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T18 IBMC 2026 2c Ingenieria Genetica 3 ACL — Transcript

by Alejandro Colman-Lerner · 15,543 words · 2,679 segments · language en · Watch on YouTube

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0:00Empezamos. Bueno, esta es la última
0:02clase de la parte ingeniería genética y
0:05es la última clase que va para el tema
0:08del parcial. El jueves y el viernes hay
0:11dos clases de membrana que las pusimos
0:13suficientemente separadas del parcial
0:17para que vengan a las clases esas,
0:20¿okay? No se pierdan esas clases que
0:22van, si bien van para el segundo
0:23parcial, no estaría bueno que venga Omar
0:25a agarre clase y ustedes no vengan.
0:27Okay. Y aparte, ¿vale? la pena porque
0:30son temas para el parcial,
0:31o sea, el primer parcial entra hasta
0:34el primer parcial entra hasta hoy.
0:36Perfecto.
0:37Okay. Más los seminarios. Los seminarios
0:40sí siguen hasta el último seminario que
0:42es la clase de repaso antes del parcial.
0:45Bueno,
0:49okay. Acá les recuerdo de lo que hemos
0:52hablado todos estos días. Sí, tenemos
0:55plástmidos circulares que tienen algunos
0:58elementos indispensables que nos
1:00permiten crecerlos en bacterias. ¿Cuáles
1:02son?
1:04El ori este PUC Origin. ¿Qué más?
1:08Promotor.
1:10El promotor es indispensable,
1:12¿no?
1:13No para que se replique el plástmido.
1:15¿Qué otro elemento es indispensable?
1:19La resistencia al antibiótico.
1:22Si pongo de acá.
1:25Sí. Y esto que dice acá, BL promoter es
1:28el promotor de la beta lactamasa, que es
1:31la enzima codificada por el gen AMP R. O
1:36sea, acá bien podría haber dicho AMP R
1:38promoter, es lo mismo.
1:42¿Qué más tiene este plácido?
1:47Tiene acá unos sitios de restricción que
1:49no están marcados. Acá dice MCS, esta
1:52flecha de acá está puesto con una
1:54flecha. En realidad no es una flecha. La
1:57flecha en general indica que algo tiene
1:58una dirección. Los sitios declonados son
2:00sitios de corte de encima de
2:02restricción.
2:04Y acá tiene un promotor, CMB promoter.
2:08Es un promotor de el virus de el
2:11citomegalovirus.
2:13es un virus de células de mamífero.
2:16Entonces, si yo clono acá un gen, ¿dónde
2:21se va a expresar?
2:25Cuando lo meta en una lo meta en una
2:26bacteria, se va a expresar y no
2:29no porque es un promotor eucariota,
2:31entonces se va a expresar en células
2:33eucariotas. Como es un virus de
2:35mamífero, se va a expresar en mamíferos.
2:37Este es un promotor muy fuerte y que se
2:39expresa en todas las células.
2:42Sí, recordamos por qué los genes puede
2:45ser que se expresen en todas las células
2:47o en algunas células
2:50transcripción.
2:51Los factores de transcripción que ¿qué?
2:52Que se expresan en esas células.
2:55Entonces, si este promotor, yo te digo
2:56que se expresa en todas las células,
2:58¿qué debe tener acá?
3:00[carraspeo]
3:00Factores.
3:02Factores de transición.
3:03No tiene factores de transición.
3:05Una secuencia en cáncer que reacciona.
3:06Tiene secuencias que interactúan, no
3:11reaccionan. interactúan con algo a nivel
3:14constitutivo,
3:15interactúa con factores de transcripción
3:18que están presentes en todas las células
3:21o una combinación de factores de
3:23transcripción, están en unas células o
3:24están en otras células, pero siempre
3:25alguno va a ver. Bien. Okay.
3:30Fíjense que aparte tiene una cosa que
3:31dice acá T7 primer y acá dice, no, este
3:36primer. Bueno, ¿qué quiere decir esto?
3:39que ahí hay una secuencia de un primer
3:41que la gente usaba un montón. Entonces,
3:44ya les avisan que en este plásmido que
3:45es comercial, ahí van a tener una
3:47secuencia que si ustedes tienen un
3:48tubito con con el primer, la secuencia
3:50del primer que se llama T7 porque viene
3:53de un la secuencia del arteriófago T7 de
3:55coli, van a poder usar ese primer acá si
3:58quieren hacer una PCR, por ejemplo.
4:03Okay. Bueno, lo otro que recordamos acá
4:06es que si un promotor está acá, ya sea
4:08bacteriano, como dice acá, o de células
4:10animales, eucariótico, por ejemplo, lo
4:13que uno vaya a clonar tiene que tener la
4:15dirección correcta. Si el ATG quedó al
4:17revés clonado, no se va a poder
4:19expresar. Se tiene que leer la cadena
4:21molde, ¿sí? Para que se copie y sea
4:25igual a la cadena codificante. ¿Sí?
4:28Bien. ¿Alguna pregunta de esto que lo
4:31vimos 50 veces ya?
