Por
19:41ejemplo, no no vamos a entrar en detalle
19:43ahora cómo es que hace eso, pero lo
19:45vamos a ver la clase que viene cuando
19:46veamos enzimas, por ejemplo. Pero tiene
19:49que tener una parte donde va a agarrar,
19:51se están imaginando, algo de donde pueda
19:54sacar ese grupo fufato y tiene que tener
19:56otra parte que reconozca la proteína que
19:58se lo va a poner. Y entonces, si bien
20:01son distintas, tienen regiones que son
20:02conservadas. Entonces tenemos diferentes
20:05posibilidades, pero hay muy un alto
20:08grado de conservación de la forma porque
20:10eso tiene que ver con la función. Eso lo
20:12vamos a terminar de entender mejor la
20:14clase que viene.
20:16Dale, gracias.
20:17No, de nada.
20:18Profe, yo tengo una duda también.
20:21Sí.
20:22Cuando estás hablando de que la diabetes
20:24se genera por un fallo en el clivaje de
20:26la insulina, por una mutación, las
20:28mutaciones se supone que son hechos
20:30aislados, ¿no?
20:32Sí, pero
20:33entonces
20:34ah, ojo que no no es todas las diabetes,
20:36eso es esa puede ser una causa que
20:39conduzca, pero hay un montón de otras
20:42eh formas de va de otras causas.
20:46Claro. Perfecto. Mi duda sería que
20:48cuando muta una proteína, o sea, una
20:50insulina,
20:52¿cómo se generaría la enfermedad? O sea,
20:54grandes rasgos, porque bueno, imagino
20:55que es un tema que hay que estar
20:57bastante, saber bastante sobre el tema,
21:00pero cómo puede ser que a partir de una
21:02mutación se genere la diabetes, o sea,
21:04esa mutación induce a las demás
21:05mutaciones o ¿cómo pasa eso?
21:08En realidad está bueno porque yo lo dije
21:10un poco rápido y a lo mejor ustedes
21:12todavía les falta ir metiéndose más que
21:16lo van a lograr a medida que avance la
21:17materia, pero la mutación a la que yo me
21:20referí cuando dije, si cambio una
21:21cisteína por otro, una mutación que
21:23conduce un cambio de cisteína por otro
21:25aminoácido, no me referí a una mutación
21:27que ocurre a nivel de la proteína, sino
21:29que es algo que ocurre a nivel del ADN.
21:32O sea, si en el ADN está ocurriendo esa
21:35mutación, eso va a dar lugar a una RN
21:39que ya incluya esa mutación y eso va a
21:41dar lugar a una proteína que tenga un
21:43aminoácido en vez de en vez de tener una
21:46cisteína que iba ahí, otro aminoácido.
21:48Pero entonces solo eso va a importar o
21:51no importar, solo eso va a tener un
21:53efecto de impacte realmente en un
21:55organismo cuando eso está pasando a lo
21:58mejor en un en una célula o que están
22:01todas las células del cuerpo porque pasó
22:03en el cigoto o en el o en el embrión en
22:05un estadio muy temprano, pero en el ADN.
22:07Cuando hay una falla que la que una
22:09proteína se fabricó mal por un error
22:12durante la síntesis se puso una en vez
22:14de una cisteína se puso otra cosa, eso
22:16probablemente no sea tan grave.
22:18porque le pasó a una proteína y esa
22:21proteína a lo mejor se pliega mal y se
22:22degrada, pero no importa si todas las
22:24demás se están produciendo bien. No sé
22:26si te entendí si era esa tu pregunta.
22:28Sí, sí, era esa mi pregunta. Gracias.
22:30Perfecto. No, de
22:32profe,
22:33perdón.
22:34Eh,
22:36ah,
22:38eh, ah, perdón,
22:39alguien pregunta, pregunta.
22:41Eh, ah, perdón. Sí. Eh, yo soy la chica
22:44que preguntó lo de la insulina la voz la
22:46pasada que se me o sea se me hizo mal el
22:48micrófono y no podía activarlo. Te
22:50quería hacer otra pregunta.
22:52Sí.
22:53Eh, pero respecto a la ubiquitinación
22:56puede ser. Sí, obvio.
22:59Vaya tod, o sea,
23:01eh, ah, perdón,
23:02solo quiero avisar que vamos a ver bien
23:04todo el detalle de eh la degradación de
23:06proteínas y proteasoma eh la clase que
23:09viene, digo,
23:10ah, listo. Entonces, lo dejo para esa
23:12clase entonces la consulta.
23:14Esto solo se los adelanté como para
23:16mostrarles. Bueno, modificaciones
23:17postraaduccionales hay un montón y solo
23:19les quise dar algunos ejemplos como para
23:21que vean, wow, qué importantes que son,
23:24porque si le pasa esto se degrada. Pero
23:26después vamos a ver realmente cómo
23:27funciona y eso lo vemos la la próxima
23:29clase.
23:30Okay, listo. Genial. Entonces, no me
23:32guardo la pregunta.
23:33Perfecto. No, pues lo vas a entender
23:34mejor porque nos faltan algunos
23:35conceptos para que ustedes puedan
23:36terminar de entender bien cómo funciona.
23:39Genial. Genial. Gracias.
23:40No, de nada. Perdón, yo tenía una duda
23:43respecto de las modificaciones
23:44postpraduccionales.
23:46Sí. Eh, porque la clase pasada te habían
23:48preguntado y vos habías dicho que eran
23:50eh intencionales por parte de la célula
23:53para que pueda funcionar bien, pero yo
23:55tenía entendido que también eh por
23:57ejemplo en el caso de la acetilación y
23:59la metilación de histonas
24:01como que puede ser inducido por factores
24:03externos, por ejemplo, no sé, la
24:05exposición a la radiación o factores
24:07epigenéticos y que eso, por ejemplo,
24:09puede derivar en que en que se exprese
24:11un cáncer. puede ser o
24:13totalmente, o sea, ojo cuando usamos la
24:16palabra intencional que puede ser un
24:17pocoada
24:19para
24:20para el digamos para para este sistema
24:24celular, porque no hay una intención en
24:26la célula, pero sí eh lo que yo sí les
24:29dije es que son procesos completamente
24:31regulados y no son azarosos, no es que
24:33las cosas se están ubicutinando,
24:35metilando, acetilando porque sí, sino
24:37que hay en que hacen eso y que son
24:40superreuladas y que por algún motivo
24:42llegaron a ese lugar e hicieron esa
24:44modificación. Y lo que vos estás
24:46contando de acetilaciones o metilaciones
24:48que puedan ocurrir como consecuencia de
24:50estímulos ambientales es clarísimo y y
24:53eso justamente conduce a, por ejemplo,
24:57cambios en la expresión génica como
24:58consecuencia de eh de estímulos
25:01ambientales. Incluso hay cosas muy
25:03lindas que pero ahora es muy temprano en
25:06en la en la materia para que les para
25:09que lo puedan terminar de apreciar, pero
25:11lo podemos ver más adelante si quieren.
25:14Si quieren aprovechemos cuando les dé
25:15citoesqueleto, que ya van a estar
25:16recancheros y van a saber un montón de
25:18cosas y me hacen acordar y aunque no
25:20tenga que ver con citoesqueleto, lo
25:21podemos charlar un ratito si quieren,
25:23pero son lo que son epigenéticas
25:26y hay un montón de cosas que incluso no
25:28solo afectan a proteínas, sino también
25:30afectan a los ácidos nucleicos y eso
25:33regula mucho cómo se expresan los genes
25:36y principalmente los los cambios en
25:39tanto en el ADN como en las histonas que
25:42yo les di algunos ejemplos. nada más,
25:44pero hay algunas que son inducidas por
25:47eh señales ambientales y eso no quiere
25:49decir que que sean descontroladas. De
25:51hecho, viene de una señal que tiene toda
25:54una transucción de señal y que termina
25:56en ese en ese cambio y que termina
25:57cambiando la expresión génica y con una
25:59consecuencia
26:01para la
26:01Okay, claro. Gracias. Sí,
26:04por favor.
26:08Bueno, si no tienen más dudas,
26:10arrancamos, terminamos con el recap. Y
26:13arrancamos con la clase de hoy.
26:16Igual cualquier cosa, si van surgiendo
26:18las dudas, eh, me las pueden preguntar
26:20al final o por el medio o la próxima
26:23clase, no hay ningún problema. Bueno,
26:26otra vez el aviso para no
26:31para que no crean que los dibujitos los
26:32dice yo. Las imágenes sacadas del
26:35Alberts o del Watson, que son dos libros
26:38que tienen ahí en la bibliografía
26:40recomendada la materia y otras otros
26:42dibujitos que los hizo Lucas, que es mi
26:44hijo y que es biólogo también y docente.
26:48Entonces, ¿cómo podemos estudiar la
26:50estructura de las proteínas?
26:53Hay un montón de cosas, un montón de
26:54técnicas, por supuesto, no vamos a ver
26:56todas. Espero que lleguemos a ver todas
26:58las que tengo ganas de contarles hoy,
27:00que son las que necesitamos para la
27:02materia. Eh, pero
27:06eh las técnicas, hay distintas técnicas
27:09que no nos sirven para saber cuál es el
27:10peso molecular. Perdón, creo que acá lo
27:13puse PM y todavía no lo no habíamos
27:15definido la la abreviatura. PM
27:17espelecular
27:19o el número de subunidades que tiene una
27:21proteína o qué, cuáles son las uniones
27:24que están estabilizando las dónde está
27:27la proteína dentro de la célula, si está
27:28en el núcleo, si está en la membrana, si
27:30está en el citoplasma, está en otra
27:32organela.
27:34¿Qué le está pasando a una a una
27:35proteína dentro de células vivas? Se
27:37mueve para acá, se mueve para allá. Hay
27:39un montón, un montón de técnicas que
27:41podemos usar
27:43para contestar estas preguntas.
27:46Entonces, vamos a ir empezando desde lo
27:48más simple y vamos a ver si hoy llegamos
27:50hasta lo más complicado. Entonces, ¿cómo
27:53podemos estimar el peso molecular de un
27:56polipéptido?
27:59Volvamos un cachitín a conceptos eh que
28:03ya vimos
28:05y les voy empezando a tirar otros datos.
28:08O sea, una cosa que hasta ahora no
28:10habíamos hablado es cuánto pesa más o
28:13menos un aminoácido. Y acá dice peso
28:15molecular, el peso molecular promedio de
28:17un aminoácido es 128 Dalton. ¿Por qué
28:21dirá promedio? ¿Y por qué podemos dar el
28:23peso de un aminoácido si todas las
28:25cadenas laterales son diferentes? ¿Qué
28:27se les ocurre? ¿De dónde viene ese
28:29número?
28:32Y son, si tienes tanta cantidad de
28:34aminoácidos, los sumas todos y los
28:36dividís el promedio justamente.
28:39Bueno, no sabemos cuánto es
28:42cuánto cada molécula si tiene
28:46Perfecto. Ese cálculo que vos estás
28:47diciendo es simplemente promediar el
28:49peso de todos los aminoácidos. Está muy
28:51bien, eso podría ser una forma, pero
28:54esto se parece más a un valor que nos va
28:56a servir
28:58de verdad en la biología. ¿Qué se les
29:01ocurre
29:02además de esa cuenta que está perfecta?
29:06¿Se le puede agregar algún otro tipo de
29:07cosa?
29:13O sea, ya les adelanto, es un promedio
29:15del peso de los aminoácidos, pero tiene
29:18un valor más que le da más precisión al
29:21cálculo.
29:24Va la estimación. No
29:26puede ser que las fuerzas que
29:27interactúan cada una,
29:30¿no? Porque eso no te afecta el peso.
29:33Pero imagínense, se les ocurre que todo
29:37todos los aminoácidos están igual eh
29:42de igual de presentes en una proteína, o
29:45sea, que siempre hay, no sé, tanto si no
29:48sé, son 20 aminoácidos.
29:50Tal vez depende de la proteína que estén
29:51formando y la función de la misma
29:53proteína.
29:55Es verdad que hay proteínas que tienen
29:56una riqueza particular de unos
29:58aminoácidos y otras de otros, pero hay
30:00como una información, hay se sabe porque
30:03ya se se conocen la secuencia de todas
30:06las proteínas o de todas las proteínas
30:10conocidas. Eh,
30:13¿cuánto se usa cada aminoácidos? ¿Cuál
30:14es la la frecuencia de aparición
30:17promedio? O sea, en general la lanina
30:20aparece tantas veces, la cisteína
30:22aparece tantas otras. No sé, el
30:24triptofano aparece un poquito más o un
30:27poquito menos o no sé qué. Y entonces
30:30esa eh eh
30:32este valor de 128 Dalton no solo tiene
30:35en cuenta el peso molecular de cada
30:37aminoácido y dividido el valor, sino que
30:40además está multiplicado por un factor
30:42de cuánto se usa cada aminoácido en
30:44promedio, considerando las proteínas
30:47generales. Si después uno justo está
30:50calculando una proteína que es recontra
30:52rara, por ejemplo, una proteína que es
30:54todo glicinas, que se acuerdan que
30:56glicina era el aminoácido más
30:58chiquitito, probablemente entonces nos
31:01dé un valor bastante alejado del valor
31:04eh por del valor que calculemos, porque
31:08justo tiene un montón del aminoácido más
31:10chiquitito de todos. Pero si no, si uno
31:12no no está trabajando con una proteína
31:15recontra particular y rara en su uso de
31:18aminoácidos, más o menos puede tener una
31:20estimación. ¿Sí?
31:23Bueno, entonces tenemos que el peso
31:24molecular promedio de un aminoácido es
31:26este. Pero, ¿se acuerdan que cuando se
31:28unía un aminoácido con el otro para
31:30formar eh formando la unión peptídica se
31:33perdía una molécula de agua?
31:36Sí, se perdía justamente eh
31:40un grupo OH de un lado y un hidrógeno
31:43del otro y eso daba una molécula de
31:45agua. Entonces,
31:47el aminoácido que ya está incluido
31:49adentro de una proteína, en realidad en
31:52vez de pesar 128, le tendríamos que
31:54restar la molécula de agua que se pierde
31:56en cada unión. ¿Está bien?
31:59Entonces, el peso molecular promedio de
32:01un aminoácido ya metido en el
32:03polipéptido es 128 - 18, o sea, 110.
32:08Siempre es un estimado, ¿no?
32:11Y después tenemos que considerar cuántos
32:13aminoácidos tiene esa proteína. Por
32:15supuesto, si supiésemos cuál cuáles son
32:18todos los aminoácidos, directamente
32:20podríamos calcularlo más preciso, pero
32:22esto es un estimado sin necesidad de
32:24saber exactamente la secuencia, sino
32:26teniendo una idea de cuántos aminoácidos
32:28tiene. Entonces, si tenemos
32:32una una cadena poliptídica con un número
32:36tal de aminoácidos, n, la cantidad de
32:39enlaces que tiene son n - 1, ¿no?
32:43Porque, bueno, si esto fuese cíclico,
32:47eh,
32:49ahí tendríamos n, pero si no tenemos n -
32:511. Pero si es una proteína, un
32:55polipéptido que tiene un montón de
32:57aminoácidos, la verdad que decir n -1,
33:00decir n es casi lo mismo, como que no va
33:02a andar haciendo mucha diferencia. No sé
33:04si tiene 400 aminoácidos o 300
33:07aminoácidos, es decir, 299 para el
33:09cálculo. Entonces, lo que hacemos es,
33:12excepto que tengamos una un péptido
33:14chiquitito, si tenemos una proteína
33:17medio grande, no lo restamos, ¿está?
33:20Entonces, considerando estas dos cosas,
33:23el peso molecular promedio de un
33:24aminoácido ya metido dentro del
33:26polipéptido, o sea, restándole la
33:28molécula de agua que se va y que n - 1
33:32es casi n cuando tenemos muy alto.
33:34Entonces, considerando el número de
33:35aminoácidos y el peso molecular primo,
33:37directamente podemos estimarlo así.
33:40Estimar el peso molecular de un
33:42polipéptido multiplicando el hombro
33:43aminoáciaos por 110 Dalton. Y eso más o
33:47menos nos va a dar algo aproximado, que
33:49va a andar ahí bastante cerca, a menos
33:51que es una proteína rarísima con una
33:53composición de aminoácidos muy atípica.
33:57¿Está bien?
34:01Sí, profe.
34:02Eh, bárbaro. Bueno, entonces y ahora eso
34:05es el teórico. Yo les voy adelantando
34:08porque después no sé si ya van empezando
34:10a chusmear un poquito la guía de
34:12problemas de proteínas. Hay un montón de
34:14ejercicios que son así que te da, bueno,
34:16si tenés una proteína que tiene tantos
34:18aminoácidos, ¿qué peso molecular tiene?
34:20Ese es ese cálculo, ¿no? Hay una cosa
34:22mucho más rara. Sí. O para un lado o o
34:26para el otro, depende que tengamos de
34:27dato.
34:28Profe, a partir de cuántos aminoácidos
34:30se considerarían muchos.
34:34muchos para decir si le resto o no le
34:37resto,
34:37o sea, no hay una regla general, pero
34:40dado que estamos haciendo una
34:41estimación, si vos decís, "Bueno, ¿qué
34:43sé yo? Si tengo 10, se lo podes restar,
34:46¿no? Ahí te va a hacer una diferencia
34:47importante, pues una diferencia del 10%.
34:50Pero ya si tenés, no sé, 50 es como que
34:53no hay una regla general de cuándo le
34:56restas el uno o no, pero unos pocos, qué
34:58s yo, abajo de 30 uno lo podría llegar a
35:01restar y ya después medio que no te
35:03cambia mucho.
35:05Okay, perfecto. Es es
35:08bueno. Y entonces en el laboratorio,
35:10¿cómo podemos estimarlo? Y ahí es cuando
35:14les voy a presentar una técnica que se
35:17usa muchísimo muchísimo en el
35:18laboratorio,
35:20no solo para proteínas, sino para otras
35:24biomoléculas que ahora les voy a contar
35:26y que se llama electroforesis.
35:30Eh, y entonces vamos a definir qué es la
35:33electroforesis.
35:35No sé si ya conocen algo, en algún
35:37momento vieron en el CBC o en el
35:39secundario, les suena,
35:43¿no? Es cuando se le pasa como
35:44electricidad a placas y que se va
35:46corriendo y se va corriendo la como de
35:50acuerdo al peso que tiene cada muestra
35:52en cada fila se va corriendo y ahí
35:55determinaje el peso molecular.
35:57Exactamente. Viene por ahí. Perfecto.
36:00Así que, pero eso es medio el final. Así
36:02que antes de llegar a eso, que es eh que
36:06es lo que vos contaste, les voy a ir
36:08contando cómo funciona. Entonces, la
36:10electroforesis, que vamos a tener un TP,
36:12espero que podamos tener el TP. Eh,
36:17la electroforesis es el movimiento de
36:19partículas cargadas
36:22cuando son sometidas en a un en un a un
36:24campo eléctrico. O sea, acá está en este
36:27dibujito estamos representando que
36:28tenemos un montón de partículas que cada
36:30una tiene una carga y las voy a meter
36:34dentro de un campo eléctrico. Y
36:35entonces, ¿cómo se van a mover?
36:38Perdón, ¿cómo se van a mover? Se van a
36:40mover porque van a ser atraídas por el
36:42polo opuesto a su carga. Sí, ese es un
36:45concepto bastante intuitivo que
36:46seguramente me van siguiendo.
36:49Pero entonces, ¿qué electroforesis de
36:51qué moléculas podemos hacer? En el
36:54laboratorio se hacen electroforesis de
36:56ADN, ARN y proteínas. Sí, se usan
37:00distintos sistemas, distintos aparatos,
37:03distintas cosas donde se arma la
37:04electroforisis, pero todas tienen el
37:06mismo principio. Así que yo ahora les
37:07voy a explicar el principio general que
37:10funciona para cualquier electrforesis y
37:12después nos vamos a meter más en detalle
37:13en cómo es una electroforis de proteína,
37:16porque la electroforesis de ácido
37:17nucleico las van a ver en TP. Pero
37:19entonces acá tenemos representado una un
37:21ADN, una RN y una proteína.
37:27El TP es eh el trabajo práctico número
37:30tres que es electroforesis en geles de
37:31agarrosa, donde vamos a hacer
37:32electroforesis de ADN.
37:36Paren que me queda, no veo la pantalla.
37:38Ahí está, me queda la barra por
37:40cualquier lado. Entonces, sometemos las
37:43moléculas a un campo eléctrico. Como
37:45tienen carga, van a ser atraídas por el
37:46polo de carga opuesta. es lo que ya les
37:48había contado.
37:50Y para que esto pueda funcionar y las
37:52cosas se separen bien y no difundan
37:54todos para cualquier lado, no se hace en
37:57agua no más o en una solución eh
38:01líquida, sino que se usan matrices
38:03porosas que se llaman geles, que son
38:06como una gelatina que hacen que haya
38:10mayor resistencia a ese movimiento y
38:12entonces eso nos permite que se separen
38:13mejor porque si no es como que irían
38:15todas rapidísimo y no se llega a separar
38:18nada. Acá al tener una matriz que le va
38:20ofreciendo resistencia, ahora vamos a
38:22ver cómo es, cómo son los principios y
38:24por qué vamos a poder separarlas. Pero
38:26entonces acá hay un un dibujito super
38:28esquemático, como si fuesen un gel donde
38:31vamos a hacer una electroforis para
38:33proteínas y nos muestra que vamos a
38:36tener de un lado el polo negativo, del
38:38otro lado el polo positivo y ahora más
38:40adelante vamos a ir viendo cómo es que
38:41vamos a poner nuestras proteínas y se
38:43van a separar.