4:36Bueno, entonces en las clases de Marcelo
4:39de la semana pasada ustedes vieron cómo
4:42se hacen animales transgénicos, ¿se
4:44acuerdan? Sí. Se utiliza un fragmento de
4:50ADN que se microinyecta
4:53en óvulos fecundados, en el pronúcleo y
4:57eso se integra en dónde, al azar, en
5:00alguna parte del genoma. Sí.
5:04Y eso servía para montones de cosas. Sí,
5:07Marcelo explicó bastante de ese tema.
5:11Ahora, lo que voy a explicar hoy es cómo
5:14se hacen. Voy a volver a explicar
5:15algunas cosas que ya expliqué y vamos a
5:17adentrarnos un poco en cómo hacemos
5:19células o animales que sean knockout de
5:23algún gen o que tengan un knock ining.
5:26¿Cuál es la diferencia si entre knockout
5:30y no?
5:33El knockout es el procedimiento para
5:37inactivar un gen.
5:40Si yo quiero sacar un gen de una célula
5:43o un animal, lo que voy a hacer es un
5:46knockout. tengo que de alguna manera
5:48ingeniármelas para arruinar el genio.
5:53Lo usual es hacer algo que le cambie el
5:56marco de lectura, lo más río arriba en
6:00la secuencia posible para que quede bien
6:02arruinada toda la proteína, porque si
6:04hago una modificación
6:06en el C terminal, por ahí la proteína,
6:08toda la primera parte se hace bien y la
6:10proteína funciona. Lo que yo quiero es
6:12al inactivar el gen que no se genere el
6:15producto del gen. Si es un gen
6:17codificante para proteínas, que no se
6:18haga la proteína.
6:21¿Okay? ¿Qué otra forma se les ocurre a
6:23ustedes que pueden hacer para arruinar
6:25un gen?
6:30Cambiar el la secuencia de los
6:32instances.
6:33Arruinar el promotor.
6:36Eso sería sí. Sacar el promotor, eso es
6:39otra forma. Si no tiene promotor, no se
6:41va a expresar.
6:42Yo me refería a cambiar a los infanes
6:44para que no se exprese ahí. Eso es una
6:46cosa más sutil. No es que lo arruino al
6:49gen, sino que le cambio el lugar de
6:51expresión. Eso también lo puedo hacer,
6:53pero en general cuando hago un knockout,
6:56lo primero que quiero hacer es inactivar
6:58completo el gen. Por ejemplo, me quiero
7:00preguntar si el gen X tiene alguna
7:02función en los ratones.
7:05Entonces lo saco directamente, lo
7:07arruino,
7:11¿no?
7:14Otra forma de arruinar un gen,
7:17eliminar el codón de iniciación para la
7:19traducción.
7:21Es parecido a cambiar el marco de
7:22lectura.
7:24Le saco el marco de lectura.
7:27Ojo que si sacas la metionina inicial
7:29puede ser que encuentre una metionina
7:31más abajo y que en realidad le falte
7:32solo un pedacito de la proteína.
7:34Si quedó justo la otra meteoronina en el
7:36mismo arco de lectura,
7:38lo que puedo hacer es insertar otro gen
7:41en el medio de donde estaba el gen.
7:45O puedo también reemplazar el gen
7:48completo por un otro gen.
7:52Sí, por ejemplo, un gen que tenga la
7:55selección para un antibiótico o
7:56eucariótico si quieren.
8:00Okay. Entonces, esas son las formas en
8:02las que puedo hacer knockouts. Ahora, si
8:05lo que quiero hacer es un knock in,
8:07cuando decimos knock in, lo nos
8:10referimos a que lo que queremos hacer es
8:13dirigir
8:14específicamente
8:16una modificación genética en un lugar en
8:19particular. Sí,
8:23no es al azar,
8:26es en un lugar en particular y la
8:28modificación genética es la que yo
8:29quiero hacer, que puede coincidir con
8:32hacer un knockout, o sea, yo puedo hacer
8:34un knockout con una técnica de noin.
8:39¿Me explico?
8:44Por ejemplo, si quiero saber en dónde
8:46está localizada o en qué eh células se
8:50expresa una proteína, si le agrego en el
8:53carbox terminal, o sea, en la zona tres
8:55prima, el gen de una proteína
8:57fluorescente,
8:58¿sí?
9:00Que saque el codón stop natural y que
9:02continúe entonces en la proteína
9:04fluorescente que a su vez va a tener su
9:05propio codón stop, ¿qué va a pasar?
9:11quedar como dos proteínas,
9:12va a quedar una proteína fusión,
9:15va a quedar la proteína natural y
9:17después en vez de terminar va a seguir
9:20la proteína fluorescente.
9:23Eso a veces la en general las proteínas
9:26no les molesta que les cuelgue una
9:28proteína fluorescente, pero podría ser
9:30que sí. Mientras no lo evalúe, no lo sé.
9:34Voy a apostar primero que no pasa nada y
9:36después si veo qué pasa hago alguna otra
9:39estrategia. O sea, la proteína por ahí
9:41tiene 50 kg y ahora en vez de terminar
9:44le sigue una cola que pesa 27 kg como
9:47una proteína fluorescente verde.
9:49Pero, ¿qué va a pasar? A todos los
9:51lugares donde vaya la proteína va a ir
9:52la proteína fluorescente. Entonces, voy
9:55a poder saber en qué parte de la célula
9:57está y aparte voy a ver qué tejidos
9:59están verdes y qué tejidos no. Entonces,
10:01así puedo saber dónde se expresa una
10:03determinada proteína.
10:07También puedo reemplazar una parte de la
10:09proteína por otra. Por ejemplo, si tengo
10:12un dominio de una proteína en un ratón y
10:16quiero saber si el dominio en la
10:18proteína homóloga humana tiene la misma
10:20función, puedo decidir reemplazar ese
10:23dominio que por ahí es uno o dos hexones
10:25por uno o dos hexones de el gen humano.
10:30Los tengo que reemplazar. Sí, eso es una
10:33intervención dirigida y se llama noin.
10:37También puedo hacer lo que decía la
10:38compañera, cambiar el promotor.
10:41Supónganse que estoy estudiando que
10:43encuentro que hay como 10 enhancers y
10:45quiero saber cuál es importante para que
10:47se exprese tal gen en el músculo.
10:50Bueno, le puedo cambiar o sacar
10:53específicamente un en cáncer y no otro.
10:56o puedo agregar un encáncer, que yo
10:58supongo que sirve para expresarse en
11:00músculo en un gen que no tiene ese en
11:01cáncer y ver si ahora el gen se pasa a
11:04expresar en el músculo.
11:06En el caso que vos quieras, por ejemplo,
11:08agregar una proteína
11:10al final de una secuencia particular,
11:13tendrías que hacer justo un corte en el
11:15codón stop para evitar que se detenga la
11:19acción.
11:22Naturalmente tengo que sacar el coden
11:23stop y tengo que asegurarme de que la
11:26proteína termine donde tenía que
11:28terminar y después empieza mi nueva
11:30proteína. ¿Existenzas de restricción que
11:32reconocen los codones stop?
11:34No existen encima de restricción que
11:36reconocen todo lo que yo quiero. Por ahí
11:38algunas reconocen codon stop. Pero
11:40fíjate que estamos ahora tratando de
11:42hacer la modificación en un organismo
11:44vivo. No le voy a meter una enzima de
11:46restricción adentro que me va a digerir
11:49todo el genoma.
11:51Lo que les voy a explicar es cómo se
11:52hace eso ahora.
12:06Se puede bloquear la función de
12:08proteínas. utilizando inhibidores.
12:11Cuando decimos inhibidores, nos podemos
12:13referir a pequeñas moléculas o a
12:14moléculas más grandes o lo que sea. Sí,
12:17claro que sí.
12:19Uno podría diseñar inhibidores
12:20específicos de factores de
12:21transcripción, inhibirlos y hacer y ver
12:24qué pasa. Es otra estrategia.
12:28Acá estamos viendo estrategias que
12:29involucran modificaciones genéticas de
12:32los organismos.
12:34No es que no hay otras estrategias.
12:39Todo me sig.
12:42Bueno,
12:43pregunta, profe, ¿se podría eh cambiar
12:46el la secuencia para sumarle eh como una
12:50etiqueta para mandarlo al proteoma
12:52después a a la proteína una vez formada?
12:56OT
12:56las proteínas se degradan en el
12:58propiasoma.
12:59Las muchas de las proteínas
13:00citoplasmáticas para eso tienen muchas
13:03veces etiquetas especiales que dicen,
13:05"Ahora se tienen que degradar.
13:08Sí, por ejemplo, en distintas fases del
13:09ciclo celular hay proteínas que se
13:11tienen que degradar, las vamos a ver más
13:14adelante.
13:15Esas etiquetas,
13:17como son dominios de proteínas, yo puedo
13:20agregárselas a mi proteína de interés y
13:23hacer que se degraden. Exactamente.
13:26También hay etiquetas que mandan a las
13:28proteínas a distintos lugares de la
13:29célula. Eso lo vamos a ver conmigo
13:31apenas termine el parcial, después del
13:34parcial. Esas etiquetas se las puedo
13:36agregar también de esta misma manera.
13:40Sí. Haciendo un noin.
13:53Cuando hago un transgénico, no un noín,
13:57me interesa insertar un gen, por
14:00ejemplo, como con Tom Marcelo, que tenga
14:02el promotor de una proteína. que se
14:04expres en el epitelio mamario y después
14:06una proteína de interés que yo quiera
14:08producir en la leche, por ejemplo, la
14:10insulina o cualquier otra que a uno se
14:12le ocurra, lo que quiero es meterlo en
14:15el genoma y no quiero arruinar a la
14:17célula donde se lo meto. Entonces,
14:20quiero y que se no me molesta que se
14:22inserte al azar siempre y cuando no
14:25arruine a la célula. que sea inerte el
14:28lugar de inserción tiene que ser una
14:30parte del genoma que no me moleste que
14:32se meta un gen.
14:35Ahí es un poco al azar, ¿se acuerdan? En
14:38todo el genoma se inserta el azar. En
14:40las técnicas de knock in, ¿sí? Y de
14:42knockout es en un lugar en particular.
14:45El knockout es del gen que yo quiero y
14:48el knockin es la modificación genética
14:50que puede ser un knockout en el lugar a
14:53donde yo quiero.
14:55¿Se entiende la diferencia entre knockin
14:56y knockout?
15:02Uno es más preso que el otro.