38:45Pero lo que pasa, el principio por el
38:47cual se separan es que
38:51a las partículas más grandes eh se van a
38:54ir quedando más trabadas en esa en esa
38:58malla. Imagínense así como una red y
39:01tenemos pelotitas de distintos tamaños
39:03que van a ir van a ir migrando. Migrar
39:06es el término que se usa en la jerga,
39:09¿sí? es el término apropiado. Uno dice
39:11que migran y las más chiquitas van a
39:13poder migrar más fácil porque no se
39:15quedan tan trabadas en esa red y las más
39:18grandes se van a ir quedando más
39:19trabadas. De hecho, uno va a armar una
39:21red más o menos apretada acá
39:26según qué es lo que quiera separar. Si
39:27uno quiere separar como si fuesen eh
39:30pelotitas, no sé,
39:33pelotitas de de ping pón, uno quiere
39:36separar pelotitas de ping pong una
39:38pelota de vley, no puede usar un colador
39:41eh de la cocina. ¿Se dan cuenta? Un
39:44colador, no sé, con el que cuelan un
39:47mate cocido, porque las dos, tanto la
39:49pelotita de ping pong como la pelota de
39:51bola y se le va a quedar trabada.
39:53van a tener que usar a lo mejor una red
39:55tipo como tamaño red de tenis o tamaño
39:58eh me siguen o si quiero separar
40:02eh una una
40:06pelotita. Vamos con de vuelta una
40:07pelotita de ping pong de una bolita de
40:10esas que no sé si las conocen las
40:11bolitas con las que jugaban antes.
40:14Las conocen las bolitas de esas de
40:16vidrio chiquititas.
40:19Las canicas.
40:20Las canicas.
40:21Las canicas. Bueno, en mi época se
40:22llamaban bolitas, pero si estas
40:24chiquititas así tampoco voy a usar una
40:26red de voley porque van a pasar las dos
40:28a la vez, aunque haya mucha diferencia
40:30de tamaño, a las dos le va a dar lo
40:32mismo esa malla tan abierta. ¿Me siguen?
40:35Entonces voy a tener que elegir un
40:38tamaño de poro, una malla más o menos
40:41apretada, dependiendo el tamaño de lo
40:44que yo quiera separar entre sí.
40:47¿Está?
40:49Entonces,
40:52¿qué es lo que va a definir? ¿Cómo se
40:54mueven las partículas esas cargadas que
40:56yo quiero separar? Dos fuerzas opuestas
40:59van a determinar con qué velocidad
41:00vayan. Esta es la partícula que yo tengo
41:03que estar cargada y entonces va a ser
41:06atraída por el la fuerza eléctrica, o
41:08sea, va a ir hacia el polo opuesto a su
41:10carga, atraída por la fuerza eléctrica
41:12generada por ese campo eléctrico. Sí,
41:16esta se está moviendo hacia allá que me
41:18dice cuál es el sentido de
41:18desplazamiento. Y siempre que hay algo
41:21desplazándose en algún ambiente eh en
41:25que no sea ideal, tenemos una fuerza de
41:28rozamiento que se opone al movimiento.
41:30¿Se acuerdan eso? ¿Lo vieron en física
41:31del CBC? ¿Les suena la fuerza de
41:33rozamiento?
41:35Sí. Sí.
41:36Bien.
41:37Sí.
41:38Y entonces la fuerza de rozamiento va a
41:40ir para el otro lado y esto es lo que va
41:42a ir retrasando el movimiento de la
41:44partícula. Y de hecho, gracias a esa
41:46fuerza de rozamiento es lo que voy a
41:47poder separar unas de otras, las más
41:50grandes de las más chicas. Y y ahora
41:52vamos a ver, no solo es un tema de
41:53tamaño, sino de otras cosas más. Pero
41:55entonces la fuerza de rozamiento se
41:56opone al movimiento y depende de varias
41:59cosas, depende de cuál sea el medio.
42:01Vieron que yo les dije, si lo hacemos en
42:03como si fuese en líquido, en agüita
42:06sola, esto no va a servir porque van a
42:08ir todas muy rápidos porque tenemos poco
42:10rozamiento. En cambio, si lo hacemos en
42:11un gel, ahí podemos elegir un gel medio
42:15flojito o un gel más apretado y eso va a
42:17cambiar la fuerza de rozamiento.
42:20también de la forma de la partícula que
42:22esté
42:24moviéndose, si es una partícula que
42:26tiene una forma muy complicada, medio
42:28con cosas saliendo, se va a quedar más
42:30enganchada en esa trama que si es una
42:33partícula con una forma que lo deja
42:35migrar sin engancharse con nada. y el
42:38tamaño de la partícula, que es bueno,
42:39las más grandes le va a costar más que a
42:41las más chicas, como lo que veníamos
42:42hablando. Entonces, las partículas se
42:45van a separar según la carga que tengan,
42:48la forma y el tamaño. ¿Sí?
42:52Entonces,
42:55eh, ¿se acuerdan esto? Vamos despacito.
42:57Fuerza igual masa por aceleración.
42:59Volvemos a física del CBC por un
43:01instante. Muy cortito, no es que los voy
43:03a tener con ecuaciones todo el día, pero
43:05pensemos un un instante. La fuerza
43:08fuerza igual por masa por aceleración
43:10igual masa por aceleración, ¿se
43:12acuerdan? No. Entonces despejemos la
43:14aceleración para ver cómo se va a
43:16acelerar nuestra partícula y es igual a
43:20fuerza sobre masa. Estamos, simplemente
43:22estoy despejando.
43:25Entonces, la sabemos que la fuerza
43:28eléctrica con la que se va la fuerza
43:30eléctrica, que es la que va a determinar
43:32el movimiento de una partícula, va a ser
43:34proporcional, este simbolito quiere
43:36decir proporcional a la carga que tenga
43:38esa partícula. Sí, si tenemos una
43:40partícula muy con mucha carga, va a ser
43:42atraída con más fuerza que una que tenga
43:44mucho menos. Eso es bastante intuitivo.
43:47Entonces, ahora reemplazando acá fuerza
43:50por carga, podemos decir que la
43:52aceleración que va a tener una partícula
43:55va es proporcional. Acá les les agregué
43:58por las dudas si alguno no conocía el
43:59símbolo proporcional.
44:01La aceleración es proporcional a la
44:04relación carga masa. ¿Sí? Fíjense que se
44:07que es bastante intuitivo porque es se
44:10va a acelerar más cuanta más carga
44:12tenga, pero si es tiene mucha masa se va
44:16a acelerar menos, entonces la masa está
44:17en el denominador. ¿Está bien?
44:19Entonces la carga, profe, es igual que
44:21decir la fuerza eléctrica.
44:23Claro, en realidad no es que es igual
44:26porque estamos hablando de magnitudes
44:27distintas, pero es proporcional. Cuanto
44:30más carga tenga la partícula, mayor va a
44:31ser la fuerza eléctrica con que esa
44:33partícula sea atraída hacia el polo
44:36opuesto a su carga.
44:38¿Está bien?
44:38Okay. Y esa carga, como la
44:41esa carga es la carga que tenga la
44:43partícula, que ahora vamos a ver qué
44:45carga tienen las partículas que nosotros
44:46queremos parar porque tenemos distintos
44:48casos. Sí. Pero lo que yo quiero que les
44:51quede bien claro es de dónde salió este
44:56cociente carga masa. Igual estas diapos
44:58las van a tener. Sí.
44:59Pero es simplemente el despeje de esto,
45:02pero porque ahora vamos a estar siempre
45:04hablando de la relación carga masa. Nos
45:06va a importar porque eso es lo que va a
45:08definir cuánto se va a acelerar una
45:09partícula
45:13dependiendo de esta relación, porque a
45:15lo mejor puede pasar que aumento la
45:16carga, pero aumento la masa en la misma
45:18proporción y la aceleración es igual.
45:20¿Sí?
45:23Entonces, dejemos esto acá y pensemos
45:26para cada tipo de molécula que vamos que
45:28que queremos separar por electroforesis,
45:31¿qué pasa con todo lo que habíamos dicho
45:33que estaba afectando su su movimiento?
45:37La forma, el tamaño y la relación carga
45:40más.
45:42¿Cómo es para el ADN y el AN la forma?
45:46Bueno, los fragmentos de ADN, si tenemos
45:49un fragmento de ADN lineal, la forma es
45:52lineal. Entonces,
45:54para un fragmento, vamos a ver que la
45:58forma, si tenemos fragmentos de
46:00distintos tamaños, todos tienen la misma
46:02forma. En el TP, acá les les hago esta
46:05aclaración, en el TP van a ver que que
46:07podemos tener ADNs que tienen otras
46:08formas, por ejemplo, que sean
46:10circulares, que sean como un bollito,
46:13¿sí? que son los plásmidos, que pueden
46:15tener distintas conformaciones y eso,
46:16pero todo lo van a ver en el TP, pero
46:19ahí la forma importa. En cambio, en este
46:22caso, si tenemos solo fragmentos de ADN
46:23lineales, van a ese ese esa variable
46:28forma es como que no la tenemos que
46:29tener en cuenta porque son si son todos
46:31iguales.
46:34Ahora, el ARN,
46:36en realidad
46:38uno piensa en una RN lineal, pero
46:40normalmente cuando el RN es una molécula
46:42simple, si es una molécula simple
46:44cadena, las bases cuando quedan
46:46expuestas tienden a pararse las bases
46:48que son complementarias, ¿no? como pasa
46:50con el apareamiento Watson y Crick en el
46:52ADN. No sé si me van siguiendo.
46:55Entonces, si uno tiene RN, puede llegar
46:57a tener estas estructuras que llama
46:59estructura secundaria, como que se
47:00pliega de alguna manera en el espacio.
47:03Uno si quiere separar a RN solo por
47:07tamaño, que es lo que habitualmente
47:09cuando uno corre un gel, una
47:11electroforesis de ARN, los quiere
47:12separar por tamaño, tiene que hacer algo
47:15para que todos tengan la misma forma,
47:16porque si no va a estar interfiriendo
47:18las formas raras que puedan tener.
47:20Entonces uno hace cosas para
47:23plancharlas. Se se le dice planchar. De
47:25hecho, en la jerga se suele decir
47:27planchar, pero es eh desnaturalizarlos o
47:32quitar esa estructura secundaria para
47:33que todos queden lineales. ¿Sí?
47:38Y entonces ahora dentro de un ratito
47:40vamos a las a las proteínas, eh, porque
47:43las proteínas están un poquito más
47:44difíciles, pero primero terminemos de
47:46entender ácidos nucleicos.
47:48Ahora entonces pensemos en el cociente
47:51carga masa. ¿Cómo de dónde viene la
47:53carga de los ácidos nucleicos? del grupo
47:56fosfato, que cada nucleótido tiene un
47:58grupo fosfato, no sé si se acuerdan,
48:00pero que tiene una carga negativa.
48:02Entonces,
48:04cada ácido nucleico, ya sea una RN o una
48:06DN, va a tener una carga negativa por
48:10cada nucleótido que tenga.
48:12Entonces, fíjense lo que pasa. El
48:14cociente carga masa
48:17es constante porque a medida que se pone
48:20más larga esta molécula,
48:23¿me siguen? A medida que se va poniendo
48:25más larga, aumenta la carga, pero
48:26también aumenta la masa exactamente en
48:28la misma proporción.
48:30Entonces este cociente carga es
48:33constante, con lo cual si todas las
48:36moléculas me quedó si todas las
48:39moléculas
48:41tienen la misma forma porque son todas
48:43lineales, porque yo hice algo para que
48:44sean todas lineales
48:47y todas tienen la misma relación
48:49cargamasa, ahí se separan por tamaño. Y
48:52eso es lo que uno a veces quiere hacer,
48:55otras veces quiere separar por forma,
48:57pero si uno realmente quiere usar una
48:59electroforis para averiguar el tamaño,
49:02se tiene que asegurar de que todas
49:04tengan la misma forma. Y en el caso de
49:06los ácidos nucleicos, la relación carga
49:08masa es igual independientemente del
49:10tamaño que tengan. Y entonces se van a
49:13separar por tamaño y va a pasar esto que
49:15ya les conté antes, que las más grandes
49:16se van a retrasar más porque son las que
49:19les va a ir costando más atravesar esa
49:22red, esa malla que es el gel. En el caso
49:25de ácidos nucleicos, habitualmente son
49:27geles de agaros. ¿Está bien?
49:33Eh, profe, una consulta sobre qué había
49:35dicho bien de la cara y de la masa que
49:37crecen exponencialmente, dijo.
49:39Sí,
49:40claro que la relación esta carga masa
49:44para esta molécula que es cortita es
49:47igual que para esta otra que es más
49:49larga. ¿Por qué? Porque fíjate, esta
49:50molécula, imagínate que tiene 1 2 3 cu
49:55pares de base, ¿no? Entonces va a tener
49:59la cantidad de cargas negativas que le
50:00dio cada grupo fosfato de cada
50:03nucleótido y la masa de cuatro pares de
50:05base. Y esta tiene 1 2 3 4 5 6 7 8 9.
50:10Ponele, tiene casi el doble de carga,
50:12pero también tiene casi el doble de
50:13masa. Entonces esto se mantiene
50:16constante.
50:18Okay. Okay.
50:19A ver.
50:20Sí,
50:21perfecto.
50:22Pero para las proteínas ahí tenemos otra
50:25historia. ¿Quién le da las cargas? La
50:28carga a las proteínas.
50:30La cadena R.
50:32¿Cómo?
50:33La cadena va depende en realidad. Claro.
50:36Claro. La la cadena lateral de los
50:38distintos aminoácidos. Exacto. O sea, si
50:40una proteína no tiene ningún aminoácido
50:43que tenga carga, eso sería muy raro. No
50:46tiene carga. O sea, pero si una proteína
50:49tiene muchos aminoácidos positivos o
50:51muchos aminoácidos negativos o igual
50:54cantidad de cada uno, qué sé yo, eso va
50:56a cambiar qué carga tiene. ¿Me siguen?
51:00Entonces acá la relación cargamasa ya no
51:04es eh como como estamos pensando antes
51:07por como para los ácidos nucleicos,
51:10porque para los ácidos nucleicos era
51:11siempre se laada el nucleótido y el
51:13nucleótido tiene un grupo fosfato y
51:14listo, independientemente de cómo sea su
51:17composición nucleotídica y entonces
51:21se mantiene constante. Pero entonces de
51:23acá la forma, bueno, el tamaño por
51:26supuesto va a depender de la cantidad de
51:27aminoácidos que tenga. La forma va a
51:29depender de su estructura tridimensional
51:32y puede llegar a ser una proteína
51:34esférica, puede ser una proteína con
51:36varios dominios y chichones, puede tener
51:38una forma con que no puedo no no tener
51:41idea y la relación carga masa va a
51:43depender de la composición de
51:45aminoácidos que tenga. Entonces, esto
51:48todo esto depende de los aminoácidos y
51:50de la estructura tridimensional.
51:53Entonces, ahora sí les presento que para
51:56la electroforesis de proteínas tenemos
51:59dos posibilidades, dos grandes grupos de
52:01electroforesis,
52:05una que se llama electroforesis nativa,
52:08donde yo mantengo a las proteínas con
52:11esa forma que tienen. ¿Sí?
52:14Y entonces digo, bueno, ahora no las voy
52:16a poner todas lineales ni nada, las dejo
52:17así y vamos a ver qué información me da
52:21ese ese esa electroforesis y la vamos a
52:25ver dentro de un rato. Y la otra es con
52:29proteínas a las que le hago un
52:30tratamiento tal que les afecto la
52:33estructura y las dejo a todas lineales.
52:36Y ahora vamos a ver qué trucos hacemos
52:39porque voy a querer que todas corran
52:42solamente por su tamaño. Entonces tengo
52:44que hacer algunos trucos para
52:47homogeneizarle a todas la forma y la
52:50relación cargamasa
52:52para que puedan correr solo por tamaño.
52:55¿Me siguen hasta acá?
52:57Sí, profe, una pregunta. Pero la que es
53:01electroféricis nativa, o sea, si yo no
53:03le cambio nada, ¿no? O sea, me da algún
53:06tipo de información porque sin yo no
53:08tengo control de ningún dato.
53:11No,
53:12está muy buena tu pregunta. ¿Te da algún
53:14tipo de información?
53:16Eh, solo que no te va a dar información
53:18sobre el tamaño directamente, pero te
53:21puede dar un tipo de información y vos
53:22podés hacer distintas cosas, podés
53:24cambiar algunas cosas, pero eso lo vemos
53:27después de ver esta esta otra. Ahora en
53:29un ratito.
53:29Okay. Así es.
53:31Ho.
53:36Entonces, si queremos separar a las
53:38proteínas por su peso molecular, hay que
53:41darles a todas la misma forma y la misma
53:43relación cargamasa. Sí, esta la vemos
53:46dentro de un rato. Vamos con esta.
53:50La verdad es que podemos planchar a las
53:52proteínas. ¿Vieron que yo les dije? Una
53:54proteína tiene que tener su estructura
53:55tridimensional para que sea funcional.
53:57Bueno, si yo la quiero estudiar en el
53:59laboratorio, puedo hacerle cosas
54:00terribles
54:02y eh plancharla completamente. Por
54:06supuesto, esa proteína no va a ser
54:07funcional, pero sí me sirve a mí para
54:09poder estudiarla.
54:11Y entonces eh es algo que hacemos en el
54:14laboratorio. Hay diferentes cosas que
54:16uno le puede hacer, pero en general uno
54:18le hace algún tratamiento que hay
54:20agentes físicos o químicos que lo que
54:23hacen es justamente desarmar esas
54:24uniones
54:26que mantenían esta estabilizada esta
54:29esta estructura. ¿Se acuerdan que eran
54:30uniones entre las cadenas laterales y
54:32podíamos tener uniones débiles
54:36formadas por los distintos ser
54:37interactuando entre sí, como uniones
54:39iónicas, eh fuerzas de banderbal,
54:41distintas eh interacciones hidrofóbicas,
54:44lo que sea, pero también podíamos tener
54:46puentes de insulfuro, que son uniones
54:47covalentes. Entonces, hay distintos
54:49trucos para romper las diferentes
54:51uniones y si yo logro romper todas esas
54:54esas uniones que mantienen a la proteína
54:58en una estructura tridimensional, pero
55:00no romper la unión peptídica, o sea, no
55:02desarmarla en aminoácidos, ahí puedo
55:05llegar a tener la proteína lineal y
55:08hacer un electroforesis que me permita
55:11separarla por tamaño, si además le hago
55:14que el cociente carga masa sea igual
55:16para todas.
55:18Entonces, con estos triangulitos
55:19amarillos, yo quise representar acá la
55:22urea, que es esta molécula muy
55:23chiquitita, que entonces si uno tiene
55:25una solución, imaginemos que tenemos a
55:27la proteína en un tubito y la ponemos en
55:29un le agregamos esta molécula urea a la
55:32solución, es muy chiquitita, se puede
55:34meter por todos lados y tiene capacidad
55:37de formar puente de hidrógeno.
55:41Y y como pongo una cantidad enorme,
55:44compite un montón
55:46con los átomos que están formando puente
55:49de hidrógeno,
55:50los que vienen de las cadenas laterales
55:52de aminoácidos que estaban interactuando
55:54entre sí y formando esa estructura
55:56tridimensional y termina desarmándolos.
55:59¿Se acuerdan? No. ¿Cómo funciona las
56:01uniones débiles, las uniones que no son
56:03covalentes,
56:05eh, no están todo el tiempo todo el
56:08tiempo unidas. Tenemos en eh en en la
56:13jerga les decimos que las uniones
56:15respiran, que es como que se están
56:17uniendo y se desarman un poquito, se
56:19unen y se desarman, se unen y se
56:21desarman, ¿no? Porque
56:24no estamos a 0 grados y entonces hay
56:26energía, los átomos vibran y esas
56:28uniones están eh como uniéndose,
56:32armándose y desarmándose
56:33permanentemente. Si yo ahora de repente
56:35le meto un montón de moléculas
56:37chiquititas, en ese instante en que se
56:39desarmó, tup, se metió una de estas
56:41moléculas que puse millones y está
56:43compitiendo con el otro, con el
56:45aminoácido que iba a venir de vuelta.
56:47Entonces, de esa manera yo logro
56:48desarmar
56:50las uniones porque pongo una molécula
56:52que compite en eh me siguen. Esto se
56:56basa justamente este concepto de que las
56:58moléculas respira es algo fundamental
57:00que lo vamos a ir diciendo
57:02a lo largo de toda la materia. Me
57:04siguieron hasta ahí.
57:07Sí, sí. Perfecto.
57:08Profe, ¿podés repetir que no, o sea, no
57:12entendí
57:14que qué hay que hacer?