15:04Claro. El knockout es de arruinar un
15:07gen, deletar el gen, cambiarle el marco
15:09de lectura, insertar algo. Ese es el
15:11knockout. ¿Cómo hago el knockout? va a
15:13depender. Puede ser que haga un noin muy
15:15dirigido en tal lugar, quiero hacer tal
15:17cosa. O puede ser, ahora vamos a ver un
15:19poco un poquito más al azar las técnicas
15:23original que se explicaba en IBMC hasta
15:26el año pasado, hasta el cuatrimestre
15:28pasado, que en que no hubo clases,
15:31pero hasta el año pasado, que era la
15:33técnica que se utilizó por 25 años en
15:36los laboratorios, no la voy a explicar
15:38ahora. Tiene un valor importante
15:41conocerla. para entender los papers,
15:44porque se hicieron y un montones de eh
15:46construcciones y de animales fueron
15:48hechos de esa manera, pero ahora ya no
15:49se hace así. Entonces, les voy a
15:51explicar cómo se hace ahora.
15:57¿Por qué queremos?
16:00¿Por qué queremos hacer la delesión de
16:01un gen?
16:03Eso, ¿por qué queremos hacer un
16:04knockout? Que es un poco arruinar el
16:07genoma. Bueno, quiero saber la función
16:09de los genes. Una de las cosas que le
16:11gusta saber a los biólogos es para qué
16:13sirven los 20,000 genes humanos o los
16:175000 genes de las bacterias o los 6000
16:20genes de las levaduras. Cada gen tiene
16:22una función. ¿Cómo sabemos la función?
16:24Una forma es sacarlo. ¿Cómo sabemos la
16:27función del motor del auto? Si no sé
16:30cómo funciona un auto, le saco el motor
16:32y veo qué pasa. Okay. Después le saco
16:36las ruedas. ¿Qué pasa? ¿Pasa lo mismo
16:38que si le saco el motor? No anda el
16:40auto, pero tiene la misma función,
16:43¿no? ¿Qué quiere decir eso? Que el
16:46método de knockout tiene limitaciones.
16:49Te dice el fenotipo grosero.
16:53Muchas cosas pueden producir lo mismo,
16:55no necesariamente tienen la misma
16:57función.
16:59Sí, tiene la función grosera de hacer
17:01que el auto ande. Okay,
17:05se explica bien.
17:10[resoplido]
17:14También puedo querer arruinar un gen por
17:17otras razones. Una vez que sé la
17:19función, por ahí me conviene arruinar el
17:21mujer.
17:26Por ejemplo, si ustedes hacen una animal
17:29transgénico, digamos por un no un animal
17:32transgénico, resucitan a los
17:33dinosaurios. ¿Lo vieron Jurassic Park?
17:36Sí, la uno, ¿lo vieron
17:39ahí?
17:41Los
17:42investigadores, biólogos, emprendedores
17:45del parque, lo que habían hecho era
17:48montones de dinosaurios y para
17:50asegurarse de que no se puedan escapar
17:54de la isla, aparte de ponerlos en una
17:56isla, le hicieron una modificación
17:58genética. No me acuerdo si la película
18:01lo detalla.
18:02En la segunda dicen que no pueden hacer,
18:04que no pueden hacer liina.
18:07Entonces, si no pueden hacer licina,
18:08tienen que estar en un lugar donde les
18:10provea la comida en licina. ¿Okay? ¿Cómo
18:14hicieron para que no puedan hacer liina?
18:17Les hicieron un knockout de alguno de
18:19los genes de la vía biosintética de
18:21Lisina. Ahí tienen un uso fantástico de
18:24la ingeniería genética.
18:29¿Okay? Bueno, entonces para hacer
18:31knockout en realidad lo que quiero hacer
18:34es un poco
18:36lo que habíamos hablado la clase pasada
18:38y es yo tengo un gen blanco, ¿sí? Por
18:43ejemplo, en su exón 2 sí voy a
18:45arruinarle el hexón 2 y lo que voy a
18:48tratar de hacer es tirarle un ADN,
18:51inyectarle, transfectarle o hacerle
18:53llegar al genoma un ADN lineal que tiene
18:57bordes que tienen homología. homología
19:00quiere decir que tiene la misma
19:01secuencia,
19:03¿sí? A un lado y al otro del gen que
19:06quiero deletar. Y en el medio, por
19:08ejemplo, si quiero arruinar el gen, le
19:11inserto
19:13otra secuencia codificante. En ese caso
19:15es el gen de resistencia a neomicina o
19:19G418.
19:22Pero puedo insertar a otra cosa. Cuando
19:24se produce la recombinación homóloga,
19:26¿qué va a pasar? Esteón ahora va a
19:29quedar
19:34interrumpido. Se va a reemplazar lo que
19:37estaba en el genoma por lo que estaba en
19:39el fragmento de ADN y lo que estaba en
19:41el genoma pasa al fragmento de ADN, es
19:44decir, se recombinan, se dan vuelta,
19:47¿sí? Como en crowing over, en la meiosis
19:50y en el genoma ahora queda interrumpido
19:53por esta secuencia azul.