57:16Bueno, en realidad todavía no les conté
57:17cómo se hace. Solo les dije que si uno
57:19mete una molécula que tiene la capacidad
57:22de formar puentes de hidrógeno,
57:24creo que con el próximo dibujito se van
57:26a ir dando cuenta más. Bueno, no, el
57:27otro ya
57:29cuenta otra cosa. Est, les voy a
57:31explicar cómo cada una de estas
57:33moléculas nos va a permitir desarmar la
57:35estructura tridimensional de la
57:36proteína. Esta molécula chiquita nos va
57:39a permitir desarmar las uniones puente
57:40hidrógeno porque compite. Ella misma
57:43puede formar puente hidrógeno y entonces
57:45como pongo un montón en el instante en
57:47que las uñones están respirando, se
57:50mete, compite y desarmó las uniones. El
57:53calor
57:55eh uno puede hervir la solución y
57:58entonces le está dando un montón de
58:00calor. Con eso entrega tanta energía que
58:02se desarman todas las uniones. Y esto es
58:04un detergente fuerte que tiene todo,
58:06como todo detergente, tiene toda una
58:08parte que es esta parte no polar.
58:10Fíjense todos estos carbonos es una
58:12parte no polar y acá en este caso es un
58:14detergente iónico que tiene una parte
58:17iónica directamente. Entonces esto se va
58:20a meter en las partes de la proteína que
58:22son no polares. ¿Sí? Y esto va a
58:24interactuar con las partes hidrofílicas.
58:28Y entonces cuando yo trato con calor y
58:31con SD este, perdón, este esta molécula
58:34se llama es un detergente fuerte que se
58:36llama sodio dodil sulfato SDS, que se
58:39usa un montón. Van a ver en el labo que
58:41aparece en un montón de protocolos, se
58:43usa muchísimo.
58:45Pero entonces si yo
58:48le pongo SDS, lo que va a pasar es que
58:53toda esta parte acá está representada de
58:56esta manera. se representan estas colas
58:58así de carbono, de carbono, la parte
59:00hidrofóbica y acá está la parte iónica.
59:03Entonces, todo esto va a interactuar con
59:05la con las partes hidrofóbicas y va
59:08entre la entre el calor o la urea, no se
59:11pone todo, de hecho, no se suele usar
59:13todo junto, va o calor o urea, se suele
59:16urea, no se suele poner en general en la
59:18mayoría, pero también es algo que se
59:19puede usar a veces, pero si uno pone
59:21calor ys
59:24va a desarmar todas las uniones débiles.
59:26Sí, por competencia, porque pongo un
59:28montón de SDS y pongo un montón.
59:32No, afuera. Necesitas la llave.
59:37Ah, perdón, creo que no me hablabas a
59:39mí. Bueno, entonces el SD se
59:41desnaturaliza la proteína
59:44y además la cubre toda a lo largo de
59:47carga negativa porque tiene esta parte
59:50iónica. ¿Sí? Y entonces,
59:53¿qué pasa con esto? la cubre tanto,
59:56tanto, tanto de carga negativa que ya si
59:59acá había algún aminoácido positivo o
1:00:02uno negativo por acá o varios positivos
1:00:04por acá, quedan enmascarados con esta
1:00:06gran enorme cantidad de SDS. Entonces,
1:00:10lo que hace es dejar a toda la molécula,
1:00:13además de eh planchada, o sea, en forma
1:00:16lineal, toda cubierta de carga negativa
1:00:20de manera proporcional a su tamaño. Si
1:00:22tengo una molécula más chica, va a
1:00:24quedar cubierta con carga negativa en un
1:00:27tamaño, en su tamaño. Si tengo una más
1:00:29grande, va a quedar toda cubierta.
1:00:30Entonces, ¿qué le a qué le suena esto?
1:00:33¿Qué pasa con la relación carga más?
1:00:35Ahora
1:00:37queda constante.
1:00:39Exacto. Ya sé que tengo una molécula más
1:00:41larga que otra, la relación carga es
1:00:43constante porque le puse tanta cantidad
1:00:45de CDS que se hacen despreciables
1:00:48las cargas propias que tenía la
1:00:50proteína. Entonces, si yo quería
1:00:53averiguar qué carga tenía la proteína,
1:00:55no me sirve hacer esto. Sí. Y ahí se van
1:00:58dando un poco de cuenta para qué voy a
1:01:00querer un gel nativo. Pero si no me
1:01:02importa qué carga tenía la proteína y yo
1:01:04quiero saber solo su tamaño, uso SDS.
1:01:08Sí.
1:01:09Pero además me falta romper los puentes
1:01:11de sulfuro, porque si la proteína tenía
1:01:13puentes de sulfuro, yo con el calor y
1:01:15con el SDS no los no los desarmé. ¿Se
1:01:18acuerdan que estas eran unas uniones
1:01:19covalentes? Sí. Pero hay una forma de
1:01:22desarmarlas y es poner una molécula que
1:01:25es esta que se llama betamercaptoetanol.
1:01:28Sí, acá está. Este es el
1:01:30betercaptotanol, que fíjense que es una
1:01:32molécula también muy chiquitita que se
1:01:34puede puedo poner un montón y se mete
1:01:36todo por ahí y que tiene un grupo
1:01:39sulfidrilo y si pongo tanta cantidad,
1:01:41tanta cantidad, termina compitiendo y
1:01:45desarmando esta esta unión y él mismo
1:01:48uniéndose a cada uno de estos eh
1:01:53grupos sulfidrilo, con su propio grupo
1:01:55sulfidrilo y entonces desarmando
1:01:59la unión covalente. Entonces, así se
1:02:01llama que vieron esto que ya se los
1:02:04había mostrado antes, yo puedo lograr
1:02:07desarmar los puentes de insulfuro.
1:02:10Sí, que en la jerga se dice como que
1:02:14reduce a los puentes de insulfuro, pero
1:02:16en realidad lo que está haciendo es él
1:02:18mismo unirse, ¿si? Y dejar desarmado.
1:02:22Y entonces si había algo unido así se
1:02:24suelta. Entonces, si esta estaba unida
1:02:27esta a través de este puente, al poner
1:02:30Betamer Capto, las desarmé. ¿Está bien?
1:02:36Bueno, supongo que está bien.
1:02:39Sí, sí.
1:02:40Genial. Entonces, si combinamos ese de
1:02:43ese que era el detergente este y la
1:02:45cubría toda negativamente, calor que me
1:02:48rompe
1:02:50todas las uniones débiles porque entrega
1:02:51un montón de energía y todo se empieza a
1:02:53desarmar. y beta mercato etanol que se
1:02:55lo van a encontrar abreviado, como creo
1:02:58que acá se los escribí de las dos
1:02:59formas, BSH por el grupo sulfidrilo o
1:03:03BME por betam mercato etanol. Lo van a
1:03:06encontrar de las dos formas según donde
1:03:07lo lean en castellano o se escribe así
1:03:10en inglés.
1:03:12Si ponemos SDS, calor y
1:03:15betamercaptotanol, podemos desarmar
1:03:16todas las uniones, tanto las no
1:03:18covalentes con SDS y calor como los
1:03:21puentes de sulfuro con el betamercapto y
1:03:23además lograr un una relación carga masa
1:03:27constante. Entonces las dejé a todas con
1:03:30la misma forma y la misma relación carga
1:03:32más
1:03:34y entonces van a correr solamente por
1:03:37tamaño. Y por supuesto, otra vez,
1:03:39recordemos que las más grandes se van a
1:03:41retrasar más, ¿está?
1:03:44Entonces, en ese caso, lo que voy a
1:03:46hacer es un gel,
1:03:49que el gel está en la malla con la que
1:03:52armo el gel. ¿Se acuerdan que les dije
1:03:54que para el para los geles de ácidos
1:03:56nucleicos usábamos a Garosa, es un tipo
1:04:00de gel, o sea, un tipo de molécula que
1:04:02se usa para formar eh
1:04:05unas mallas particulares que son útiles
1:04:07para separar ácidos nucleicos. Para
1:04:09separar proteínas se usa otro tipo de de
1:04:12moléculas que se llama poliacrilamida.
1:04:15Entonces,
1:04:17un gel de poliacrilamida,
1:04:20una electroforesis en gel de
1:04:21poliacrilamida
1:04:23se escribe así en inglés,
1:04:27poliacrilamida,
1:04:30poliacrilamida,
1:04:31gel electroforesis. Y aparte si se le
1:04:34agrega el SD acá delante, quiere decir
1:04:37que es un gel que va a ser en
1:04:39condiciones desnaturalizantes. Sí, se
1:04:42llama condiciones desnaturalizantes
1:04:43cuando rompí todas las uniones y no
1:04:45tengo la forma en contraposición con un
1:04:48gel nativo. O sea, si ustedes se
1:04:50encuentran con que dicen, "Esto es un
1:04:51SDS page", quiere decir que no es un gel
1:04:55nativo. Es un gel donde yo no voy a
1:04:57enterarme cuál es la carga neta de la
1:04:59proteína porque se la enmascaré toda con
1:05:01SDS. No voy a saber qué forma tiene
1:05:04porque la planché toda con el SDS y el
1:05:06calor. Y voy a elegir si le pongo o no
1:05:09le pongo beta merca capt averiguar qué
1:05:11pasa con el tema de si quiero averiguar
1:05:13si hay puentes de insulfur o no uniendo
1:05:16distintas subunidades. Ahora lo vamos a
1:05:18ver con ejemplos, ¿está bien?
1:05:22Entonces, ¿cómo se hace?
1:05:24Ah, bueno, entonces si tenemos acá hay
1:05:27un dibujito de una proteína que tiene
1:05:30diferentes subunidades y están
1:05:32representadas con estas rayitas así
1:05:35discontinuas, las uniones débiles y acá
1:05:38están los puentes de sulfuro. Si a esta
1:05:40proteína que tiene dos de estas
1:05:41subunidades, una de esta y otras dos, le
1:05:44pongo SDS, beter capto y calor, queda
1:05:47todo separado en subunidades eh sueltas.
1:05:52¿Está bien?
1:05:54y entonces y lineales y encima todas
1:05:57rodeadas de carga negativa y ya ahí las
1:06:00voy a poder correr y van a correr
1:06:02únicamente.
1:06:04Profe, pregunta.
1:06:05Sí,
1:06:07todas las eh lineitas negras representan
1:06:10una unión no covalente o solo las rojas.
1:06:14No, las rojas representan el puente de
1:06:16insulfuro.
1:06:17Ah, okay.
1:06:18Por eso este que está acá es una S, como
1:06:22SS, que representa habitualmente el
1:06:24puente de insulfuro. Y con todas estas
1:06:26líneas de puntos les quise mostrar como
1:06:27si fuesen uniones débiles. Entonces, con
1:06:30este tratamiento se desarpa todo.
1:06:32¿Está bien?
1:06:33Okay. Sí.
1:06:33Entonces, queda cada unida por separado
1:06:35y encima todas rodeadas de carga
1:06:37negativa por el SDX.
1:06:40Entonces, en un SDC page,
1:06:43que es esto quiere decir poliacrilamida
1:06:47gel electroforesis con SDS y en
1:06:50condiciones reductoras, que quiere decir
1:06:52que le puse además betamer capto,
1:06:54tratamos a las proteínas con SDS,
1:06:56betamercapto y calor. el calor es
1:06:58simplemente las ponemos a hervir un
1:06:59ratito
1:07:01y entonces se desnaturaliza, o sea,
1:07:03pierden su estructura tridimensional,
1:07:04quedan con carga negativa proporcional a
1:07:06su a su masa, o sea, esta relación carga
1:07:09igual para todas, por lo tanto migran de
1:07:12acuerdo a su peso molecular.
1:07:15Estamos. Y acá hay un cartel, ojo, que
1:07:18si alguna puede llegar a tener alguna
1:07:19modificación postraduccional, tipo una
1:07:22ubicuitinación, glicosilación,
1:07:24fosforilación, eso puede afectar cómo se
1:07:27mueva. Eso lo vamos a ver dentro de un
1:07:29ratito, pero primero vamos a ver cómo es
1:07:32esto del SDS page. Entonces, acá
1:07:34representa como una mezcla de proteínas
1:07:37todas con su formita. Las trato con SDS
1:07:39y betamer capto y calor. Quedan todas
1:07:42desarmadas, rodeadas de carga negativa y
1:07:43van a migrar truc. Y ahora vamos a ver
1:07:46cómo es esto.
1:07:48Y acá hay otro otro dibujito donde dice,
1:07:51bueno, tenemos esta proteína que tiene
1:07:53dos subunidades, la subunidad A y la
1:07:55subunidad B, unidas por puentes de
1:07:57insulfuro.
1:07:59Y acá tenemos esta otra proteína que
1:08:01tiene una única subunidad. Si las
1:08:04caliento con SDS y las trato con
1:08:06metamercaptetanol,
1:08:08acá muestra cómo se soltó todo, quedan
1:08:10cargadas negativamente y van a migrar en
1:08:13el gel. Esta me va a dar dos bandas.
1:08:15Ahora vamos a ver cómo es que vamos a
1:08:17correr este gel y ver esas bandas.
1:08:20Esta va a dar dos porque tenemos una que
1:08:23es más chiquitita que va a dar una banda
1:08:25y otra que se va a retrasar más y va a
1:08:27dar otra banda. Y esta va a dar una sola
1:08:30del tamaño correspondiente a su banda.
1:08:33Sí, ahora vamos a ir viendo todo el tema
1:08:36de los polos y todo, pero esto es como
1:08:37para que vayan viendo qué pinta tiene,
1:08:40pero puede ser que todavía le falten
1:08:42cosas para entender.
1:08:44Y además uno va a correr en otro como si
1:08:48fuese una callecita en paralelo, lo que
1:08:50se llama un marker o marcador de peso
1:08:52molecular,
1:08:54que es una colección de,
1:08:57en este caso, proteínas con tamaño
1:09:00conocido para que yo después sabiendo
1:09:04las puedo reconocer porque estos markers
1:09:06se compran y ya te eh uno puede saber
1:09:10qué qué eh qué tamaño tiene cada banda.
1:09:13Algunos vienen así con colorcitos
1:09:15distintos, otros son todos del mismo
1:09:17color y son un poco más más baratos,
1:09:19pero tienen algún truco como para darse
1:09:21cuenta, tipo, no sé, la de 25 tiene más
1:09:24cantidad, entonces uno ve una banda más
1:09:27más gruesita o eso, pero entonces uno
1:09:30puede
1:09:32ahora vamos a ver cómo, pero o más o
1:09:34menos estimar el tamaño o calcularlo con
1:09:36más precisión. Ahora les voy a contar
1:09:37cómo, pero comparando cómo migran las
1:09:40bandas de las proteínas que uno está
1:09:43tratando de averiguar qué tamaño tienen
1:09:45respecto al al tamaño del marker que
1:09:48está corrido en el mismo momento y en el
1:09:50mismo gel, en una calle al lado. Sí,
1:09:52ahora les voy
1:09:54Sí. Los cositos esos, eh, perdón,
1:09:57cositos esos, los los eh vienen a Claro,
1:10:01los markers vienen como en escala o más
1:10:05o menos es ver cuál
1:10:06no no dónde cae.
1:10:08Es Ahora les voy a mostrar. Lo que pasa
1:10:09es que esto les estoy adelantando, pero
1:10:11no les conté cómo era. Es un tubito. Te
1:10:15viene un tubito con toda una mezcla de
1:10:17proteínas de tamaños conocidos.
1:10:19Sí. O si uno está haciendo una
1:10:21electroforesis de ADN, uno tiene un
1:10:24tubito donde tiene todos fragmentos de
1:10:26ADN de tamaños conocidos.
1:10:29Ah, como que vos comparás y ves
1:10:30vos comparás, pero en la misma corri
1:10:32cuál es el mismo.
1:10:34¿Ves cuál es el mismo? ¿Cuál está medio
1:10:36parecido? Ahora lo vamos a ver con un
1:10:38ejemplo donde está toda a la vez, pero
1:10:39primero les voy a contar cómo se hace la
1:10:41electroforencia.
1:10:42Okay.
1:10:43Está bien.
1:10:44Genial.
1:10:45Sí, sí.
1:10:46Bueno, entonces,
1:10:46profe, perdón, tengo una pregunta sobre
1:10:49el BHS. ¿Puede romper puentes
1:10:52intracatenarios también?
1:10:54Todos, todos los puentes e disulfuro que
1:10:58haya los va a romper el beter capto,
1:10:59tanto intracatenarios como
1:11:01intercatenarios.
1:11:03Okay, gracias.
1:11:04No, de nada. Bueno, entonces ojo esto
1:11:07que les había avisado, pero vamos a
1:11:10volver en un ratito.
1:11:13Entonces, vamos a ver cómo se hace el
1:11:14gel,
1:11:16cómo se hace un SDS page. Cuando yo diga
1:11:19un SDS page, me estoy refiriendo a un
1:11:21gel de poliacrilamida con SDS y calor
1:11:24también. El calor no se aclara. Ya con
1:11:25que tenga SDS quiere decir que es
1:11:27desnaturalizante y después voy a aclarar
1:11:29que en general es en condiciones
1:11:31reductoras. Entonces uno le dice,
1:11:32"Bueno, ¿le pongo beta merapt o no le
1:11:33pongo?" Porque con eso jugamos un poco
1:11:36más o menos más que nada para hacer el
1:11:38ejercicio
1:11:39de averiguar a ver si hay o no puentes
1:11:41de sulfuro. Sí,
1:11:44pero bueno, entonces a la primero tengo
1:11:47que preparar tengo que preparar por un
1:11:49lado la muestra y por el otro lado el
1:11:50gel. La muestra que tienen las proteínas
1:11:52que yo quiero averiguar el tamaño,
1:11:55las voy a tener que mezclar con una
1:11:58solución que tiene varias cosas. La
1:12:01solución esa se llama buffer de siembra.
1:12:03¿Y
1:12:05qué tiene? Tiene ya el SDS, que ya
1:12:08sabemos para qué sirve. ¿Tiene o no el
1:12:11betaer capt? Lo que pasa que
1:12:13habitualmente uno cuando hace siempre le
1:12:15pone betamer capt acá más que nada eh en
1:12:19clase o o en los problemas lo
1:12:22ejercitamos como coni betamer capto como
1:12:25para tratar de pensar un poquito esto de
1:12:27los puentes de sulfuro, pero
1:12:28habitualmente uno quiere averiguar la el
1:12:32tamaño de las proteínas y de rutina el
1:12:34buffer de siembre tiene betamer capt, no
1:12:36es que tiene uno sin pero acá en
1:12:39este ejercicio o en alguna condición
1:12:41particular que uno realmente quiera
1:12:42averiguar qué pasa con los puentes de
1:12:44sulfuro. Se puede hacer un buffer de
1:12:45siembra con y uno sin betamar capto. Sí,
1:12:48pero entonces el betamar capto puede
1:12:50estar o no. Y además tiene glicerol, que
1:12:53el glicerol es una molécula que no va a
1:12:56interactuar con mis proteínas, pero lo
1:12:58que va a hacer es que esta mezcla se
1:13:02tenga una densidad más alta, sea más
1:13:04densa y me va a servir en el momento de
1:13:05sembrar para que se vaya al fondo. Ahora
1:13:07cuando les muestre cómo es un gel se van
1:13:09a dar cuenta. Y además tiene un
1:13:11colorante que va a servir para dos cosas
1:13:13y un buffer que me va a permitir
1:13:15mantener el pH donde yo quiero, la
1:13:18concentración de sales que yo quiero
1:13:19para que todo funcione bien. la corrida
1:13:21de bien. ¿Está bien? Entonces, eso es lo
1:13:24que tiene el buffer de siembra y con eso
1:13:28mezclo mi muestra. Una vez que lo
1:13:29mezclé, lo caliento a 95º 5 minutos para
1:13:33darle justamente el calor. Entonces,
1:13:35entre el calor y el SDS se van a romper
1:13:37todas las uniones débiles y además si
1:13:39tengo el betamarcapto, rompo los puentes
1:13:41de sulfura.
1:13:43Por otro lado, voy a armar el gel. El
1:13:46gel lo armo mezclando. Los geles se
1:13:49arman de distintas formas. mezclando
1:13:50todos los componentes que que necesita
1:13:52el gel, pero lo esto estos geles de de
1:13:56proteína se arman así en una
1:13:57configuración vertical como entre dos
1:13:59vidrios. Ahora tengo una foto que acá se
1:14:02ve un poco. Esto ya es cuando lo voy a
1:14:04sembrar, pero es un dispositivo que
1:14:07tiene acá está eh como dos vidrios.
1:14:12En realidad me faltó ponerles eh para
1:14:16que vean un poco cómo es el aparatito
1:14:17para armarlos. Son como dos vidrios que
1:14:20uno pone en un soporte con unas gomas
1:14:23para que las no se salga el líquido para
1:14:25fuera y le tira una solución que está
1:14:28líquida, pero que después se queda, se
1:14:30gelifica y se forma así como una
1:14:32gelatina. Pero para que queden armados
1:14:35estos pocillitos así, estos wels, wels
1:14:38es la palabra en inglés para decir
1:14:40posillo. Van a ver que decimos todo el
1:14:42tiempo well porque es muy normal decirle
1:14:45well a eso y para un montón de cosas.
1:14:46Así que disculpen si se me escapa Wals,
1:14:49me quiero, me estoy refiriendo a esos
1:14:51como si fuesen un bolsillo. Sí.