19:56ese gen está arruinado. Eso es lo que
19:59quiero hacer de alguna manera. Puedo
20:01querer agregar esto o puedo querer que
20:04se corte y se cambie el marco de
20:07lectura. Pero de alguna manera lo que
20:08necesito es que ocurra un evento
20:11de recombinación homóloga o algo
20:14parecido en un lugar específico.
20:17¿Okay? Esta es la base de la técnica que
20:20se usó por 25 años. Pero, ¿cuál es el
20:23problema principal del cual hablamos
20:25previamente la clase pasada
20:28que tiene esto?
20:33Lo que yo quiero es que haya
20:35recombinación homóloga. En este ejemplo,
20:38cuando le proveí un ADN lineal con
20:41homología y un gen, un pedazo de
20:43secuencia que es otro gen para
20:45interrumpir el exón del gen que quiero
20:47arruinar.
20:49Pero esto, ¿qué es lo que quiero? es
20:51mucho menos frecuente que esto que es la
20:55recombinación ilegítima,
20:58lo que permite la inserción al azar de
20:59los transgénicos
21:01es lo que usa la técnica de
21:03transgénicos. La probabilidad alta de
21:06que se se inserte al azar por
21:09recombinación ilegítima, no homóloga en
21:13cualquier parte del genoma. Entonces,
21:15cuando yo quiero hacer el no lockout, en
21:17vez de pasar esto, va a pasar muy
21:19comúnmente esto,
21:22que se va a insertar en vez de donde
21:24quiero, donde a la célula se le canta
21:27por la maquinaria de recombinación
21:30ilegítima.
21:34¿Estamos de acuerdo con eso? Ese es el
21:37gran problema que hubo siempre para
21:39hacer knockouts y knockins dirigidos.
21:42Sí. que hacía que sea tan laborioso y
21:45tan largo el proceso de obtener esas
21:48modificaciones genéticas en el lugar a
21:50donde uno tiene
21:52y es lo que permite que se generen
21:54tangénicos mucho más fácil porque total
21:57se inserta en cualquier lado y puede ser
21:59que me importe pero hago un un
22:02genotipeado de los de todas las líneas
22:05extranjénicos que hago y me quedo con la
22:07camilla de convier como contó Marcelo.
22:11Pero para las inserciones en un lugar,
22:14las modificaciones en un lugar
22:15específico, es un grave problema. Es un
22:17grave problema en la mayoría de los
22:19organismos. Hay organismos que tienen
22:21recombinación homóloga muy alta, mucho
22:24más alta que la recombinación ilegítima,
22:26como las levaduras. Entonces, las
22:28técnicas de modificaciones genéticas
22:29dirigidas en levaduras avanzaron
22:31muchísimo durante todo este tiempo,
22:33mientras el resto de los organismos no
22:34se podían hacer.
22:37Pero
22:40hace más o menos 15 años, un poco más,
22:42se descubrió Crisper,
22:45que Marcelo no tuvo tiempo de explicar
22:47en detalle. Yo les había explicado
22:50rápidamente la otra clase y se los voy a
22:52volver a explicar ahora. Sí, en más
22:54detalle o por lo menos más lento.
23:00Okay. Entonces, con Crisper
23:04lo que vamos a hacer es utilizar a esta
23:08enzima
23:10que tiene una guía de ARN.
23:14Es como si fuera una enzima de
23:15restricción, pero la enzima de
23:17restricción es muy tonta, solo puede
23:20cortar donde puede cortar. Eco R1 solo
23:23va a cortar en G a A TC.
23:27En cambio, Crisper la guía la guía le
23:31pongo un ARN de guía y corta donde
23:34quiere, donde quiere la guía. En este
23:37caso, ¿quién es la guía? Nosotros
23:39decidimos cuál es la guía.
23:41Las bacterias utilizan crisper para
23:44atacar a los virus que los infectar
23:57al próximo virus que entre que tenga la
23:59misma secuencia. Esa es cómo evolucionó
24:02Crisper y los sistemas del tipo Crisper.
24:04Pero para nosotros que hacemos
24:06ingeniería genética, eso nos interesa
24:09con por su valor histórico, pero en
24:11cuanto a su uso es una enzima al cual le
24:15tengo que agregar una vía que tiene una
24:17región de 20 nucleótidos, una guía de
24:21ARN
24:22y yo le pongo 20 nucleótidos que sean
24:25homólogos idénticos al sitio que que yo
24:28quiero atacar y la enzima lo va a
24:31cortar.
24:35La enzima se ensambla con la guía de ARN
24:38y esta zona sirve de homología para
24:41atacar el ADN de mi interés.
24:46¿Qué hace Griffer? Hace un corte doble
24:49cadena
24:53y cuando se produce un corte de doble
24:55cadena, ahí la maquinaria de reparación
24:58se enfoca en arreglar ese corte doble
25:01cadena. Sí.
25:06Entonces pueden pasar básicamente dos
25:08cosas.
25:11La primera opción es que la maquinaria
25:14de de reparación del ADN, ¿sí? Las
25:17vigazas de la célula, ligan los extremos
25:20cortados y al hacerlo cometen errores.
25:25¿Okay? Cuando cometen errores, ¿qué son
25:27cometer errores? Lo que me importan es
25:29que se agrega una base o se saca una
25:31base, es decir, si eso es una secuencia
25:33codificante, le cambia el marco de
25:35lectura.
25:37Entonces, el resultado de este proceso
25:40es que el gen para el cual le puse la
25:43guía va a tener con alta probabilidad
25:47una mutación, una mutación que no la
25:49dirigí exacto yo, pero arrubiné el marco
25:53de lectura, que era lo que quería hacer
25:56si quiero hacer un knockout.
26:00pregunta.
26:03Es, ¿es posible que la guía Riste
26:05reconozca otra secuencia de 20 nucleidos
26:08y corte un lugar donde no tiene que
26:09cortar?
26:09¿Es posible?
26:12¿De qué depende?
26:14De la secuencia.
26:15De la secuencia de 20 nucleótidos que
26:17usé. Si yo uso una secuencia de 20
26:20nucleótidos que existe en otra parte del
26:21genoma, ¿qué va a pasar?
26:23Lo va a reconocer. Y si no existe,
26:26no la va a reconocer.
26:28Entonces depende de
26:31cómo diseñe la guía.
26:35¿Está claro?
26:37Sí.
26:38Pero puede pasar entonces que Crisper se
26:39equivoque.
26:41La probabilidad de que Crisper se
26:44equivoque quiere decir que los 20
26:45nucleótidos en realidad 19 encontró en
26:49otro lado y cortó igual. Eso es que se
26:51equivoque. Si reconoce 20, el que se
26:54equivocó soy yo cuando hice la guía.
26:58Okay. La probabilidad de que Crisper se
27:00equivoque existe, es muy baja, pero
27:03existe. No podemos descartar eso. Se
27:05llaman los off targets, los targets de
27:09Crisper en otros lugares del genoma, que
27:11no era lo que yo quería. Tengo que tener
27:13cuidado, ¿sí?, de que no ocurra.
27:20Okay, entonces acá aparece un gen mutado
27:22porque se producen inserciones o de
27:23lesiones. Listo, con eso ya tengo la una
27:28forma de generar knockout.
27:34Ahora, la otra opción que me permite
27:37hacer cosas mucho más sofisticadas es si
27:40yo le proveo un material de ADN lineal,
27:44por ejemplo, para reparar. Entonces,
27:46ahora la maquinaria que va a agarrar
27:48esto es la maquinaria de recombinación
27:50homóloga, que compite con la maquinaria
27:53de reparación normal. Sí. Y a veces gana
27:57y a veces pierde. Si yo le proveo una
28:00secuencia que tenga homología a un
28:02costado y al otro y en el medio, pongo
28:05lo que a mí se me ocurra,
28:08¿okay? Y acá está la gracia, ¿sí? ¿Qué
28:12va a pasar?
28:14La maquinaria de recombinación homóloga
28:16recombina acá y acá y se inserta esta
28:20región azul en el genoma, en el lugar
28:24donde en el lugar que yo dije. ¿Cómo lo
28:26dije? Con la guía. La guía es la clave
28:29de dirigirlo al lugar correcto.
28:33¿Sí? Y se insertó lo que yo quiero,
28:36donde yo quise.
28:39Va a ser 100% eficiente, ¿no? ¿Por qué?
28:42Porque la maquinaria de recombinaciones
28:43legítimas sigue funcionando,
28:46solo que la maquinaria de recombinación
28:47homóloga le encanta y se estimula cuando
28:50uno le provee ADN cortado y homología.
28:55¿Okay?
29:01Esto se lo había explicado la otra
29:02clase.
29:08¿Alguna pregunta acá?
29:18No es solo la ligaza, es una maquinaria
29:20de enzimas que incluyen una ligaza que
29:22hacen lo que pueden y lo juntan, pero no
29:26no saben, se equivocan y cometen esos
29:29errores. Eso es lo que pasa.
29:35le agregan una secuencia o le comen un
29:37pedacito para repararlo y al final no
29:40queda como estado originalmente.
29:46Okay. También puedo sí agregarle una
29:50secuencia de homología que en vez de
29:52insertarse acá se inserte acá. Y si esta
29:55secuencia azul se codifica para la GFP,
29:58¿qué va a pasar? va a quedar en la GFP
30:02en marco de lectura con el gen al que yo
30:06quería
30:08taguear, quería fusionar, quería hacer
30:11una quimera con la proteína fluorescente
30:13verde o azul o amarilla o roja o lo que
30:17yo quiera, como les había contado antes.
30:22Sí, ven que acá antes había un stop.
30:29Acá hay un codón stop
30:32y acá se fue el codón stop y aparece
30:34otro codon stop. Acá es muy importante,
30:37obviamente sacar el codón stop natural
30:40porque si no, ¿qué va a pasar? Se va a
30:42terminar la proteína y mi proteína
30:43fluorescente nunca se va a traducir.
30:46Una pregunta de la maquinaria changó que
30:48no entendí muy bien la función. La
30:51homología está en las puntas que se unen
30:53a la parte
30:54la homología está en esta zona.
30:57con esta y en esta zona con esta a un
30:59lado y al otro del sitio de corte.
31:01Entonces, en el medio se ponen los
31:02objetivos que son complementarios a la
31:05zona que
31:05acá se recombina acá, sigue por acá,
31:07¿sí? Se recombina acá y sigue por acá.
31:11¿Cómo se inserta la parte del medio? El
31:14gen que vos querés que se inserte.