1:14:55Entonces uno para que se forme la
1:14:57gelatina con esa forma, la pone entre
1:15:00esos dos vidrios y además le pone un lo
1:15:03que llama un peine, que es como un
1:15:05pedazo de plástico con unos dientes,
1:15:07como si fuese un peine con dientes con
1:15:10esta forma cuadrada. Entonces, cuando
1:15:11esa gelatina
1:15:13eh gelificó, la cuando la solución
1:15:16gelificó y se formó la gelatina, uno
1:15:18saca ese peine y quedan estos
1:15:21bolsillitos acá. Sí, los geles de
1:15:26ácidos nucleicos que van a ser en el TP
1:15:28se hacen con otro aparato, se forma se
1:15:31hacen en horizontal y uno vuelca la
1:15:33gelatina como sobre una especie de
1:15:34moldecito horizontal y le pone el peine
1:15:37así, después lo saca. Pero el principio
1:15:39es el mismo, es generar la malla
1:15:42para que eh lo que yo quiero separar
1:15:45pase por ahí como con bastante
1:15:47rozamiento y dejarme preparado unos
1:15:49bolsillitos donde voy a poner mi
1:15:51muestra. Sí, acá vistos de costados.
1:15:54Fíjense que ahí voy a ir metiendo la
1:15:56muestra. Sí, perdón, había una pregunta.
1:15:58Sí. Eh, no, no, si sincero no entendí.
1:16:03No entendiste cómo se arma el gel.
1:16:05Sí, es esa parte, ¿no?
1:16:07Sí, en realidad es muy es un poco
1:16:09difícil explicarla. Acá no me di cuenta
1:16:11de traer eh Bueno, de hecho no estoy
1:16:15yendo al laboratorio por este tema que
1:16:16tengo con la espalda, así que no hubiese
1:16:17podido traer, pero
1:16:20si logramos tener el sábado la clase
1:16:22presencial, voy a tratar de llevar un
1:16:25aparato de gel para que lo vean.
1:16:27Eh, pero la realidad es que si después
1:16:31googlean y buscan cualquier videíto, lo
1:16:33van googleen eh eh
1:16:38armado de gel de de electro de
1:16:40poliacrilamida y ahí van a ver una cosa
1:16:43un poco mejor que lo que yo les puedo
1:16:44hacer con las manos y lo que ven en el
1:16:45videíto. Pero básicamente el concepto
1:16:47que necesito ahora que les quede es que
1:16:49se arma una gelatina,
1:16:52¿sí? Con un aparato que te deja poner la
1:16:54gelatina. ¿Vieron alguna vez hicieron
1:16:56gelatina? Vieron que uno la prepara y
1:16:58está líquida y eso cuando se enfría se
1:17:00queda como un gel. Sí,
1:17:03me siguen hasta ahí.
1:17:07Sí, profe, alguna vez.
1:17:09Sí. Bueno, esto es medio parecido, tiene
1:17:13bastantes diferencias, pero en lo que se
1:17:16parece es que uno primero se prepara una
1:17:18solución que está líquida, la pone
1:17:20adentro de un molde y después eso se va
1:17:22a transformar en un en una cosa gel que
1:17:25quede como una gelatina. Ese molde, en
1:17:29el caso de un gel de proteínas lo gen lo
1:17:32fabrico como con dos vidrios que están
1:17:35muy cerca y unas gomas y un piso así que
1:17:38me hacen como una especie de lugar donde
1:17:41yo puedo volcar ahí adentro y todo lo
1:17:43que queda metido dentro de ese vidrio
1:17:46va a ser como un gelito que es una
1:17:48gelatina así. Y le voy a poner un peine
1:17:51para que cuando gelifique y yo después
1:17:55saque ese peine, me queden estas formas
1:17:57así de bolsillitos.
1:18:01Ahora más o menos entendió un poquito
1:18:02más.
1:18:05Sí, sí. Igual también voy a buscar
1:18:06después con eso que
1:18:07y después busquen y yo voy a tratar de
1:18:10si el sábado les doy la clase ahí en la
1:18:12facu llevar un aparato para que ustedes
1:18:14lo vean. Eh,
1:18:16dale dale. Gracias.
1:18:18No, no me di cuenta, pero acá en casa no
1:18:21tengo, pero si no para la próxima les
1:18:22busco un videío, pero si googlean se van
1:18:24a encontrar un montón de cosas. Bueno,
1:18:27cuestión que
1:18:29una vez que tengo el gel armado, que ya
1:18:31se armó la malla y quedó eh la red bien
1:18:35definida, ahí puedo ir poniendo mis
1:18:37muestras. En cada uno de estos pongo la
1:18:40muestra número uno, la muestra número
1:18:41dos, la muestra número tres, ¿sí? en
1:18:44cada uno de estos bolsillitos por
1:18:45separado.
1:18:47Todo ese aparatejo, ese gel, lo meto en
1:18:50una especie de aparato que está que
1:18:53tiene unos cables y entonces lo voy a
1:18:55poder conectar a una fuente que le para
1:19:00que circule la corriente y entonces voy
1:19:02a tener el polo negativo que es el
1:19:04cátodo o el polo y el polo positivo que
1:19:06es el ánodo. Y cuando lo conecto a la
1:19:09fuente y con y y prendo la fuente,
1:19:11empieza a circular la corriente y cuando
1:19:13empieza a circular la corriente empieza
1:19:16a lo que se llama a correr el gel y lo
1:19:19que está pasando es que las moléculas
1:19:21empiezan a migrar adentro del gel siendo
1:19:24atraídas por el polo opuesto a su carga.
1:19:26¿Sí?
1:19:28Este es el aparato. Acá están. Acá se ve
1:19:31como eh tenemos los cables conectados a
1:19:34una fuente. Sí. Solo que esos cables en
1:19:37realidad, aunque uno lo vea todo acá
1:19:38arriba, hay uno que terminó abajo y el
1:19:43otro arriba y después tenemos cables que
1:19:44nos llevan hasta la tapa. Sí, pero
1:19:46entonces este gel corre en una
1:19:49configuración como vertical
1:19:52y tenemos el polo negativo arriba y el
1:19:54polo positivo abajo y van a migrar hacia
1:19:58el polo positivo porque están rodeadas
1:20:00todas de ese ds y entonces están
1:20:01totalmente rodeadas de una carga
1:20:03negativa, con lo cual van a migrar hacia
1:20:05el polo opuesto a su carga que es el
1:20:07positivo. Pero no es que se están
1:20:09cayendo por gravedad, para nada. Lo que
1:20:12está pasando es que empiezan a migrar
1:20:15una vez que uno conectó la fuente y y la
1:20:18prendió y empezó a circular la
1:20:20electricidad. Esto se llama cuba de
1:20:22electroforesis, donde uno mete su gel y
1:20:26además le pone un buffer que tiene iones
1:20:30eh que van a permitir que la corriente
1:20:32circule y tiene un pH adecuado y todo
1:20:35para que ande todo funcione la corriente
1:20:37en las condiciones que uno quiere. ¿Está
1:20:40bien?
1:20:40Perdón. ¿Existe algún caso? ¿Existe
1:20:43algún caso en el que se use una
1:20:45electroforesis hacia el polo negativo?
1:20:49Bueno, ahora cuando veamos la nativa
1:20:50dentro de un ratito, ahí puedes llegar a
1:20:54interesarte. Ahí justamente va a poder
1:20:55migrar para un lado, para el otro y el
1:20:57aparato es otra cosa, es diferente.
1:21:01Eh, el dispositivo es distinto, pero acá
1:21:03no sí, acá no podría migrar nunca para
1:21:05el polo negativo porque se saldrían de
1:21:08del
1:21:10well, ¿se dan cuenta? Porque realmente
1:21:14esto está sembrado como en un extremo
1:21:16directamente. No tienen para no tienen
1:21:18gel para donde ir para arriba.
1:21:21Pero esa pregunta que vos hiciste está
1:21:22buenísima porque para un gel nativo sí
1:21:24van a poder ir para cualquiera de los
1:21:26dos lados y es diferente.
1:21:29Profe,
1:21:32entonces la, o sea, dependiendo esas las
1:21:35marcas que hay en esa imagen, depende
1:21:38entonces también del tamaño de la
1:21:39proteína.
1:21:42Exacto. O sea, ahora yo todavía no les
1:21:45dije qué es esto que está que vemos acá,
1:21:47estas bandas, pero en principio vamos
1:21:49por acá.
1:21:50Sembramos la muestra, una muestra, la
1:21:52otra, la otra, la otra. Y acá voy a
1:21:54sembrar el marker. Sí, prendo la fuente
1:21:57y empieza a migrar. ¿Se acuerdan que yo
1:21:59les dije que el colorante que había en
1:22:01el buffer me iba a servir para dos
1:22:02cosas? Una es poder ver en el momento
1:22:06que siembre, porque si es todo
1:22:07transparente es muy difícil ver si le
1:22:10estoy embocando acá al huel o estoy
1:22:14pifiándole ir por afuera. Entonces yo
1:22:17puedo ver cuando estoy sembrando porque
1:22:20está teñido, va, porque en realidad está
1:22:22el buffer de siembra contiene unas
1:22:24moléculas que son de color azul y
1:22:27entonces lo veo y además se va al fondo.
1:22:31Ahí sí por gravedad porque tiene ese
1:22:33glicerol que lo hacía más denso que el
1:22:36resto de todo el buffer donde está todo
1:22:38esto sumergido. Entonces se va al fondo
1:22:41y me da un poco de tiempo a que yo
1:22:43termine de sembrar todo porque si no se
1:22:45empieza a flotar. Entonces termino de de
1:22:48semblar todo y recién cuando prendo la
1:22:50fuente empieza a migrar, ya no cae por
1:22:53gravedad, sino que migra y se empieza a
1:22:54meter adentro de la malla del gelar
1:22:57a separar por tamaño. Pero yo acá no veo
1:22:59mis proteínas. Mis proteínas no están
1:23:01teñidas. Estas rayas que se ven acá son
1:23:04las moléculas de colorante que estaban
1:23:06en el buffer de siembra que ahora están
1:23:09teniendo su otro rol. Un rol era dejarme
1:23:11ver cuando sembraban y el otro rol es ir
1:23:14viendo cómo avanza la corrida.
1:23:17Se dice que indican el frente porque por
1:23:19las características que tienen van
1:23:21corriendo bastante adelante. ¿Qué carga
1:23:23tendrán? ¿Qué carga se les ocurre que
1:23:25tienen si van migrando para adelante?
1:23:29negativa.
1:23:30Negativa. Si no tuviese carga negativa,
1:23:32no puede ir para el polo positivo. Así
1:23:34que esta molécula que por ejemplo es
1:23:37azul de bromofenol, que es una molécula
1:23:39que no tiene que ver con una proteína,
1:23:41pero es una molécula que por sus
1:23:42características va a migrar adelante y
1:23:47porque tiene carga negativa, por eso va
1:23:49a ir hacia el polo positivo. es bastante
1:23:51chiquitita y por su forma va a ir
1:23:52migrando como si fuese un frente de
1:23:55corrida y las proteínas van a ir
1:23:56quedando más atrás. Ojo con esto del
1:23:58frente porque a veces según qué cosas
1:24:01uno tenga, si tiene unas cosas muy
1:24:03particulares o muy chiquititas, capaz
1:24:05migra un poco más que ese colorante,
1:24:07pero uno tiene que estar atento a eso.
1:24:08Uno tiene que saber lo que está usando,
1:24:11cuál es el colorante y todas sus
1:24:12características. Pero en general, en
1:24:14líneas generales, el colorante funciona
1:24:17como un indicador de frente de corrida.
1:24:19dice, "Che, este colorante no se mueve."
1:24:21Ahí revisa y dice, "Ah, es que no
1:24:23prendiste la fuente o tenías flojo el
1:24:25cable." O sea, es importante porque uno
1:24:27puede ir viendo cómo avanza y viendo que
1:24:29va todo okay. Sí, esto tiene que ir
1:24:32avanzando. Si uno se lo queda mirando
1:24:33así, realmente ve que avanza. Sí.
1:24:37Una pregunta.
1:24:38Sí.
1:24:40El hecho de que le hayas agregado
1:24:41glicerol, colorante y otras moléculas,
1:24:44¿no termina afectando después el peso
1:24:46molecular original? Muy buena la
1:24:48pregunta. Esas cosas que están en el
1:24:50buffer de siembra no interactúan con las
1:24:53proteínas. Lo que sí interactúa con las
1:24:55proteínas es el SDS y el betamer capto y
1:24:58que las hayas calentado o si pusiste
1:25:00urea, pero el glicerol y el azul de
1:25:03bromofenol
1:25:05no interactúan y quedan como si fuesen
1:25:08otras moléculas más de tu mezcla que hay
1:25:10ahí y una vez que entran en el gel, cada
1:25:12una hace la suya porque no están
1:25:14asociadas a las proteínas. ¿Está bien?
1:25:17Perfecto.
1:25:18Okay, gracias.
1:25:19¿Cómo se llama lo de azul?
1:25:21Azul de bromofenol. Ahora no me acuerdo
1:25:24si se los escribí por algún lado.
1:25:30Después se los pongo. Este colorante que
1:25:32está acá habitualmente es azul de
1:25:34bromofenol, pero hay otros también. Sí.
1:25:39Después, antes de mandar, antes de pasar
1:25:41el este PDF a para que lo suban al
1:25:44campo, lo agrego.
1:25:46Profe,
1:25:47sí,
1:25:48perdón, una consulta.
1:25:49Sí.
1:25:50E cuando se prepara la muestra con las
1:25:53proteínas, ¿cómo sabes que solo tenés
1:25:55las proteínas y no otras cosas de la
1:25:57muestra?
1:25:58Perfecto. En realidad, eso va a depender
1:26:01de cuál sea tu muestra. Eh, en general,
1:26:05bueno, si uno tiene proteínas
1:26:06purificadas que las fabricó o que las
1:26:08sacó de otro lado, qué sé yo, bueno, vas
1:26:11a tener tus proteínas, pero muchas veces
1:26:13no tenés solo tus proteínas, tenés,
1:26:15ahora en un ratito les voy a contar, eh,
1:26:18le hiciste un tratamiento a una célula
1:26:20si querés ver qué le pasó a ciertas
1:26:22proteínas y rompés las células y te
1:26:24quedas con todo y entonces vas a tener
1:26:25las proteínas, los ácidos nucleicos,
1:26:28todas las proteínas y ahí vas a tener un
1:26:29caos, pero vos después tenés alguna
1:26:31forma de mirar lo que te interesa.
1:26:33Así que, ¿cómo sabes qué es lo que
1:26:35tenés? En realidad todo depende de cuál
1:26:38sea tu muestra, cuál sea el experimento
1:26:40que vos estás haciendo y después vas a
1:26:42tener distintas estrategias para mirar
1:26:44lo que te interesa. ¿Está bien,
1:26:46Agustina?
1:26:48Sí, gracias.
1:26:49¿Todos me van siguiendo?
1:26:53Sí, profe.
1:26:54Genial. Está estoy recontenta porque
1:26:56están son super pertinentes estas
1:26:58preguntas, así que quiere decir que me
1:26:59están siguiendo rebén.
1:27:01Bueno, entonces eh una vez que que
1:27:08conectamos esto va corriendo, va
1:27:10corriendo, va corriendo y yo voy mirando
1:27:11el indicador de frente de corrida y acá
1:27:15están mostrando como si el marker ya lo
1:27:21pudiese ver de por sí y eso pasa porque
1:27:24en general el marker ya viene teñido,
1:27:26las proteínas del marker suelen venir
1:27:29teñidas y Entonces uno, además de mirar
1:27:32cómo va el frente de corrida, uno puede
1:27:33ir mirando cómo se están separando las
1:27:36proteínas del mar, que al principio
1:27:37están todas amontonadas y después se van
1:27:39separando. Entonces uno dice, "Ah, mira,
1:27:42yo ya vi que se separaron estas, qué sé
1:27:45yo, ya me sirve o uy, todavía lo tengo
1:27:47que dejar correr un ratito más." Uno se
1:27:49va dando cuenta así,
1:27:52pero las proteínas propias uno no las ve
1:27:54porque están son no tienen color.
1:27:57Entonces, los markers ya vienen teñidos
1:28:00y eso nos permite ir monitoreando la
1:28:01corrida junto con el indicador de
1:28:03frente. Pero como cuarto paso,
1:28:07terminé cuando decidí, listo, ya corrió
1:28:09lo que yo quería porque me guié por el
1:28:11marker y por el frente de corrida. Ahora
1:28:13voy a cortar la corrida, apago la
1:28:15fuente, saco todo el aparato de ahí
1:28:19adentro, desarmo los vidrios, me quedo
1:28:21con esa gelatina que es refrágil y tengo
1:28:24que tener mucho cuidado que no se me
1:28:25rompa. Y ahora para mirar mis proteínas
1:28:29puedo hacer distintas cosas. Entonces,
1:28:31primero les voy a contar la más simple,
1:28:33que es las tiño. Tiño a las proteínas
1:28:36con un colorante que se une a todas las
1:28:38proteínas sin importar cuál sea la
1:28:40proteína ni cuál sea su composición. Y
1:28:43ese colorante se llama
1:28:45Kumasi Blue o en castellano azul de
1:28:48Kumasi. Sí. Y es un colorante que se une
1:28:51directamente al esqueleto carbonado
1:28:53cualquier proteína y no importa los
1:28:55grupos CR y eso.
1:28:58¿Me siguen? Entonces, si yo tengo,
1:29:01por ejemplo, una muestra que tiene una
1:29:05sola proteína o porque ya la purifiqué o
1:29:07lo que sea, voy a tener una única banda.
1:29:09Ahora, si yo venía de haber roto las
1:29:11células y que tengo un montón, un
1:29:13montón, un montón de proteínas
1:29:14distintas, voy a ver este tipo de cosas
1:29:16que es un montón de rayitas de distintos
1:29:19tamaños. ¿Me siguieron? Porque tengo
1:29:22todas las proteínas de la célula.
1:29:26¿Estamos bien?
1:29:29Sí. Sí.
1:29:30Perfecto,
1:29:32profe.
1:29:33Sí.
1:29:34O sea, que no estaba tenida antes la
1:29:37muestra.
1:29:38No, la muestra no está teñida. Lo que
1:29:40hay en la muestra es un colorante, como
1:29:44si fuesen moléculas de colorante que
1:29:46están separadas, pero no están unidas a
1:29:49la proteína. Entonces, una vez que
1:29:50entran al gel, se separaron. Mi proteína
1:29:52sigue siendo eh invisible, transparente.
1:29:56El colorante ese que me había tenido la
1:29:58muestra al principio, que me sirvió acá
1:30:00para el momento en que lo teñí, en que
1:30:02lo perdón, en que lo sembré,
1:30:04después se separa porque corre distinto
1:30:07que la proteína mía y que la otra y que
1:30:09la otra y que la otra, corre por su
1:30:11cuenta. ¿Está bien? En cambio, este
1:30:15colorante que les cuento ahora es un
1:30:17colorante que voy a poner después cuando
1:30:19ya decidí como cuarto paso. Listo,
1:30:22terminó la corrida. Cada proteína se
1:30:24ubicó en el lugar que se tenía que
1:30:26ubicar según su tamaño. Terminé la
1:30:28corrida, desarmo todo el aparato y ahora
1:30:30meto esa gelatina en un tapercito donde
1:30:33me preparé una solución que tiene un
1:30:36colorante que se une a todas las
1:30:38proteínas. Lo dejo un ratito, media hora
1:30:41ahí incubándose y después lo saco y lo
1:30:44miro y me aparece así.
1:30:46¿Está bien?
1:30:47Eh, sí. Y me perdí el paso tres también.
1:30:52No entendí que
1:30:52bien. Igual creo que ahora tengo un
1:30:53resumen donde están todos los pasos o
1:30:56no.
1:30:58A ver, no, no tengo un resumen, lo debo
1:31:00tener más adelante. Pero entonces, paso
1:31:03uno, preparo la muestra. Paso dos,
1:31:05preparo el gel y lo siembro. Paso tres,
1:31:09lo corro. Una vez que están todas las
1:31:11muestras sembradas, conecto a la fuente,
1:31:15prendo la la prendo la fuente, empieza a
1:31:17circular la corrente y ahí va. Es como
1:31:20arrancó la carrera, están todos los los
1:31:23corredores acá ubicados.
1:31:26Acá mismo tengo varios corredores
1:31:28juntos, unos más rápidos, otros más
1:31:29lentos. Y ahora le digo, "Aranca la
1:31:31carrera." Tuc. Prendí la fuente, empieza
1:31:34a circular la corriente y cada uno va
1:31:36corriendo a la velocidad que
1:31:39corresponde.
1:31:40Sí, por todo lo que vimos que y en este
1:31:43caso solo va a importar el tamaño. Los
1:31:45más grandes se van a retrasar más porque
1:31:47se van a ir trabando más con la malla
1:31:49del gelos se van metiendo más fácil por
1:31:51los agujeritos del gelo.
1:31:54¿Sí?
1:31:56Y entonces
1:31:58cuando digo, "Bueno, listo, ya me parece
1:32:00que podemos terminar la carrera porque
1:32:02ya llegó el colorante este al frente."
1:32:04El colorante fue corriendo por su
1:32:06cuenta, no estaba agarrado de ninguna
1:32:08proteína.
1:32:09Digo, "Apa, esto ya está llegando al
1:32:11bordecito por acá." Y voy mirando el
1:32:13marker, que como ya viene teñido, ya lo
1:32:15veo. Digo, "Listo, corto, apago la
1:32:17fuente, listo, cada uno terminó de
1:32:20correr donde estaba, se quedan todos
1:32:21ahí. Nadie más puede correr porque
1:32:23apagué la electricidad. Desarmo todo.