31:15La maquinaria recombina acá y hace que
31:18el ADN que venía por acá siga acá.
31:20Ah, okay.
31:20Sigue por acá, sigue por acá. Y este que
31:22venía por acá sigue por acá y sigue por
31:23acá. Pero la hebra de arriba queda
31:26la hebra de arriba la Sí, esto es doble
31:29cadena pasa. Está dibujado en una hebra,
31:31pero es en las dos hebras.
31:33Okay.
31:33Okay. En las dos hebras.
31:37Esto es doble cadena. Sí, están mal
31:39dibujado. Tendría que dibujar doble
31:41cadena acá y doble cadena acá.
31:45La maquinaria de reparación literalmente
31:48lo que hace es agarrar ese ADN que lo
31:50torreamos y colocarlo ahí o se base en
31:53eso para recuperar
31:55literalmente pone ese ADN.
31:58Okay. No tiene otra forma. Pone este
32:00ADN, pero no vamos [carraspeo] a ver la
32:01maquinaria de recombinación, eso es para
32:04alguna otra materia por ahí en genética,
32:07en la parte molecular de genética lo
32:09vean,
32:10¿okay?
32:13o si no la parantería biología molecular
32:15o en genética molecular.
32:20¿Alguna duda de esto? ¿Entendieron?
32:21Porque está un poquito mal dibujado.
32:29Bueno, entonces acá hice mi inserción.
32:33Esto entienden porque esto es un noin.
32:38Y ahora, ¿qué hago?
32:40O mejor dicho, ¿dónde hago esto? Esto es
32:42un dibujo. ¿Dónde está este ADN cuando
32:45lo voy a hacer? ¿Cómo lo hago
32:48físicamente?
32:51No te dije.
32:55Una de las formas que viene directo de
32:58la clase anterior es microinyectar
33:03el pronúcleo de un óvulo fecundado. ¿Con
33:06qué? con el ADN para reparar. ¿Y qué
33:10más?
33:12La enzima CAS9 con la guía
33:16preensambladas
33:17in vitro en un tubo de no es la única
33:21forma de hacerlo, es la forma más
33:24efectiva.
33:26Acá le estoy dando enzima, estoy
33:28microinyectando la enzima, la proteína
33:32ya ensamblada con el ARN guía.
33:37Y qué va a pasar? Todo esto va adentro
33:40al núcleo, a uno de los pronúcleos de
33:42lobocito fecundado. Entonces, lo que
33:44dibujé antes,
33:46esto va a pasar dónde?
33:49En el pronúcleo.
33:51En el pronúcleo ese va a pasar.
33:56Y en el otro pronúcleo
34:00es antes de la fecundación.
34:01¿Cómo? Antes de la fecundación, ¿cuántos
34:04pronúcleos hay?
34:06Entonces,
34:09por eso se llaman pronúcleos, si no se
34:11llamaría el núcleo.
34:14En el estadío de pronúcleo, luego de la
34:17fertilización,
34:18todavía los núcleos no se fusionaron.
34:21Entonces, hay dos pronúcleos, el
34:22masculino y el femenino.
34:25Pero tendrías que conocer la secuencia
34:27de los
34:29para generar
34:30Todo esto requiere conocer la secuencia,
34:34o sea, pero antes
34:35para para hacer la guía, para hacer la
34:37guía tengo que conocer la secuencia.
34:40O sea, que antes de hacer laulación
34:43tenes que secuenciaros pronúcleos.
34:45Pero los pronúcleos son de ratones que
34:48ya conozco la secuencia.
34:50Tengo que conocer la secuencia del gen
34:54que quiero modificar. Por ahí no
34:55necesito conocer toda la secuencia. Si
34:57quiero ser super cuidadoso y que mi
34:59secuencia de 20 nucleótidos no le pegue
35:01a ninguna otra parte del genoma, mejor
35:03conocer todo el genoma. Pero si me
35:05quiero arriesgar con conocer la
35:07secuencia de
35:09Pero todo tiene
35:11el tuyo es distinto del de ella, pero
35:13los ratones son todos iguales.
35:16Todos los oocitos del mismo ratell.
35:18Todos los ooccitos del mismo ratón son
35:20iguales porque los ratones, si uso
35:23ratones homocigotas son homocigotas. Si
35:26son no si no son homocigotas, no.
35:30Pero si tengo alguna duda, lo secuencio.
35:33Por ejemplo, si quiero hacer crisper con
35:35un humano o con una vaca o con un
35:38organismo que no sea eh homoigota
35:42y no conozca la secuencia de los alelos
35:44diferentes que pueda tener, tengo que
35:46secuenciarlo. Sí. Sí. Sin duda, esto
35:50requiere conocer la secuencia porque la
35:52guía, no solo la guía, la guía y la
35:55secuencia de homologías a los costados
35:57donde va a recombinar, tienen que ser
35:59iguales.
36:02Okay.
36:05Me perdí un poco con lo de homocigota y
36:07eterosigota.
36:08¿Sabemos lo que es homocigota y
36:10eterocigota? Eh, ¿sabes lo que esigota y
36:13eterigota? Se supone que, pero me está
36:16costando.