1:32:27Desarmo los dos vidrios con mucho,
1:32:29mucho, mucho cuidado para que no se me
1:32:31rompa el gel. Saco el gel y lo pongo
1:32:33adentro del taper con de la solución con
1:32:36colorante. Y ahí tenemos el cuarto paso
1:32:37que es tiño las proteínas que yo no las
1:32:40veo porque el colorante no estaba
1:32:42asociado a las proteínas, migraba por su
1:32:45cuenta. Solo veo las proteínas del
1:32:47marker si ya vinieron teñidos de antes
1:32:49porque así te las venden porque es más
1:32:51práctico.
1:32:53¿Está bien? Y entonces una vez que lo
1:32:54termine de teñir, queda así.
1:32:58Ahí, José, ¿entendiste?
1:33:01Sí, sí. Gracias,
1:33:03profe. Sí,
1:33:05profe.
1:33:07Eh, pregunta, e vos dijiste que el Comas
1:33:11Blue e tiñe todas las proteínas
1:33:14indiferentemente de cuál sean,
1:33:16de cuál sea la secuencia. Eh, claro, se
1:33:19puede reteñir en otro colorante, eh, o
1:33:24cada vez que nosotros querramos
1:33:25averiguar una proteína en específica,
1:33:27tenemos que teñirlo una única vez y eso
1:33:30después no se puede volver a hacer.
1:33:31Bueno, está muy bien esta pregunta, pero
1:33:34con esta estrategia de teñir con un
1:33:36colorante no podés ver una proteína
1:33:39específica. Ves todo lo que hay ahí en
1:33:41el G, todas las proteínas que estén ahí.
1:33:44Si vos justo en tu tubito tenías una
1:33:46proteína sola, vas a ver esa, pero si no
1:33:49no tenés no lo podés ver. Y tenemos otra
1:33:52estrategia que les voy a contar ahora
1:33:54cuando terminemos con esta parte para
1:33:56ver tu proteína en particular, pero esta
1:33:59esta tinción con cumas si es una tinción
1:34:01que no te diferencia proteínas en
1:34:04particular, sino que es general para
1:34:05todas las proteínas, hay otras
1:34:07tensiones, por ejemplo, una tinsión con
1:34:09con plata, hay otras que tienen eh como
1:34:12distinta sensibilidad, algunas te
1:34:14permiten ver si tenés muy poquitito,
1:34:16otras, pero todas tienen proteínas de
1:34:18manera genérica general, sin una
1:34:20especificidad. Para ver una proteína en
1:34:22especial vamos a usar otra estrategia
1:34:24que viene dentro de unas diapos.
1:34:27Estamos.
1:34:28Gracias, profe.
1:34:29No, de nada. Había otra otra pregunta
1:34:31más,
1:34:32profe.
1:34:32Sí,
1:34:33sí. Eh, entendí que la tipo la
1:34:37electricidad se tipo camina, digamos,
1:34:41dentro del
1:34:43circula, podemos decirle, la corriente
1:34:45eléctrica circula por el gel, por
1:34:48adentro del mismo gel. Exacto.
1:34:51¿Entendiste?
1:34:51Pero cuando yo conecto a la corriente,
1:34:53eh, o sea, porque yo leo que ahí abajo
1:34:55dice buffer y hay como una línea así de
1:34:57un azul más clarito.
1:34:58Ese no es el mismo buffer de siembra, es
1:35:00otro buffer.
1:35:01Es otro buffer. O sea, esto acá en este
1:35:05en este dispositivo uno mete el gel como
1:35:10como si fuese en una pileta donde hay un
1:35:11buffer. Acá está mostrado así, pero en
1:35:14realidad está dice buffer acá y dice
1:35:16buffer acá. No se lee mucho, pero hay
1:35:18buffer en los dos lados y en realidad
1:35:20está todo el gel bañado en un buffer.
1:35:23Aunque aunque parezca que hubiese un
1:35:25poco acá y un poco acá, en realidad son
1:35:26dos piletas y hay toda una continuidad
1:35:29de ese buffer entre un lado, todo el gel
1:35:34por ahí circula la corriente por el gel
1:35:37mismo, que de hecho el gel también está
1:35:38armado con buffer.
1:35:42Ah, okay. Y otra pregunta
1:35:43y y perdón y en el gel de agarosa, que
1:35:46ya van a ver cuando lo hagan en el TP,
1:35:47que tiene otra forma, es plano y eso
1:35:50directamente es como si fuese una
1:35:52gelatina tuc metida dentro de un de una
1:35:55pileta con los electrodos. Sí. Este es
1:35:58como un dispositivo un poco más más
1:36:00complicado porque es vertical y qué sé
1:36:02yo. El otro es una gelatina dentro de un
1:36:05de un eh de una de una cuba, se llama
1:36:09cuva de electroforesis. a este
1:36:11dispositivo que tiene una forma u otra
1:36:12según cuál sea el gel con los
1:36:14electrodos, pero todo tiene que estar
1:36:15sumergido en el buffer. El gel está
1:36:17sumergido en los buffer con algún
1:36:19dispositivo diferente u otro, pero
1:36:21siempre tenés una continuidad de
1:36:23corriente eléctrica, que es lo que te va
1:36:24a permitir que circulen las moléculas
1:36:28que están cargadas adentro del gel.
1:36:30Claro, eso era mi pregunta sobre la
1:36:32continuidad de de la electricidad,
1:36:34digamos.
1:36:35Exacto. Es continua. tenés esa esa
1:36:38electricidad que circula de un electrodo
1:36:42al otro atravesando el gel y que la
1:36:44tenés que tener super controlada. Si
1:36:45hiciste metiste la pata y te equivocaste
1:36:48en la concentración del gel o o pusiste
1:36:51la fuente mal o qué sé yo, desastre. o
1:36:53te empieza a circular mucha corriente y
1:36:56y levanta temperatura y se te funde
1:36:58todo, corre todo mal, se te altera la
1:37:01malla de la trama del gel o recalienta y
1:37:05se te rompe el equipo o te da error, por
1:37:07suerte la fuente y si te equivocaste y
1:37:09anda todo medio lento porque a lo mejor
1:37:12te olvidaste y lo hiciste con agua y no
1:37:14tenés guiones ahí en vez de buffer, te
1:37:17migra relento y no migra nunca y
1:37:19entonces tampoco te sirve, o sea, está
1:37:22todo super controlado. la corriente,
1:37:23cómo tiene que circular y las
1:37:25condiciones con las que preparas ese gel
1:37:27y el buffer y todo. ¿Está bien? Okay.
1:37:31Sí. Y la otra pregunta era sobre esto
1:37:34que vos decías de que cuando ya lo
1:37:36tenimos y todo, eh, si en uno de los
1:37:40pocillos yo tenía una sola proteína, veo
1:37:44una sola banda y si tengo más, puedo ver
1:37:46más bandas. Pero si tengo una proteína
1:37:48que tiene varias unidades, como lo corté
1:37:52con el BHS, puedo tener más de una banda
1:37:55también.
1:37:56Exacto. Vas a tener más de una banda.
1:37:58Exactamente. Ahora, de hecho lo vamos a
1:37:59pensar. E es exactamente así.
1:38:03Entonces, gracias.
1:38:04No, por favor. Y además lo otro que no
1:38:06les dije, les adelanté un poquito, pero
1:38:09eh así terminamos ya esta idea, como uno
1:38:12corre el marcador de un estándar, lo
1:38:16llamamos marcador de peso molecular o
1:38:18estándar de peso molecular, que en este
1:38:20caso hasta nos muestra que en este en
1:38:22esta en este marker lo que pusieron son
1:38:26como se la armaron como casera poniendo
1:38:29distintas proteínas purificadas que ya
1:38:31conocen el tamaño. Entonces dicen,
1:38:34"Bueno, mi marker son es una mezcla de
1:38:36proteínas purificadas que yo ya sé como
1:38:38qué tamaño tienen. Habitualmente los
1:38:40markers que se compran ahora de rutina
1:38:41uno ni sabe que son estas proteínas,
1:38:44pero sí sabe cuáles son los tamaños y ya
1:38:46vienen así teñidas algunas de colores o
1:38:50los más baratos vienen así, pero
1:38:52entonces uno lo corre y después puede
1:38:56identificar
1:38:58esto. Este marker lo tiene, pone en
1:39:01internet o viene con el catálogo el PDF
1:39:04o cuando te la compraste el tubito te
1:39:06viene con un papelito que si lo pegaste
1:39:09ahí en el laboratorio, te fijas y decís,
1:39:11"Ah, la banda, imagínate que teníamos
1:39:13plata y compramos este." Decimos, "Ah,
1:39:15la banda verde era la de 50, la banda
1:39:18así." Y entonces podemos hacer todo el
1:39:21cálculo,
1:39:22va identificar primero a qué tamaño
1:39:25corresponde cada banda del marker y en
1:39:28principio podríamos hacer una estimación
1:39:31bastante aproximada diciendo, "Ah, mira,
1:39:33mi proteína corrió entre 31 y 45,
1:39:36entonces sé que es más grande que 31 y
1:39:37más chica que 45." Sí, pero si quiero
1:39:41mayor precisión,
1:39:43lo que puedo hacer es
1:39:46un cálculo más preciso donde yo grafico
1:39:49cuánto migró mi cada una de las bandas
1:39:52del marker en realidad con respecto al
1:39:54frente de corrida. Por eso dice eh
1:39:57cuánto el la migración relativa al
1:40:00frente. Sí. Entonces, yo hago la
1:40:02diferencia respecto al frente de corrida
1:40:04y cuánto migró, lo mido. Lo mido
1:40:07directamente en milímetros, centímetros,
1:40:09lo que sea. Y hago este cálculo y puedo,
1:40:11si yo grafico cuánto esta migración
1:40:15relativa,
1:40:17eh, el logaritmo del peso molecular,
1:40:19porque para que sea lineal tiene que ser
1:40:21por el logaritmo del del tamaño, porque
1:40:24van a ver que en realidad las cosas más
1:40:25grandes se van quedando como más
1:40:27apretadas. La forma en que esto sea
1:40:29lineal es hacer el logaritmo del peso
1:40:32molecular, graficarlo respecto a la
1:40:35migración relativa y entonces uno puede
1:40:37hacer un cálculo y hacer una regresión
1:40:39lineal y ahí calcular entonces con más
1:40:42precisión cuánto tiene, qué tamaño puede
1:40:46tener la proteína de uno. Pero mirando
1:40:48así no más, uno ya aunque sea sabe entre
1:40:50qué bandas está y sabe que es más chica
1:40:52que una y más grande que la otra, pero
1:40:54se puede calcular con mayor precisión
1:40:55haciendo estas e est estos cálculos
1:40:58tanto para proteína como para ácidos
1:41:00nucleicos. Sí, de hecho esto lo van a
1:41:03hacer en el TP este cálculo también.
1:41:06Entonces,
1:41:09mini resumen y ahí vamos a las cositas
1:41:12que nos faltaron, pero antes terminamos
1:41:14con este resumen. Si tenemos una
1:41:16proteína que estaba formada por una
1:41:19única subunidad o una proteína con
1:41:21formada por dos subunidades unidas por
1:41:23uniones débiles y puentes de sulfuro.
1:41:25Cuando les pongo ese debetamer capto y 5
1:41:28minutos a 95 gr, desarmo todo y quedan
1:41:33cargadas negativamente, de tal manera
1:41:36que van a migrar solamente por su
1:41:38tamaño.
1:41:40Corro el siembro el gel porque en mi
1:41:43buffer de siembra tenía además el
1:41:44colorante y el glicerol. Lo siembro, lo
1:41:48corro. van a correr hacia el polo
1:41:50positivo. Cuando decidí que terminó,
1:41:54vieron, acá dice stacking gel y
1:41:56resolving gel. No importa todo. Esto es
1:41:59un detalle de cómo se arma, que se arma
1:42:01con una mezcla de dos tipos de gelatina
1:42:03distinta, en este caso el gel de las
1:42:05proteínas. No importa eso, el detalle,
1:42:08pero es por si se quedan mirando y
1:42:10dicen, "¿Y eso qué es?" Son como dos
1:42:12mezclas de gelatinas distintas, pero no
1:42:14pasa nada, que se arma entre dos
1:42:15vidrios, tuc, lo meto en el aparato, lo
1:42:18corro y una vez que terminó de correr,
1:42:21lo saco, lo tiño. Fíjense que acá como
1:42:24está. Esta es una foto de verdad donde
1:42:26se ve como los wsat
1:42:29están medio como deformados. Después uno
1:42:31los corta, le corta toda esa parte que
1:42:34se va a romper, numera las calles, le da
1:42:37los valores, le asigna los valores a lo
1:42:40a a las bandas del marker según el
1:42:41catálogo que tenga del peso molecular y
1:42:44después puede hacer este cálculo y
1:42:46averiguar qué tamaño tenía su proteína.
1:42:49¿Sí? Por ejemplo, esta proteína que está
1:42:51acá, ¿qué tamaño más o menos tiene?
1:42:5755. Sí, cerca de 55, un poquito menos,
1:43:00pero anda por ahí. Esta que está acá,
1:43:02¿qué tamaño más o menos tiene?
1:43:06Eh,
1:43:08100, un poquito menos de 100. Pero se
1:43:11dan cuenta cómo se empiezan a pretujar
1:43:12acá. Fíjense, esta de 15 y esta de 25
1:43:16están resepadas y solo hay 10 kg de
1:43:19alton de diferencia. Mientras que acá
1:43:22esta de 130 y 170 que tienen 40 kg de
1:43:26alt de diferencia están más apretadas,
1:43:27¿se dan cuenta? Y eso es la razón por la
1:43:30que después uno tiene que graficar el
1:43:31logaritmo, porque en realidad si las
1:43:34grafica sin logaritmo no le da una cosa
1:43:37lineal porque se están separando más
1:43:39estas que estas a medida que van
1:43:41corriendo. ¿Sí
1:43:43lo ven?
1:43:47Bueno, y entonces hagamos el ejercicio.
1:43:50No me contestó nadie, así que supuse que
1:43:51lo ven. Hagamos el ejercicio. Pensemos
1:43:55qué bandas daría. Acá tenemos un gel
1:43:58para completar, para dibujar.
1:44:02Ay, ¿alguien se anima a dibujarlo? Ay,
1:44:04es como que volvemos a la pandemia,
1:44:05sacamos las herramientas y hacemos un
1:44:07dibujo acá mismo. Me siento en pandemia.
1:44:10No sé si ustedes, ¿cuánta experiencia?
1:44:12¿Qué les agarró el secundario en
1:44:13pandemia a ustedes?
1:44:15No,
1:44:16sí,
1:44:19no sé, algunos la pasaron re bien, otros
1:44:21la pasaron remal, pero de golpe tuve un
1:44:23flashback pandemia, eh, pensar en un
1:44:26ejercicio que cada uno agarre una
1:44:28herramienta y y se anime a dibujar. Acá
1:44:30tenemos, pensamos qué bandas daría esta
1:44:33proteína si ahora la la trato con SDS,
1:44:37betamer capto, la hiervo y tenemos acá
1:44:39los valores de
1:44:42eh qué tamaño eh el peso molecular de
1:44:45cada una de estas subunidades. Cuando
1:44:47leo todo este tratamiento, truc, ya
1:44:48habíamos dicho que se separan y ahora
1:44:51cuando las voy a correr, voy a tener
1:44:54bandas que me generan estas estas dos
1:44:57que son las verdes son de 15 kil Dalton.
1:45:01Otra banda que me va a generar esta de
1:45:0220 y otra banda que me van a generar
1:45:05estas de 40. ¿Voy a poder distinguir
1:45:07esta de esta?
1:45:10No,
1:45:10no,
1:45:11no. De hecho, aparentemente por este
1:45:13dibujo podrían llegar a ser iguales,
1:45:15pero aunque no fueran exactamente
1:45:16iguales y esta tuviese algunos
1:45:18aminoácidos diferentes, si las dos son
1:45:21de 40, no las voy a poder distinguir
1:45:23porque las voy a ver, van a correr
1:45:25juntas como una única banda. Sí,
1:45:27lo único que va a poder determinar es
1:45:29que como es más ancho, sabes que ahí
1:45:31capaz hay más contenido, pero como que
1:45:33se va a hacer la diferencia. Pero
1:45:36bueno, ahí tenemos como una cosa que en
1:45:38general hacemos. Después hay una cosa un
1:45:40poco tricky que van a ver que se discute
1:45:42un montón en en la en las en las clases
1:45:45de seminario, lo van a discutir un
1:45:47montón y a veces están los problemas de
1:45:49uno piensa, ¿qué hago? El hago, si uno
1:45:52piensa y dice, bueno, me imagino que si
1:45:55hay más cantidad
1:45:57voy a tener una banda más intensa. Eso
1:46:00es verdad. Y entonces uno tiende a
1:46:02pensar que esta banda va a tener el
1:46:04doble de intensidad que una banda que
1:46:07está formada por una sola, pero no
1:46:09tenemos que olvidarlos que en realidad
1:46:11que olvidarnos que también
1:46:13la intensidad de la banda va a depender
1:46:16de la masa de proteína que hay ahí y eso
1:46:19también está afectado por el tamaño. A
1:46:21veces uno hace como una simplificación y
1:46:23las esquematiza como todas iguales y
1:46:26solo pone más gorditas o más finitas
1:46:29pensando en como cantidades molares,
1:46:32pero hay como una realidad que uno está
1:46:34haciendo una asunción que está mal
1:46:36porque también las más grandes también
1:46:38tienen más masa y eso también hace que
1:46:40capturen más colorante. Entonces, una
1:46:43más grande, aunque tenga un mol de igual
1:46:47cantidad de moles de estas verdes que de
1:46:49estas celestes, estas van a ser más
1:46:52intensas porque tienen más más.
1:46:53¿Siguieron?
1:46:55Pero todo ese ejercicio a veces hacemos
1:46:57como unas simplificaciones y lo dejamos
1:47:00sin
1:47:02aclarar en el o decimos, "Bueno, no le
1:47:04demos bolilla a la intensidad o si le
1:47:07vamos a dar bolilla, tenemos que tener
1:47:08en cuenta eso de la masa." ¿Está bien?
1:47:11La intensidad no solo representa los
1:47:12moles, sino que también representa las
1:47:14masas y una banda correspondiendo a una
1:47:17proteína de mayor tamaño tiene mayor
1:47:20masa.
1:47:22Bueno, entonces pensemos simplemente
1:47:25en las bandas por dónde andarían, dónde
1:47:27veríamos esta banda de color verde
1:47:32y por la segunda mirando de abajo para
1:47:35arriba. Acá, no, esta me daría una banda
1:47:38por acá,
1:47:40la de 20 me daría una banda por acá,
1:47:43¿no? Y la de 40 me daría una banda por
1:47:46acá. Sí, si hubiésemos tenido algún
1:47:48número distinto a las bandas del marker,
1:47:52por ejemplo, si hubiese tenido una de
1:47:5470,
1:47:55bueno, me hubiese dado una banda por
1:47:58acá, más cerca o más lejos que yo.
1:48:01Bueno, y ahí tendría que ir viendo. Sí,
1:48:03más o menos. Capaz no me puedo jugar
1:48:05mucho, pero puedo tener una estimación.
1:48:08Estamos,
1:48:11vamos bien.
1:48:13Y si no hubiésemos puesto betaer capto.
1:48:15Sí,
1:48:15sí, profe.
1:48:19¿Qué hubiese pasado si no hubiésemos
1:48:20puesto betaer capto?
1:48:24Hi tenido en 15 tres partes,
1:48:2630,
1:48:28o sea, ¿qué uniones se iban a romper y
1:48:30qué uniones iban a quedar?
1:48:35quedar los sulfuros.
1:48:38Exacto. Si yo no ponía beta merca capto,
1:48:40todas estas rayitas negras se iban a
1:48:42romper,
1:48:43se iba a rodear toda de carga negativa
1:48:45porque le ponía SDS, pero no se iban a
1:48:47romper los puentes de insulfuro.
1:48:49Entonces, esta iba a quedar suelta, así
1:48:52que esa la iba la voy a ver igual, ¿no?
1:48:56Igual que como habíamos dicho antes,
1:48:58como una banda
1:49:00acá. Sí.
1:49:03Eh, pero estas dos no se hubiesen
1:49:05separado
1:49:07entre sí, entonces me hubiese dado qué
1:49:09banda
1:49:12de 30.
1:49:13Una de 30. Me hubiese dado una banda que
1:49:14es la suma de estos tamaños.
1:49:17Sí.
1:49:19Y estas en realidad se hubiesen separado
1:49:21entre sí, pero les hubiese quedado esto
1:49:23acá. Y ahí entonces no me animo a decir
1:49:26mucho, si hubiese corrido exacto, no
1:49:27como la de 40 o si esa forma que
1:49:30hubiesen tenido una forma que no le iba
1:49:32a terminar de planchar, capaz le
1:49:34afectaba y me podía llegar a afectar la
1:49:35movilidad un poquito. Sí,
1:49:40está bien.
1:49:40O sea, que va a correr más lento.
1:49:43No puedo predecirlo. Sé que es muy
1:49:45probable que corra distinta que el
1:49:47fragmento, pero no puedo saber porque a
1:49:49lo mejor tiene una forma loca que de
1:49:51golpe migra más o una forma muy extraña
1:49:53que se engancho a toda. Si no tienen
1:49:56igual forma, no las puedo comparar
1:49:59o puedo o puedo saber,
1:50:02o sea, no puedo no puedo decir por dónde
1:50:05anda, puedo saber que es muy probable
1:50:07que corra distinto,
1:50:09que es la del mismo tamaño, pero con
1:50:12otra forma.
1:50:14Sí. Y de ninguna manera la puedo
1:50:15comparar con el marker, porque el marker
1:50:17son todas proteínas planchadas. Sí.
1:50:20Bueno, aunque si no le hubiese puesto
1:50:21beta capt, a lo mejor no estaban
1:50:22planchados. Es como que todo ese juego
1:50:24de
1:50:26de cómo le altera la forma, el marker en
1:50:29realidad también se estaría alterando.
1:50:31Entonces es un poco más tricky, pero es
1:50:33un concepto que está bueno que lo
1:50:35tengan, ¿no? Y que piensen que estamos
1:50:37haciendo simplificaciones siempre.
1:50:40¿Está bien?
1:50:43Bueno, perfecto. Los puentes de
1:50:45disunfuro, profe, e alteran el peso de
1:50:48la, o sea, de la,
1:50:49o sea, le agregan o le restan,
1:50:51no, no le cambian significativamente el
1:50:54peso porque no es que le cambia mucho
1:50:56mucho los átomos que están acá
1:50:58solamente, pero sí cambia completamente
1:51:00a qué va a estar unido y si esto le
1:51:02altera la forma, te puede alterar la la
1:51:04corrida por eso,
1:51:06pero
1:51:06ah, listo,
1:51:07el hecho de que las modificaciones
1:51:09postraduccionales le cambien eh cómo
1:51:12migra
1:51:13por el peso, sino que tiene puede tener
1:51:16que ver con otras cosas que le pasen.
1:51:18Ahora en un ratito eso lo pensamos un
1:51:20poquito más. Lo que quiero ver es la
1:51:22hora, porque capaz estamos para un
1:51:25intervalo, ¿no? Porque ya son las 8.
1:51:26¿Quieren que cortemos 10 minutos porque
1:51:29deben estar un poco todos agotados? Eh,
1:51:31cortamos 10 minutos y así llegamos pilas
1:51:35hasta las 9.
1:51:36Dale, profe.
1:51:37Dale, profe.
1:51:38Dale. Bueno, genial. Yo tengo las 8:3.
1:51:42Volvemos 8:15 como pero 8 y cuarto
1:51:44posta, ¿eh? 8 y cuarto arrancamos. Sí,
1:51:49dale.
1:51:54Entonces,
1:51:56vamos a la pregunta que me habían hecho
1:51:58hace un ratito y es, bueno, pero ¿cómo
1:51:59miro si quiero mirar mi proteína? Y
1:52:02efectivamente acá se dieron cuenta que
1:52:03con esta técnica
1:52:07no podemos ver la proteína de interés.
1:52:13Miren que otra vez ahí está
1:52:18listo.
1:52:23Entonces, en un gel está teñido así, ya
1:52:26sea con kumas y blue o con otras
1:52:28tinciones esas genéricas, como les
1:52:29contaba, como como nitrato de plata,
1:52:32vemos todas las proteínas que hay en la
1:52:33muestra y entonces si queremos ver una
1:52:36en particular, imaginemos que de todas
1:52:38estas proteínas de la muestra, yo quiero
1:52:39ver esta que está acá, pero que no sé
1:52:42dónde está, tengo que usar alguna otra
1:52:44herramienta. ¿Se les ocurre alguna cosa
1:52:47que pueda reconocer proteínas en
1:52:48particular?
1:52:53Anticuerpos.
1:52:54Sí, exactamente. Anticuerpos. Entonces,
1:52:59para esto, para poder identificar una
1:53:02proteína en particular, se usa como una
1:53:05continuación de esta técnica.
1:53:08Es una una estrategia que se llama
1:53:10western Blood, que es bastante parecida,
1:53:13toda igual, toda la primera parte, pero
1:53:15después en vez de teñir vamos a usar
1:53:18anticuerpos para verlas. Pero entonces
1:53:20primero repasemos un segundo lo que son
1:53:22los anticuerpos, ¿va? No es que nos
1:53:24vamos a poner a repasarlos muchos, van
1:53:26de hecho van a hablar de anticuerpos con
1:53:28Paula en las clases de inmunología al
1:53:30final de la materia. Un montón, un
1:53:31montón. y van a ser sxpertos,
1:53:34pero por ahora solo les cuento que son
1:53:37proteínas que bueno que se producen el
1:53:40sistema inmunológico, pero que nosotros
1:53:41las usamos como
1:53:43eh que se usen por el sistema
1:53:45inmunológico, por células específicas
1:53:46del sistema inmunológico, pero a
1:53:49nosotros nos sirven un montón como
1:53:50herramientas en el laboratorio,
1:53:53en en la vida, en en el cuerpo, nos
1:53:56sirven, por supuesto, para defendernos.
1:53:58Ya van a ver de todas las formas que nos
1:54:00sirven, pero en el lavo nos sirven un
1:54:04montón porque tienen una altísima
1:54:06especificidad por
1:54:09ciertas, va por diferentes cosas.
1:54:13Entonces,
1:54:15eh los anticuerpos son proteínas que
1:54:17tienen
1:54:19eh bueno, diferentes subunidades,
1:54:22distintas partes y eso, pero lo que nos
1:54:23interesa es que van a tener una región
1:54:26que es una parte que son eh que está
1:54:30formada por unos loops que que
1:54:34que pueden ser muy variables y que son
1:54:36entonces es lo que es distinto en cada
1:54:38anticuerpo. Y esto es lo que va a tener
1:54:40la parte que reconoce específicamente a
1:54:42distintas cosas de interés. Y después
1:54:44tiene otra parte que son todos iguales o
1:54:46en realidad hay diferentes, pero que son
1:54:50iguales entre sí por familia, digamos.
1:54:52Pero tiene una pregunta, profe,
1:54:54que reconoce lo que yo
1:54:56sí, perdón.
1:54:57No, disculpa. Usamos, o sea, hay varios
1:55:00tipos de anticuerpos. Podemos usar
1:55:02cualquier tipo o hay uno en particular.
1:55:05Bueno, en realidad
1:55:07los diferentes tipos de anticuerpos
1:55:09tienen que ver con cómo es esta parte de
1:55:10acá abajo, es lo que van a ver después
1:55:12con PAU y que eso tiene que ver más con
1:55:15la respuesta eh biológica que importa en
1:55:18el sistema inmunológico. Después cuando
1:55:20nosotros los usamos como herramientas en
1:55:21el laboratorio, no no solo para el
1:55:24western Blood que les voy a contar
1:55:25ahora, para un montón de cosas, eh en
1:55:28general lo que nos importa es esta parte
1:55:30que es la que va a reconocer lo que
1:55:32nosotros queremos, pero tenemos que
1:55:34saber cómo es esta parte porque la
1:55:37necesitamos para seguir adelante con la
1:55:39técnica. Ahora les voy a contar por qué,
1:55:42pero no es que nos importa esta parte
1:55:44por su función biológica, porque no la
1:55:46vamos a usar. Lo que solo vamos a usar,
1:55:48los vamos a usar como algo que reconoce
1:55:50lo que yo quiero, pero tengo que saber
1:55:52cómo es esta parte porque yo la la voy a
1:55:56la voy a tener que reconocer también.
1:55:58Ahora les cuento cómo
1:55:59está bien,
1:56:01pero o sea, si hay distintos tipos de
1:56:03anticuerpos, Ig, IGG, IGM, a nosotros no
1:56:07es que nos importa por la función
1:56:08biológica de los que pueda tener cada
1:56:11uno de ellos acá, sino que necesitamos
1:56:13saber qué es y en qué especie está hecho
1:56:18y en qué organismo está hecho para poder
1:56:21eh reconocer esta parte nosotros por
1:56:23otro por otro lado. Ahora, ahora les voy
1:56:25contando.
1:56:27Pero entonces, si queremos identificar
1:56:28una proteína en particular, en vez de
1:56:30teñir todas con un cumací y tenemos
1:56:33anticuerpos que reconozcan esa proteína
1:56:35que nosotros necesitamos, podemos hacer
1:56:38un western blot. El western blot
1:56:40consiste en hacer primero un SD page,
1:56:45como les conté, todo todo igual, excepto
1:56:49hasta el momento de teñir las proteínas,
1:56:51no las teñimos, llegamos hasta tener el
1:56:53gel corrido y no teñimos las proteínas
1:56:56con comacasín. ¿Estamos bien?
1:56:59Entonces, lo que hacemos es a las
1:57:02proteínas, una vez que terminó la
1:57:04corrida,
1:57:06sabemos que corrió porque vemos el
1:57:08marker y vemos, se acuerdan que las
1:57:10proteínas del marker estaban teñidas y
1:57:13vemos eh
1:57:15el colorante de siembra, sabemos que se
1:57:18que corrió bien, pero nuestras proteínas
1:57:20no las vemos. Entonces, en vez de
1:57:22teñirlas con cumas, vamos a transferir
1:57:25las proteínas. Yo hago todas cosas con
1:57:26la mano y no me doy cuenta que todo lo
1:57:27que hago con la mano no sale acá en la
1:57:29cámara.
1:57:31Eh,
1:57:33una vez que terminó la corrida en el
1:57:35gel, transferimos las proteínas a una
1:57:37membrana
1:57:39y después las proteínas que están en la
1:57:42membrana las vamos a revelar con el
1:57:43anticuerpo específico. Entonces, ahí les
1:57:45voy contando cómo se hace.
1:57:47Acá está eh
1:57:50las proteínas
1:57:52eh que estaban en el gel las voy a pasar
1:57:55a una membrana. En realidad acá están
1:57:58teñidas azules, ¿sí? Pero eh no teñimos
1:58:03las proteínas. Imaginemos que esta es la
1:58:05calle del marker. El marker ya venía
1:58:07teñido. Así como se se van a transferir
1:58:09todas las proteínas mías, se va a
1:58:10transferir el marker y eso está
1:58:12buenísimo porque me va a dejar ver si la
1:58:14transferencia anduvo bien. Pasarla a una
1:58:17membrana, ¿para qué es? para que eh en
1:58:21esa membrana que es como si fuese un
1:58:22papelito,
1:58:24las proteínas quedan expuestas y después
1:58:26yo les voy a poder poner una solución
1:58:28que tiene los anticuerpos que yo quiero
1:58:30las voy a poder poner como en un
1:58:31tapercito o en contacto con una solución
1:58:34que tiene el anticuerpo y el anticuerpo
1:58:36que está representado acá como que anda
1:58:38por todos lados solo va a quedar pegado
1:58:41en el lugar donde está mi proteína de
1:58:42interés. Pero todas estas otras
1:58:44proteínas que están acá marcadas, en
1:58:46realidad yo no las veo. Sí, aunque están
1:58:48marcadas, eh, están dibujadas. ¿Me
1:58:51siguen?
1:58:53Solo si fuese el marker. El marker sí lo
1:58:55veo, pero el marker nunca lo voy a
1:58:56querer revelar con un anticuerpo.
1:58:59Ah, dice papel de filtro porque hay,
1:59:01bueno, diferentes tipos de materiales
1:59:04que pueden ser esa membrana a la que voy
1:59:06a transferirlo. O sea, en el gel no
1:59:09puedo hacer el con el anticuerpo, le
1:59:11tengo que pasar a otra cosa. Sí.
1:59:12¿Alguien
1:59:15me preguntó algo?
1:59:16O sea, que sí, o sea, que si nosotros en
1:59:19realidad lo que transferimos lo vemos
1:59:21tipo transparente,
1:59:23¿sí?
1:59:23Lo ponemos con los anticuerpos y una vez
1:59:25que nosotros tipo le ponemos algo al
1:59:28anticuerpo para que se note, recién ahí
1:59:30vemos como si fuera una banda.
1:59:32Exactamente. Ahora vamos a ver que con
1:59:34solo poner el anticuerpo no alcanza,
1:59:35sino que tenemos que poner algo para ver
1:59:36el anticuerpo, como vos dijiste. Exacto,
1:59:40profe.
1:59:41Sí.
1:59:42Una pregunta.
1:59:44E el anticuerpo está en la membrana,
1:59:47¿no? Ahora, ahora déjenme avanzar con
1:59:50esto porque acá parece que estuviese en
1:59:51la membrana, pero en realidad fíjate en
1:59:53este dibujito acá que está como todo eh
1:59:56nadando, porque vos vas a poner primero
1:59:59vas a poner
2:00:00transferir lo que tenías en el gel a la
2:00:02membrana y después esa membrana la vas a
2:00:05meter en una solución que tiene tu
2:00:07anticuerpo.
2:00:09Lo que pasa es que nos estamos
2:00:10adelantando, pero ahí viene más
2:00:12explicado. Perfecto, gracias.
2:00:14No,
2:00:15profe,
2:00:15fíjense. Sí,
2:00:18no sé si porque recién asunto que me uní
2:00:20y creo que se, o sea, me uní un poquito
2:00:22después, pero ¿por qué el anticuerpo nos
2:00:26permite identificar la proteína? Ah,
2:00:29porque el anticuerpo justamente es una
2:00:32proteína que tiene un rol biológico,
2:00:34pero que nosotros lo usamos como
2:00:35herramienta porque tiene una región, voy
2:00:38a volver un cachito para atrás, tiene
2:00:40una región que te permite que interactúe
2:00:43específicamente con algo específico.
2:00:46Entonces, si vos querés un si vos tenés
2:00:48una proteína que te interesa y tenés un
2:00:50anticuerpo que te la reconoce, podés
2:00:52usar ese anticuerpo para ir a buscarla,
2:00:55para poder verla. ¿Está bien? Okay. Sí,
2:00:58sí.
2:00:58Con eso medio rápido te alcanzó para
2:01:00ponerte en tema.
2:01:01Sí, creo que sí. Sí, sí.
2:01:03Entonces, lo que yo les había dicho es
2:01:04que hacemos un western blot, que es toda
2:01:07la primera parte, igual que el gel que
2:01:09ya les conté, pero en vez de teñir eh
2:01:12las proteínas, las transferimos a una
2:01:15membrana. Ese ese eso
2:01:19ese proceso de transferir
2:01:21lo que estaba en el gel a la membrana se
2:01:23llama blood. ¿Sí?
2:01:26Entonces, por eso es el western Blood
2:01:29después lo voy a ir contando, pero en
2:01:30realidad ya van a ver más adelante en la
2:01:32materia otras variantes de Blood y
2:01:34entonces está el Southern Blood que es
2:01:36para DNA y que fue el primero,
2:01:39eh, y que viene por el apellido de la
2:01:40persona que lo desarrolló y después
2:01:42hicieron nen blood para RNA y western
2:01:45blood para proteínas, pero por ya ahí
2:01:47como un juego de palabras por southern
2:01:49Blood que fue el primero. Si, pero que
2:01:50eso lo van a ver en detalle más
2:01:52adelante, pero yo ahora necesito
2:01:53contarles Western Blood, que es la
2:01:55herramienta que tenemos para poder ver
2:01:58solo mi proteína de interés en el mar de
2:02:00proteínas que puede ver ahí. Entonces,
2:02:03primero las transfiero, después incubo
2:02:07la membrana entonces con anticuerpos que
2:02:09reconocen la proteína de interés y
2:02:12después revelo el lugar donde está el
2:02:15anticuerpo. Acá hay un pedacito como
2:02:17para que vean cómo se ve, que ahora les
2:02:18voy a mostrar más en detalle. ¿Cómo lo
2:02:20revelo?
2:02:23Bueno, hay diferentes formas de ver
2:02:25dónde está el anticuerpo. En general,
2:02:27uno usa lo que se llama un anticuerpo
2:02:28secundario, que es otro anticuerpo, pero
2:02:31que reconoce esta partecita de acá. Sí,
2:02:35por eso yo les decía que uno tiene que
2:02:38saber qué es esta parte de acá porque
2:02:39tenemos distintos variantes. Si este
2:02:41anticuerpo a lo mejor estaba eh fue
2:02:44hecho en células de ratón, voy a
2:02:47necesitar un anticuerpo secundario que
2:02:48reconozca esta parte de ratón. Si esto
2:02:50fue hecho en conejo, voy a necesitar un
2:02:52anticuerpo que reconozca esta parte de
2:02:54conejo, ¿sí? Si es una IGG o una IGM,
2:02:57que son distintas variantes de
2:02:59anticuerpos que tienen esta parte
2:03:00diferente, yo lo tengo que saber para
2:03:02poder elegir el el anticuerpo secundario
2:03:05apropiado, que me reconozca esta parte,
2:03:07¿está bien?
2:03:09Pero entonces el anticuerpo secundario
2:03:11reconoce el anticuerpo primario y el
2:03:14anticuerpo secundario tiene algo que me
2:03:16deje ver. En este caso parece como una
2:03:19pelota fluorescente, pero hay distintas
2:03:20variantes. Sí, acá les claro que también
2:03:24uno puede usar un anticuerpo primario
2:03:26que directamente tenga la pelota esta
2:03:28fluorescente,
2:03:30pero en general uno usa un anticuerpo
2:03:34secundario. ¿Se les ocurre? ¿Por qué
2:03:36puede ser esto
2:03:38de no usar el primario directamente
2:03:40marcado?
2:03:46Por ahí el primario no se une sí o sí
2:03:48con con
2:03:50la proteína. Yo busco, puede pasar eso
2:03:53haya tipo anticuerpo libre.
2:03:56Bueno, eso que quede anticuerpo libre es
2:03:58una cosa que realmente pasa, que tenés
2:04:00razón y hay toda una serie de pasos en
2:04:02el protocolo para sacarte de encima los
2:04:04anticuerpos que quedaron libres. Ahora,
2:04:06si el anticuerpo primario no se pega
2:04:08bien a tu proteína o se pega además de a
2:04:12tu proteína a otros lados, ese problema
2:04:15igual lo van a tener aunque usen un
2:04:17anticuerpo secundario. O sea, uno tiene
2:04:18que tener el anticuerpo primario que se
2:04:21pegue lo mejor posible su proteína y que
2:04:23no se pegue a otras cosas y además hay
2:04:26pasos en el protocolo para sacarse de
2:04:28encima los anticuerpos que quedaron
2:04:29flotando por ahí o unidos medio flojito
2:04:32en lugares que no reconocían muy bien.
2:04:34Pero la realidad es que tener un
2:04:35anticuerpo secundario
2:04:38tiene bastantes ventajas. Yo ahora no me
2:04:40acuerdo si dejé la diapo. Ahí está. Una
2:04:43de las ventajas es que a un anticuerpo
2:04:46primario en realidad lo reconocen varios
2:04:48anticuerpos secundarios
2:04:50a la vez, no como está dibujado acá,
2:04:52sino más bien como está dibujado acá.
2:04:54Entonces, esto nos permite amplificar un
2:04:56montón la señal.
2:04:58En vez de tener un solo, por ejemplo, si
2:05:00esto es una una cosa fluorescente, en
2:05:02vez de tener una sola molécula
2:05:04fluorescente, puedo llegar a tener
2:05:06muchas porque son muchos anticuerpos.
2:05:08Entonces, esto es una amplificación de
2:05:09la señal.
2:05:11Y otra razón es que es más barato y y y
2:05:16más factible tener en el laboratorio si
2:05:18uno puede tener o conseguir varios
2:05:20anticuerpos primarios y después o uno se
2:05:24compra los anticuerpos primarios para
2:05:26las distintas proteínas que está
2:05:27estudiando y a lo mejor un mismo
2:05:29anticuerpo secundario le sirve para ver
2:05:31varias distintas y sale más barato el
2:05:33anticuerpo primario que no tiene unido
2:05:35esto que el que no tiene unido y además
2:05:37este anticuerpo primario sin esto unido
2:05:39lo puedo usar para otras técnicas que
2:05:41también requieran anticuerpos, pero que
2:05:44me molesta si tengo el coso unido acá.
2:05:46Entonces, hay un montón de razones, pero
2:05:48aún así hay gente que para algunas cosas
2:05:51tiene el anticuerpo primario ya marcado
2:05:53y también sirve. Sí, pero hay varias
2:05:56ventajas para usar habitualmente un
2:05:58anticuerpo primario y después un
2:05:59secundario. ¿Está bien?
2:06:02Perdón, tengo una consulta. No me quedó
2:06:04muy claro cuál es la diferencia entre el
2:06:06anticuerpo secundario y el primario.
2:06:08Bien, eso, mira, ahora va a quedar más
2:06:10claro en este en esta diapo. El primario
2:06:13es el que va a reconocer lo que tu
2:06:15proteína de interés, en este caso esta
2:06:17pelotita verde. ¿Sí? Entonces, tenemos
2:06:21la membrana a la que yo pasé todas las
2:06:23todas las proteínas que había en el gel
2:06:26y entre ellas está la mía de interés. El
2:06:28anticuerpo primario se va a unir solo a
2:06:31la mía de interés. también al principio
2:06:33va a estar por todos lados, pero yo voy
2:06:34a hacer lavados, los voy a sacar que yo
2:06:36y me voy a quedar lo más posible con el
2:06:38anticuerpo pegado en mi proteína de
2:06:40interés. Y ahora para poder ver dónde
2:06:43está el anticuerpo primario voy a tener
2:06:46que usar alguna estrategia y en general
2:06:48esa estrategia es poner un anticuerpo
2:06:51que te reconoce el primario por esas
2:06:53cosas que les había dicho antes de la
2:06:55amplificación,
2:06:57de poder tener un anticuerpo secundario
2:07:00que te sirve para muchos primarios.
2:07:02y que este primario es más barato si no
2:07:04tiene otra cosa y que además este
2:07:05primario lo puedo usar para otras
2:07:06técnicas y no solo para western. Está
2:07:08bien. No sé quién era que no entendía lo
2:07:11del primario y del secundario. Ahora
2:07:12quedó.
2:07:14Ahí me quedó más claro.
2:07:16Bueno, y después el secundario para
2:07:18poder ver dónde está,
2:07:20porque ahora fíjense que voy a querer
2:07:22ver dónde está el secundario para ver
2:07:24dónde estaba el primario, para ver dónde
2:07:25estaba mi proteína de interés. Entonces,
2:07:28el secundario que tenía acá puedo tener
2:07:31que lo puedo ver donde está porque tenga
2:07:33enganchada una encima
2:07:37que si yo le doy un sustrato produce un
2:07:39producto de color que se queda ahí
2:07:41pegadito en ese lugar. Cuando veamos
2:07:43encimas lo vamos a volver a ver esto
2:07:46o
2:07:48que tenga enganchado una enzima, que le
2:07:50doy un sustrato y que produce cuando
2:07:52cuando lo procesa produce luz y yo puedo
2:07:55detectar la luz y solo se va a producir
2:07:58y va a estar en ese lugarcito donde esto
2:07:59se haya quedado quieto o que tenga un
2:08:04fluoróforo, alguna molécula fluorescente
2:08:06y entonces que yo la pueda detectar
2:08:09por microscopía, eh, no, perdón, Estamos
2:08:12en un western eh, con algún equipo que
2:08:14detecte la fluorescencia y entonces va a
2:08:17quedar la bandita con la forma que tenía
2:08:19la bandita, como había corrido mi
2:08:21proteína, toda cubierta de anticuerpo
2:08:23primario, después el secundario y ahí va
2:08:25a estar o la el fluoróforo este o la luz
2:08:29o el producto de esta enzima.
2:08:32Perdón, tengo una pregunta. Sí,
2:08:34si estamos trabajando, bueno, capaz es
2:08:36muy específico, pero si se está
2:08:37trabajando con proteínas eh provenientes
2:08:40de un virus,
2:08:42¿qué anticuerpos usamos? Porque creo que
2:08:44un virus es muy sencillo, no tiene un
2:08:46sistema que produzca anticuerpos.
2:08:48Bueno, en realidad los anticuerpos no es
2:08:50que son anticuerpos eh habitualmente
2:08:52naturales que existen eh así y que uno
2:08:56aprovecha los que los los que y sacarlos
2:08:59de un organismo así no más. Muchas veces
2:09:01uno lo fabrica a propósito. Hay
2:09:03diferentes formas de fabricar los
2:09:05anticuerpos que se lo van a ver bien con
2:09:06Pau cuando en inmunología al final. Eh,
2:09:11pero uno puede producirlos eh como
2:09:14artificialmente
2:09:16o y o
2:09:19exponer al organismo que quiere que
2:09:20produzca esos anticuerpos con la
2:09:23proteína contra la que uno quiere
2:09:25anticuerpos. Y entonces ese organismo la
2:09:27reconoce como algo extraño y una de las
2:09:28cosas que va a pasar es que va a
2:09:30producir anticuerpos contra eso y uno
2:09:31los puede purificar o en células en
2:09:34cultivo que uno tiene eh bueno, unas
2:09:37células especiales que que sirven para
2:09:39eso, pero hay como diferentes formas.
2:09:41Ahora,
2:09:41okay,
2:09:42lo van a entender mucho mejor cuando
2:09:43vean inmunologías. Por ahora,
2:09:46claro, gracias.
2:09:47Por ahora aceptemos que el anticuerpo,
2:09:49además de ser una cosa natural, que nos
2:09:51sirve un montón para defendernos en el
2:09:52cuerpo, nos sirve como herramienta y
2:09:55podemos conseguir anticuerpos contra
2:09:58prácticamente todas las proteínas o
2:10:00contra muchísimas proteínas y son una
2:10:01herramienta reútil para estudiar.
2:10:04Profe, una pregunta.
2:10:06Sí,
2:10:08el anticuerpo secundario que se usa,
2:10:10sí,
2:10:11ya está pensado, o sea, ¿cómo lo vamos a
2:10:13poder ver? O sea, no es que hay que
2:10:15probar, le agrego el sustrato. Claro,
2:10:16no. Cuando vos ya comprás este
2:10:18anticuerpo secundario, sabés que es un
2:10:20anticuerpo secundario que te va a
2:10:21reconocer esta partecita de acá atrás de
2:10:25el primario, por ejemplo, eh, que venga
2:10:27de células de ratón ponele,
2:10:31y
2:10:32eh que este anticuerpo está acoplado a
2:10:35tal enzima y entonces vos ya tenés eh eh
2:10:40el sustrato y todo el protocolo para
2:10:41saber cómo revelarlo o que este
2:10:43anticuerpo está acoplado a un fluoróforo
2:10:45de tal color. Y a veces vos querés ver
2:10:47dos proteínas a la vez, por ejemplo.
2:10:50Bueno, me estoy olvidando que estoy en
2:10:51Western Blood, pero también se pueden
2:10:52usar para otras cosas que no sé si vamos
2:10:54a llegar a verlas hoy. unas diapos que
2:10:56tengo dentro de un ratito, si no las
2:10:58veremos eh en la próxima clase, pero
2:11:01esto uno lo puede combinar y entonces a
2:11:03lo mejor miras uno con un floróforo de
2:11:05un color y otra cosa con otro primario y
2:11:08con un secundario que lo reconoce al
2:11:09otro y con un floróforo de otro color y
2:11:11así puedes ir eh jugando y mirar dos
2:11:14cosas a la vez, por ejemplo, o más.
2:11:17Pero vos ya sabés, no es que lo tenés
2:11:19que te lo tenés que poner a probar esto.
2:11:21Cuando vos
2:11:23eh comprás o conseguís este anticuerpo,
2:11:25ya sabés perfectamente cómo lo tenés que
2:11:27revelar. ¿Está bien?
2:11:30Perfecto. Gracias.
2:11:32Genial.
2:11:33Sí,
2:11:36sí. Eh, escuché una pregunta.
2:11:40Eh, hola, ¿se me escucha ahí? Sí, te
2:11:42escucho, te escucho.
2:11:44Eh, tengo una duda. Eh, cada proteína
2:11:48tiene un anticuerpo que va a ser
2:11:50específico a esa proteína, ¿no? O como
2:11:55en eh no siempre tenés disponibles
2:11:57comercialmente anticuerpos para
2:11:59cualquier proteína y a veces tenés
2:12:01anticuerpos que reconocen a una proteína
2:12:04y a otra que no es exactamente la misma,
2:12:06pero que tiene una parte parecida. Y si
2:12:08justo el anticuerpo reconoce esa parte
2:12:10que está en las dos proteínas, no va a
2:12:12ser tan específico para tu proteína.
2:12:14Puer que tenés tu proteína A y la
2:12:16proteína B que tiene todo un pedazo
2:12:18igual y el anticuerpo justo reconoce esa
2:12:20parte que tienen en común, por ejemplo,
2:12:23un dominio que está conservado entre las
2:12:25dos proteínas, ese anticuerpo te va a
2:12:27reconocer tanto la A como la B. Pero vos
2:12:29eso lo deberías saber, esa información
2:12:31la deberías tener. Si ese anticuerpo lo
2:12:34compraste, por ejemplo, o alguien te lo
2:12:35prestó, pero tenés el número de catálogo
2:12:37o algo, te dice, porque ya están
2:12:39probados y te dice, este reconoce tal
2:12:41cosa, pero ojo que también puede
2:12:43reconocer tal otra y tal otra y así.
2:12:47Está bien.
2:12:47Okay, profe, gracias.
2:12:48No, de nada.
2:12:50Bueno, entonces,
2:12:52profe,
2:12:53sí,
2:12:55escuch,
2:12:56eh, una pregunta. Esas enzimas se pueden
2:12:59marcar también como se hizo en el
2:13:01experimento de Hersche y Chase, creo que
2:13:04se los marcaba con algo radioactivo.
2:13:07Creo que era azufre 35 o algo así,
2:13:09pero en ese caso, en vez de marcar a la
2:13:12encima vos directa, o sea, no tiene
2:13:14sentido tener una enzima y que la
2:13:16marques, porque si es una enzima la
2:13:18tenés para poder ver el producto o el
2:13:20sustrato o la luz que salga. Si vos ya
2:13:23tenés algo radioactivo, lo podés ver
2:13:24directamente.
2:13:26Uno podría usar eh digamos diferentes
2:13:30formas de revelar con radioactivo, solo
2:13:32que hoy en día habiendo alternativas que
2:13:34no son radioactivas y son más seguras,
2:13:37uno las prefiere.
2:13:39Ah, claro. Okay, gracias.
2:13:41No, de nada.
2:13:43Bueno, entonces ahora les voy a dar un
2:13:45ejemplo para que terminemos de entender
2:13:47el western con un ejemplo concreto de un
2:13:49experimento. Y de paso aproveché y metí
2:13:54un ejemplo que incluye una modificación
2:13:58postraduccional que además altera la la
2:14:01movilidad electroforética. Así que
2:14:04si lo si me logran seguir este ejemplo
2:14:06ya está buenísimo porque entienden
2:14:08varias cosas de las que hablamos hoy.
2:14:10Entonces
2:14:12a veces pasa que las proteínas, por
2:14:15ejemplo, tienen esta ramita de azúcares
2:14:18o bueno, si tiene todo esto de
2:14:20ubiquitina directamente le cambia el
2:14:22tamaño porque es como que tiene
2:14:24pedacitos, unas proteínas pegadas y
2:14:26entonces esto ya tiene otro tamaño. Si
2:14:28tiene esto que parece como más
2:14:30chiquitito, la verdad es que no es que
2:14:33le cambia sustancialmente el tamaño
2:14:35comparado con toda la proteína,
2:14:39pero o esto, pero lo que puede pasar es
2:14:42que a veces o les cambie la forma y si
2:14:44tiene como una cosa ramificada se
2:14:46enganche un poco más o le cambie la
2:14:48manera en que interactúa el SDS y haya
2:14:50regiones donde el SDS no interactúe
2:14:53tanto o que le cambia. O sea, es
2:14:56impredecible como ciertas modificaciones
2:14:58pueden cambiar o no la movilidad
2:15:00electrética, pero uno tiene que estar
2:15:01atento porque no hay una regla general,
2:15:04no es que siempre que tiene una
2:15:06fosforilación
2:15:07corre menos. A veces no, pero a veces
2:15:10sí. Uno tiene que estar atento a eso y a
2:15:12veces uno lo puede detectar.
2:15:15Por supuesto, si hay una modificación
2:15:16que fue un clivaje proteítico,
2:15:19directamente voy a tener una proteína
2:15:20más chica y claramente le va a cambiar
2:15:22la movilidad, pero porque esa
2:15:24modificación me hizo un péptido más
2:15:25chico. Sí, pero estas otras cambian como
2:15:28por otras razones que a veces son un
2:15:30poco más difíciles de entender el
2:15:33mecanismo por el que está cambiando la
2:15:35movilidad, pero hay que tenerlo en
2:15:37mente. Entonces, les voy a contar un
2:15:39ejemplo que y de paso repasamos varias
2:15:41cositas.
2:15:43Acá tenemos este ligando que es una
2:15:45hormona que se que se llama
2:15:49eh factor de crecimiento epidermal o IGF
2:15:54en la jerga, ¿no? Epidermal grow factor,
2:15:57que
2:15:59a lo mejor alguna célula la lo secreta y
2:16:02otra célula lo recibe, por ejemplo, ¿no?
2:16:04Y y ¿cómo lo recibe? tiene un receptor
2:16:06específico que va a interactuar con con
2:16:09él y cuando interactúa empiezan a pasar
2:16:12cosas, va a empezar a ver como una
2:16:14traducción de la señal, o sea, van a
2:16:16empezar a pasar. Esto va a ser, ya les
2:16:18adelanto, por ejemplo, puede hacer que
2:16:20las células proliferen más.
2:16:23Entonces viene el IGF, ¿está bien? digo
2:16:27IGF, que es EGF, que es el ligando de
2:16:30este receptor y cuando el receptor se
2:16:33llama EGF receptor, ¿sí? Es fácil,
2:16:38aparte se los puse con los colorcitos
2:16:39para que se vayan guiando. Cuando
2:16:42interactúa le empiezan a pasar cosas a
2:16:45la proteína le cambia un poquito la
2:16:47conformación, le cambia la forma y ya lo
2:16:49vamos a ver más en detalle la próxima
2:16:51clase cómo es que cambian esas
2:16:53conformaciones cuando algo interactúa
2:16:54con algo, pero ya se van imaginando que
2:16:57las formas importan y interactuar una
2:16:59cosa con la otra va empezando a hacer
2:17:01cosas. Entonces se dieriza y se produce
2:17:06un cambio que hace que se fosforile esta
2:17:08proteína que es el receptor. O sea, pum,
2:17:11acá tenemos esta modificación que
2:17:12apareció, una fosforilación. Y cuando
2:17:15pasa esto, empiezan a pasar un montón de
2:17:17cosas, ¿se acuerdan? Vienen proteínas
2:17:19que reconocen a esta proteína
2:17:21fosforilada y reconoce a otra y a otra y
2:17:23empiezan a cambiar y llega hasta que
2:17:25empiezan a prenderse genes, a pagarse
2:17:27otros y pasan un montón de cosas.
2:17:30Pero entonces lo que vamos a hacer ahora
2:17:32es tener unas células en cultivo. Sí,
2:17:35este es un dibujito de una placa donde
2:17:37tengo células en cultivo. Acá está como
2:17:40si miráramos con el microscopio y se ven
2:17:42tres células.
2:17:44La línea, estas células se llaman así,
2:17:46A431.
2:17:48Yo ya les voy tirando, son nombres que
2:17:50no tienen ni por qué acordárselos, pero
2:17:51como agarré la figura del paper que
2:17:53ahora les voy a mostrar y empiezan a
2:17:55aparecer esas cosas para que no se hagan
2:17:57lío con los nombres y ya empiecen a ver
2:17:59qué cara tienen las figuras en los
2:18:01papers y eso. Entonces tenemos estas
2:18:04células y a una no les pongo nada y a
2:18:07las otras les pongo, acá está dibujado
2:18:09solo el tip, pero lo pongo todo con una
2:18:11pipeta. Le pongo el estímulo este de IF
2:18:15que lo tengo preparadito en un tubito y
2:18:16lo pongo en solución.
2:18:18O sea, a estas células les doy el
2:18:20estímulo y a estas no. Vamos bien.
2:18:23Entonces, ¿qué va a pasar con el
2:18:25receptor? Con el IGF receptor acá y acá.
2:18:30¿En cuál se va a fosforilar y en cuál
2:18:31no?
2:18:38Perfecto. Acá se va a falar y acá no.
2:18:41Esto que se forma el dímo y eso yo no lo
2:18:43voy a detectar mucho porque como voy a
2:18:45hacer un gel con SDS,
2:18:47si este dímos lo voy a romper, lo voy a
2:18:49disociar. Así que el dímo no me voy a
2:18:51estar enfocando en mirarlo, pero sí voy
2:18:53a mirar, voy a hacer un western para
2:18:56mirar este receptor y voy a usar
2:18:58distintos anticuerpos y ahora les voy a
2:19:00mostrar. Entonces, tenemos las células,
2:19:03una condición y la otra. En los dos
2:19:05casos, cuando ya terminé el tratamiento,
2:19:08lo dejo, no sé, a lo mejor 24 horas o 4
2:19:11horas, no sé, no me acuerdo cómo era
2:19:13este, y cuando terminó
2:19:17saco, extraigo proteínas totales. O sea,
2:19:19imagínense que si eso lo revelo con
2:19:21cumas y nos va a dar todos esos ese
2:19:23patrón de bandas como un montón de
2:19:25rayas, porque son todas las proteínas
2:19:27que hay en la célula. Pero yo no quiero
2:19:28ver todas las proteínas, yo quiero ver
2:19:30qué le pasó al receptor de IGF.
2:19:33Entonces voy a hacer un western blot,
2:19:35que ya no les voy a decir todos los
2:19:36pasos, pero empezaba teniendo primero el
2:19:38SDS page. Después transfiero la membrana
2:19:41y después revelo. ¿Y con qué revelo? Voy
2:19:44a revelar
2:19:46con un anticuerpo que reconoce
2:19:50el ISIF receptor total. O sea, total
2:19:54quiere decir que no importa si está
2:19:56fosforilado o no está fosforilado, el
2:19:58anticuerpo lo reconoce porque lo debe
2:19:59reconocer en otro lugarcito donde ni se
2:20:01entera si está fforilado o no. Sí lo
2:20:05puedo reconocer con el an con el
2:20:07anticuerpo que reconoce el total
2:20:11o voy a tener otra herramienta más que
2:20:12dentro de un ratito se las muestro. Y
2:20:15fíjense lo que pasó acá. ¿Qué qué es
2:20:17esta calle con varias rayas?
2:20:22El marker.
2:20:23El marker. Perfecto. Y acá tenemos chun.
2:20:27En las células A431, donde no le puse
2:20:30nada, pasó una cosa y en las células
2:20:32A431 a las que les puse el IEF,
2:20:36veo que no es la banda en el mismo
2:20:38lugar.
2:20:41Esta banda es el receptor de IF. Y acá
2:20:43estoy viendo que cuando le hago un
2:20:45estímulo, cuando le hago el estímulo con
2:20:47IF,
2:20:49ya se sabe. En realidad esto no es que
2:20:50lo están demostrando en este paper, pero
2:20:53es una figura que aproveché para
2:20:55mostrárselas a ustedes. El paper mostró
2:20:57otras cosas más, pero ya se sabía que se
2:20:59produce una fosforilación en un lugar en
2:21:02particular que es la tirosina 1148
2:21:05del receptor.
2:21:07Y cuando le pasa eso, chuc, se retrasa
2:21:11un poquitito. Y no es que se retrasa
2:21:13porque ahora está más grande, porque de
2:21:14ninguna manera es eh impacta en el
2:21:17tamaño esa fosforilación. Fíjense el
2:21:19tamaño que tiene. Si ya de por sí tiene
2:21:21una tirosina 1148.
2:21:24Por otra razón se retrasa la se ve que
2:21:28la banda tiene menos movilidad. Pero
2:21:30bueno, acá estoy viendo al al ver este
2:21:33cambio, este retraso en la movilidad o
2:21:35esta banda con menos movilidad, estoy
2:21:36viendo un efecto. Y fíjense esto. y a la
2:21:41misma membrana.
2:21:44Yo puedo hacer la misma membrana y que
2:21:45le hago un tratamiento, que le saco el
2:21:46anticuerpo o puedo correr eh otras
2:21:50calles igual y hacer otra membrana por
2:21:53separado. Pero ahora las proteínas estas
2:21:55mismas exactas, hago un western blood
2:21:58que en vez de revelarlo con un
2:22:00anticuerpo def receptor total, o sea,
2:22:04independientemente si está fosforilado o
2:22:05no, reconoce solo alf receptor cuando
2:22:10está fosforilado en la tirosina 1148. O
2:22:14sea, es un anticuerpo que va a
2:22:15reconocerlo solo si pasó esto.
2:22:18Fíjense qué pasa. ¿Qué veo?
2:22:23Solo banda en esta calle. ¿Se dan
2:22:26cuenta? ¿Por qué no veo banda acá?
2:22:29Porque no está la proteína esta. Sí
2:22:33está, pero no está fosforilada.
2:22:34Entonces, el anticuerpo no la reconoció.
2:22:37¿Se dan cuenta?
2:22:40¿Lo entendieron?
2:22:40Sí, sí,
2:22:42sí, sí.
2:22:43Bien, estamos.
2:22:45Perfecto. Bueno, entonces con esto
2:22:47terminaron de ver qué pinta tiene un
2:22:50western. Vieron que es bastante distinta
2:22:52a un gel tenido con kumas y que tenemos
2:22:54un montón de bandas. Cuando el
2:22:55anticuerpo es bueno, uno ve una banda
2:22:58sola. A veces el anticuerpo no es tan
2:22:59bueno y uno ve más de una banda y dice,
2:23:01"Mm, esta banda es medio inespecífica."
2:23:04Pero y de paso pensamos un experimento
2:23:07como en células. ¿Y qué hago con las
2:23:09células? Traigo todas las proteínas y a
2:23:11las proteínas esas las pongo en un
2:23:13buffer de siembra, las siembro en un
2:23:15gel, transfiero una membrana y las
2:23:18revelo que las puedo revelar con un
2:23:19anticuerpo o con otro anticuerpo.
2:23:24Entonces, un paréntesis, ¿se dieron
2:23:26cuenta
2:23:28a qué se parece esto? Tenemos el ISF,
2:23:34siento perdón, me estaba entrando el
2:23:37teléfono con el parlante acá.
2:23:40Tenemos Elif
2:23:42interactuando.
2:23:49Uy, me llevé el teléfono lejos. Ahora no
2:23:51voy a saber la hora.
2:23:53El Después me avisan cuando son las 9
2:23:55por
2:23:57el IGF interactuando con su receptor
2:24:01que produce que se diericen, produce que
2:24:03se fosforilen y después empiezan a pasar
2:24:05cosas. Se parece de vuelta a esto, ¿no?
2:24:07De las distintas palabras formando una
2:24:10oración. ¿Quiénes son las distintas
2:24:12palabras? En este caso
2:24:15las distintas proteínas y que les están
2:24:17pasando distintas cosas, ¿no?
2:24:20Bueno, ¿cómo estamos? Bueno, tengo que
2:24:22ir a agarrar mi teléfono por no ver
2:24:268.
2:24:28Vemos aunque sea electroforesis nativa.
2:24:30Aguanto 10 minutitos más y cerramos esta
2:24:32parte.
2:24:34Dale.
2:24:35Sí, profe,
2:24:36vamos. No sé si llegamos a terminar toda
2:24:39la clase. Nos van a quedar unas cosas
2:24:40para el sábado, pero por lo menos
2:24:42avanzamos, terminamos con la parte de
2:24:44electrofores.
2:24:51Eh, les había dicho que también podíamos
2:24:53hacer una electroforesis
2:24:57eh, manteniendo la forma y la carga
2:25:00propia de la proteína. Y ahora sí.
2:25:02Entonces, y esa puede ser informativa,
2:25:05esa esa
2:25:07eh
2:25:09este tipo de electrofóresis nos puede
2:25:11permitir saber, por ejemplo, qué carga
2:25:14tiene una proteína en sus condiciones
2:25:16nativas, cosa que cuando yo la pongo con
2:25:18SDS, si tenía alguna carga quedó
2:25:22enmascarada por esa cantidad enorme de
2:25:24SDS que habíamos puesto. ¿Sí?
2:25:26Entonces, eso es una electroforisis un
2:25:29poco distinta donde se hace como en un
2:25:30dispositivo diferente y se siembra como
2:25:36eh en el medio, no se puede sembrar en
2:25:38un extremo porque ahora tengo que
2:25:39permitir que pueda correr para
2:25:40cualquiera de los dos lados. ¿Sí?
2:25:43Entonces,
2:25:45en este caso, por ejemplo, tenemos acá
2:25:47se está indicando el origen de siembra,
2:25:50que en los otros casos ni se indicaba
2:25:51porque siempre en el mismo lugar, pero
2:25:53en este caso el origen de siembra está
2:25:54en el medio, entonces la proteína puede
2:25:56migrar para un lado o para el otro. En
2:25:59este caso, migró para el polo positivo.
2:26:02Entonces, ¿qué carga tiene esta
2:26:04proteína?
2:26:06Negativa.
2:26:06Negativa.
2:26:07Negativa. Sí. Y fíjense que acá
2:26:10aclaramos que este gel no tiene ni SDS
2:26:13ni betamar capto y que está corrido a
2:26:15pH7.
2:26:17¿Por qué está aclarado el pH? Importa el
2:26:19pH al que está corrido en el que está la
2:26:22proteína.
2:26:25Sí, porque si está un pH alto.
2:26:29Eso
2:26:30bien. Ahí vi que varios varios
2:26:32contestaron y está todo bien por ahí. va
2:26:35la tienen esa idea justamente a
2:26:37diferente pH va a tener distinta carga y
2:26:41eso va a depender de de cada proteína,
2:26:43¿no? Es que todas las proteínas tienen
2:26:45la misma carganeta tal pH, ¿no? Por
2:26:47ejemplo, fíjense, acá tenemos una curva
2:26:50donde representamos
2:26:52la carga que tiene una una proteína en
2:26:55función del pH. Acá en esta línea está
2:26:58el cero y tenemos entonces para acá
2:27:02cuando las curvas están acá arriba es
2:27:04que la proteína tiene carga positiva.
2:27:06Cuando está para acá abajo es que tiene
2:27:07carga negativa. Y entonces en esta curva
2:27:11azul está representada una proteína que
2:27:13se llama lisosima. Y quiere decir que
2:27:16esta lisosima siempre tiene carga
2:27:19positiva. Siempre tiene carga positiva y
2:27:21recién a pH11
2:27:22se pone neutra y ahí se pone negativa
2:27:25más allá. En cambio, por ejemplo, la
2:27:27mioglobina tiene carga positiva, tiene
2:27:30carga positiva y acá pH7 se pone neutra
2:27:34y a pHs más altos tiene carga negativa,
2:27:37¿se dan cuenta? Y así uno puede tener
2:27:40estas
2:27:41igual también importa
2:27:45también importa por el tema de la
2:27:47desnaturalización, ¿no?
2:27:50También importa cómo corra por el tema
2:27:51de la desnaturalización. Perfecto. O
2:27:54sea, va acá va a afectar su tamaño, su
2:27:57carga y su forma, pero
2:28:01lo eh una de las cosas que bueno, o sea,
2:28:05la forma y la carga se pierden en un SDC
2:28:08page y este me va a permitir ya, aunque
2:28:11no la compare con nada, ya sabiendo para
2:28:13qué lado corrió, puedo saber a SPH y qué
2:28:16carganeta tiene. Después de la forma
2:28:19mucho no voy a poder decir y del tamaño
2:28:21puedo llegar a decir algo cuando empiece
2:28:23a comparar con otras cosas. Si
2:28:27no más mirando la sola, ya puedo saber
2:28:29qué carga tiene, que todos me lo
2:28:31dijeron. Perfecto. ¿Lo ven?
2:28:36Eh, y ahora justo venía una parte,
2:28:39empezamos a hablar de otras técnicas y
2:28:40no sé si meterme con eso. Sí,
2:28:44ahí la figura cuando dice sin MSH,
2:28:48nosotros habíamos visto BSH.
2:28:50Ah, claro. Acá me apareció una
2:28:52abreviatura nueva que yo no se las había
2:28:54contado. Es es el mismo beta
2:28:57merctoetanol, pero que en este caso le
2:28:59pusieron mercto etanol. En realidad el
2:29:02el término que está bien es decir beta
2:29:03mercaptotanol, pero ahí eh está
2:29:07abreviado distinto. Otra cosa que voy a
2:29:09corregir antes de mandárselas en esa
2:29:11diapo les voy a poner BSH en vez de MSH.
2:29:17Perdón, una pregunta,
2:29:18una abreviatura que no les había
2:29:19definido. Gracias por notarlo.
2:29:23Ah, y lo otro que tenía que agregar era
2:29:26eh el azul de bromofenol en el buffer de
2:29:29siembra. Así ya. queda puesto en la
2:29:31diapo.
2:29:34Bueno, no creo ahora viene toda una
2:29:36parte que empieza una partecita un poco
2:29:38más larga que siendo las 9 men5 o no sé
2:29:42qué hora es, 9 men4 minutos, no tiene
2:29:45sentido que la arranquemos. Así que
2:29:49creo que vamos a dejar acá e
2:29:53no sé si alguien tiene alguna pregunta.
2:30:00E sí, profe.
2:30:03Eh, yo no entendí muy bien el
2:30:05experimento del EGF, o sea, a lo último.
2:30:09¿Qué pasaba a lo último?
2:30:11Ah, perfecto.
2:30:12O sea,
2:30:13comparto de vuelta. Si te lo explico
2:30:14sobre el eh sobre la DIAP.
2:30:18Sí, la última parte, porfa, porque no
2:30:19entendía como muy bien la conclusión.
2:30:22Perfecto, perfecto.
2:30:23Gracias.
2:30:25No, pero espérate que comparto otra vez
2:30:27un segundito.
2:30:30Eh, estoy compartiendo. Sí,
2:30:35sí,
2:30:36sí.
2:30:38Perdón. Eh, me voy para atrás
2:30:42acá.
2:30:45Eh, lo que pasaba era que si tratamos
2:30:48este experimento son dos calles que
2:30:52corresponden a extractos de células en
2:30:55distintas condiciones. Unas son las
2:30:57células a las que no les hice ningún
2:30:59tratamiento y otras son las células a
2:31:02las que les puse ISIF, que es el
2:31:04estímulo de este estímulo que les conté
2:31:07que produce que su receptor se dierice y
2:31:11se fosforile. Estamos bien. hasta acá.
2:31:14En realidad estas células no es que no
2:31:15le hice ningún tratamiento. En general
2:31:17la condición control suele tener el
2:31:20mismo tratamiento. Por ejemplo, si el
2:31:22IGF eh viene disuelto, no sé, en
2:31:25solución fisiológica, a estas células le
2:31:28pongo el mismo volumen de solución
2:31:29fisiológica, pero sin el IGF, por
2:31:31ejemplo, ¿no? Entonces, estas células
2:31:34son la condición control sin el
2:31:36tratamiento y acá son las condición con
2:31:38el estímulo. Y entonces, una vez que
2:31:41extraigo las proteínas de esta y de
2:31:43estas, no, acá hay un tubito y acá hay
2:31:45otro tubito, a cada una de ellas las
2:31:47corro en una calle de un gel y después
2:31:50en vez de teñir las proteínas totales
2:31:52hago un western blood.
2:31:54Si lo revelo con un anticuerpo que
2:31:56reconoce al isf receptor, acá dice
2:32:00total, pero total quiere decir que es
2:32:02tanto al que no está fuforilado como al
2:32:04que está fuforilado.
2:32:06Veo banda en las dos calles, solo que la
2:32:09que veo acá está un poquitito más
2:32:11arriba. Entonces, lo que ya sé es que
2:32:17este algo le pasó que corre distinto. La
2:32:20realidad es que ya se sabe que ante el
2:32:23estímulo se fosforila en un aminoácido
2:32:26en particular que es esta tirosina y eso
2:32:29le retrasa la movilidad, corre un
2:32:31poquito menos. Por eso que les decía que
2:32:34las diferentes modificaciones
2:32:35postracionales pueden afectar la
2:32:36movilidad electroforética por distintas
2:32:38razones.
2:32:40¿Está bien? Y acá en este otro caso, en
2:32:44vez de revelar la membrana con el
2:32:47anticuerpo, que lo reconocía alf
2:32:49receptor, ya sea fosforilado o sin
2:32:51fosforilar, lo revelo con un anticuerpo
2:32:53que solo lo reconoce cuando está
2:32:54fosforilado. Entonces, acá veo la banda,
2:32:58pero acá no, porque acá no eh eh si bien
2:33:02está la proteína, está sin fosforilar y
2:33:04el anticuerpo es tan específico que solo
2:33:06lo reconoce cuando está fosforilado.
2:33:08¿Está bien? Entonces, no es que este
2:33:11experimento tiene una conclusión, porque
2:33:12en realidad en esta calle, en en esta
2:33:14figura solo están mostrando algo que ya
2:33:16se sabía, pero imaginemos que
2:33:20que no se sabía que el estímulo producía
2:33:22la fosforilación, uno podría demostrarlo
2:33:25acá. O si uno no sabe si en estas
2:33:26células eso pasaba, con esto uno lo
2:33:28puede estar viendo. ¿Está bien?
2:33:33Sí, profe, creo que no, o sea, se me
2:33:34había trabado la parte en el que, o sea,
2:33:36después se hacía, o sea, otro western
2:33:39con el, o sea,
2:33:40con este otro anticuerpo.
2:33:42Claro, con el otro anticuerpo que sí
2:33:44reconoce el fosforilado. Entonces, no
2:33:45entendía, digo, o sea, por qué en el
2:33:47otro sí aparece acá, acá les dejo el
2:33:49cartelito que el western puede ser
2:33:51revelado con dos anticuerpos diferentes.
2:33:54Este o acá dice o capaz me quedó medio
2:33:57raro y no se ve mucho este que reconoce
2:34:00total revelado con anticuerpo que
2:34:02reconoce el IGF receptor total o el IGF
2:34:06receptor fosforilado en tirosina 1148.
2:34:10La realidad es que uno podría a esta
2:34:13misma membrana hacerle como un
2:34:15tratamiento que se llama stripping, pero
2:34:18no importa como como desnudado,
2:34:21eh, y sacarle el anticuerpo que le había
2:34:26puesto este anticuerpo y ponerle el
2:34:28otro. O uno podría tener varias calles
2:34:32de total si vienen del mismo tubito de
2:34:35proteínas corre varias calles debería
2:34:38para para poder comparar eh qué está en
2:34:41un lado y que está en el otro también
2:34:42sirve. Y entonces en un caso uno agarra
2:34:45la membrana, la corta con una tijera y
2:34:48incuba una parte con un anticuerpo y la
2:34:51otra parte con el otro. No puede hacer
2:34:53eso también. Está bien.
2:34:56Gracias, profe.
2:34:57No, de nada.
2:34:59Bueno, ahora sí vuelvo a dejar de
2:35:01compartir o puedo hacer esto, puedo ir
2:35:04un segundo a la última de apo esta y
2:35:07comparto esa que es la que no se la
2:35:09llevo a mostrar nunca.
2:35:13Sí,
2:35:13profe, eh una pregunta que no me quedó
2:35:16claro, el tema del pH, eh, se elige que
2:35:20sea neutro
2:35:21por justamente por esto de que cada
2:35:23proteína va a tener un pH diferente o
2:35:27para que no modifica buenísima tu
2:35:28pregunta. Está buenísima tu pregunta. No
2:35:30se elige neutro. En realidad uno puede
2:35:33hacer a distintos pHs, uno podría hacer
2:35:37eh eh una una electroforesis nativa a un
2:35:41pH, otra otra otra otra y vas viendo
2:35:43cómo cambia la movilidad y ahí podés
2:35:45aprender más sobre tu proteína y decir,
2:35:47"Uy, ya en este pH ni se mueve para
2:35:49ningún lado." Y ahí le encontraste el pH
2:35:51donde está neutra, que de hecho tiene un
2:35:53nombre eso y se llama punto
2:35:54isoeléctrico, el pH al que la proteína
2:35:56está neutra. O sea, ese que yo les
2:35:58mostré ahí de ejemplo estaba a un pH,
2:36:00pero no es que siempre se hace a tal pH.
2:36:02Lo que uno tiene que saber es a qué pH
2:36:04está hecho, porque si vas a decir, "La
2:36:06proteína tiene tal carga", tenés que
2:36:08decir tiene tal carga a este pH.
2:36:11Okay. Entonces, o sea, si es neutro,
2:36:16como que depende la carga, vas a saber
2:36:18si es neutro o no el pH.
2:36:20Espérate, párate que vuelvo a esa diapo
2:36:22y ahí les muestro bien,
2:36:25¿eh?
2:36:26Me perdí. Acá está
2:36:33esta misma este mismo gel
2:36:38eh, que está acá corrido a pH7 y y todos
2:36:41me dijeron rebién, ah, mira, pH7 quiere
2:36:44decir que la proteína es negativa a ese
2:36:46pH porque fue para el polo positivo. Sí,
2:36:50si ahora tuviese otro igual, pero en vez
2:36:52de ponerlo a pH7, lo pongo. A ver,
2:36:56imaginemos esta proteína que sea
2:36:58negativa pH7.
2:37:00Bueno, justo no tenemos ninguna, pero
2:37:02imaginemos que es casi esta, ¿no?
2:37:07Imaginemos que ahora lo corremos a pH 4.
2:37:12Esta misma se va a quedar positiva y va
2:37:14a migrar para el otro lado, ¿entendés?
2:37:16Entonces uno puede hacer distintos.
2:37:19Este mismo podría ser un problema que
2:37:22podría inventarme en este momento
2:37:23estilo, yo ahora les dibujo, les puedo
2:37:26dar estas curvitas así y ustedes saben a
2:37:29qué pH está neutra y les puedo decir,
2:37:32mué lado corre en cada caso. Y entonces
2:37:36les pongo un pH acá, acá les pongo, por
2:37:39ejemplo, pH11. Otra que diga pH.
2:37:43Hagámoslo, hagamos el ejercicio para la
2:37:45mioglobina.
2:37:47Si este gel, si este está corrido a
2:37:49pH10,
2:37:51¿para qué lado va a correr?
2:37:56Para el positivo.
2:37:57Claro, va a tener carga negativa, va a
2:37:59correr para el positivo. Genial. Ahora
2:38:00pongo un dibujito acá al lado que en vez
2:38:02de decir pH10 diga pH7.
2:38:06¿Para dónde va a correr?
2:38:10Casi que no
2:38:11no va a correr, no va a correr porque
2:38:13está neutra. Justamente
2:38:15una un requisito para que las partículas
2:38:17se puedan separar y puedan migrar en un
2:38:19campo eléctrico es que tengan carga.
2:38:21Entonces, si yo lo hago a pH7 para esta,
2:38:25no va a correr porque está neutra. Y
2:38:27ahora si lo hago a pH4, pongo otro otro
2:38:30acá que diga pH4,
2:38:33¿qué carga va a tener? Positiva.
2:38:35Entonces, ¿para qué lado va a correr?
2:38:36Para el otro. negativo, ¿se dan cuenta?
2:38:40Entonces, uno así
2:38:42corriendo un gel nativo a diferentes
2:38:45pHs, uno puede ir teniendo una idea de
2:38:48cuál es la carga neta que tiene a cada
2:38:50pH y así uno podría ver cuál es el pH
2:38:53donde está neutra y entonces ahí sacar
2:38:55el punto eléctrico, por ejemplo.
2:38:58Okay, perfecto, ya entendí.
2:39:01Perfecto.
2:39:01Sí, gracias.
2:39:03Bueno, buenísimo.
2:39:05Entonces,
2:39:07¿alguna otra duda que tengan?
2:39:10A mí me quedó una duda
2:39:13de eh en la electroforis, eh cómo
2:39:16distinguir o o de qué depende el usar eh
2:39:20la forma, o sea, en la forma nativa o en
2:39:24cuando se modifica la estructura de la
2:39:27proteína, o sea, en qué caso. No, eso eh
2:39:30las diferentes técnicas que vayamos a
2:39:32ver, que de hecho me quedaron un montón
2:39:34para contarles el sábado, uno las va a
2:39:36elegir según cuál sea la pregunta que
2:39:38uno tenga. O sea, si vos querés
2:39:40averiguar el peso molecular, no te
2:39:42conviene hacer una nativa porque no lo
2:39:44vas a poder sacar, te conviene hacer un
2:39:47un SDS page. Ahora, si vos querés
2:39:49averiguar qué carga neta tiene, en el
2:39:51SDS Page, no lo vas a poder averiguar. A
2:39:53lo mejor vos querés averiguar todo,
2:39:54entonces vas a tener que hacer distintas
2:39:56cosas y después armá un poco tu
2:39:59rompecabeza con la información que vayas
2:40:00sacando de cada uno, que eso es lo que
2:40:02en general hacemos en ciencia. Vamos
2:40:04haciendo distintos experimentos y
2:40:06tenemos que saber qué información nos da
2:40:08cada uno y a lo mejor hay experimentos
2:40:11que ni nos interesa hacer porque no no
2:40:13son necesarios para nuestra pregunta.
2:40:15¿Está bien?
2:40:16Okay, perfecto. Gracias.
2:40:18No, de nada. Buenísimo,
2:40:21profe. Siempre las proteínas tienden a
2:40:23disminuir su valor de carga cuando
2:40:26aumente el pH o cómo es,
2:40:29porque en la gráfica que mostraste un
2:40:31rato bajaban siempre.
2:40:32Claro. ¿Qué es lo que pasa? En realidad,
2:40:35cuando cambia el pH, lo que está
2:40:36cambiando es la concentración de
2:40:38protones del medio, ¿no? Y entonces
2:40:40tenemos eh los quiénes son los eh los
2:40:46aminoácidos que van a definir si cómo va
2:40:48a ser la carga de la proteína. Los
2:40:50aminoácidos que se pueden protonar o que
2:40:52se o que pueden liberar protones.
2:40:55Entonces, según la cantidad de protones
2:40:57que haya en el medio, que eso es
2:40:58justamente el pH, los diferentes
2:41:01aminoácidos se van a ir protonando o
2:41:03desprotonando y a lo mejor tenés algunos
2:41:05que se empezaron a protonar u otros que
2:41:08todavía no y así tenés un balance de qué
2:41:10es lo que está pasando, pero a medida
2:41:12que tenés un pH más bajo se van a ir
2:41:15protonando más aminoácidos, por eso es
2:41:17que cambia siempre para el mismo lado.
2:41:20¿Está bien?
2:41:22Sí, muchas gracias. Me había olvidado
2:41:23que era el pH, por eso es como que
2:41:25no. Perfecto. Pero aparte de eso depende
2:41:27mucho de cuán fresco tienen lo de
2:41:29química, si ya cursaron o no. Y entonces
2:41:31hay cosas que a lo mejor uno las da por
2:41:34no las tienen tan frescas porque eh
2:41:36capaz todavía no cursaron química
2:41:38inorgánica y no se acuerdan mucho lo del
2:41:40CBC, así que no hay problema, preguntan
2:41:42todo lo que necesiten.
2:41:45Muchas gracias.
2:41:47No, de nada.
2:41:48Bueno, entonces nos vemos el sábado,
2:41:51chicos.
2:41:53Pregunta más técnica, profe.

About this transcript

This page contains the full transcript of T5 IBMC_2026_1c Proteínas 2 Alejandra Guberman (virtual) by Alejandro Colman-Lerner, generated from the public captions YouTube serves with the video. The transcript has 25,782 words across 4,100 segments, with the original timestamps preserved so you can click any line to jump to that moment in the embedded player.

What you can do with it

Use the transcript to take notes, quote the speaker, build a study guide, generate a summary with ChatGPT or Claude via the YouTube Summary tool, or export it as a timed subtitle file with YouTube to SRT. You can also re-open it in the transcriber to choose a caption track available on the video.

Free YouTube transcript tool

YouTube2Text is a free YouTube transcript generator — no signup, no daily limit. Paste any YouTube link and get the full transcript instantly, with timestamps, click-to-jump, caption language selection, AI prompts for ChatGPT, Claude, and Gemini, and exports to TXT, SRT, VTT, or Markdown.