36:17Okay. Un individo. Los los mamíferos
36:20somos diploides. Tenemos un complemento
36:22de ADN que viene de la mamá y uno del
36:24papá. No somos iguales, la mamá y el
36:26papá. ¿Okay? Entonces, los alelos que
36:30vienen de un de un del papá y de la mamá
36:32no son iguales. Quiere decir que somos
36:35heterocigotas.
36:36Tenemos un gen distinto
36:39del gen de enfrente del cromosoma
36:41homólogo que viene del otro padre. o de
36:44la madre. Sí, eso quiere decir que somos
36:46heteroigotas y somos heteroigotas para
36:49la enorme mayoría del de los genus. Sí,
36:54por ahí algunos no. Por ahí para algunos
36:55somos homocigotas, ¿sí? O para varios.
36:59En el caso de los ratones son
37:00completamente homocigotas los que uso
37:03porque son endocados. Los cruzo consigo
37:05mismos, o sea, con los hermanos. Son
37:07super endocados, son homocigotas. ¿Okay?
37:11Entonces, cuando yo tengo la secuencia
37:13del genoma de ese de esa especie de
37:15ratón, conozco la secuencia de los dos
37:17aleros porque son iguales.
37:18Entonces, no hay mucha variación entre
37:19individuo y individuo.
37:20No hay variación genética entre
37:23individuo y individuo. En cambio, si usa
37:25otros animales que no son endocados, sí,
37:27en ratas no son tan endocadas, hay mucha
37:30más variabilidad.
37:34El largo que supone que es de 20 neurotó
37:37de la de la RN guía, no te limita a qué
37:41podés, ¿no? Vos hacés la cuenta después
37:44de cuál probabilidad hay de encontrar 20
37:47nucleótidos exactos en secuencia en 3*
37:5010 a la 9 bases del genoma y después me
37:53decís cuántas probabilidad hay de off
37:55target. Alguna hay.
37:57No, pero digo digo al al largo lo que
37:58vos queres insertar.
38:00No, no, no. La guía sirve para cortar
38:04lo que yo quiero insertar puede ser
38:06esto. Puede ser 1 km puede tener de lar.
38:09Ah, okay.
38:10100 kbases
38:12o 50 bases, lo que quiera. No tiene nada
38:15que ver los 20 nucleótidos de acá con lo
38:17que voy a agregar acá.
38:19Esto sirve para dirigir a la enzima que
38:22corta, corta y se va. Todo lo que viene
38:26después no tiene nada que ver con la
38:27enzima.
38:29¿Entienden?
38:31No tiene nada que ver la guía
38:34con el tamaño de lo que voy a insertar.
38:37De hecho, en el ejemplo anterior
38:42no agregué nada y corté y se reparó solo
38:48generando errores. Quiero aclarar,
38:51¿estos errores pasan en todos los casos?
38:54No, hay veces que se sella y queda igual
38:56de bien como estaba antes, ¿okay? No
38:59necesariamente hay errores, así que me
39:02tengo que fijar luego de que hago la
39:04técnica. Volvemos entonces al lobosito.
39:12Microinyecto el ADN para recombinar y
39:16CAS 9 con la guía. Si lo único que
39:19quiero hacer es arruinar el gen, esta
39:21parte no la necesito agregar.
39:24corto. C9 va a cortar y las células van
39:27a reparar y van a generar errores y van
39:30a arruinar el gen que yo estoy atacando.
39:36¿Está claro?
39:42Van a ser crías que van a ser
39:46heterocigotas
39:47para la reparación causada por CAS 9.
39:52¿Por qué? Porque microinyecté un
39:55pronúcleo. Entonces, es muy probable que
39:58la la modificación ocurra en este
40:00pronúcleo y para cuando se fusionen ya
40:03sea tarde para que K9 actúe en el otro
40:05genoma.
40:07No es impensable que ocurren los dos,
40:10pero con más probabilidad va a ocurrir
40:12solo en uno de los pronúcleos.
40:15Si ocurre en el pronúcleo, entonces va a
40:18ser heterocigota, ¿entienden? Un alelo
40:21quedó modificado y el otro no está
40:23modificado, pero como esto es un
40:24obocito,
40:26la cría,
40:28¿qué va a hacer? Todas las células de la
40:31cría, es decir, toda la cría, va a tener
40:35la modificación genética. Si tengo
40:38alguna duda, lo que tengo que hacer es
40:41hacer un análisis, ¿sí?,
40:43de la progenie. Y fijarme, acá está, hay
40:48que genotipar las crías nacidas a las
40:51cuales vamos a llamar fundadores o F0,
40:55¿sí?
40:58Para identificar las las crías que tiene
41:00el alelo. Obviamente yo hago esto y de
41:03todas las veces que lo hago, no va a
41:05ocurrir todas las veces la modificación.
41:07Por ahí ocurre un en 10.
41:10Sí.
41:11Entonces, voy a tener que [música] hacer
41:12el análisis
41:15de varias crías.
41:18Sí. A ver, ¿cuál tiene la modificación
41:20que yo quería?
41:24si vos un que es recesivo, por ejemplo,
41:28si vos te aseguras de que el anhelo del
41:31otro pronupleo también es recesivo, ahí
41:33sabés que se va a expresar en todo el
41:35organismo, no va a depender de
41:46lo que yo estoy insertando, estoy
41:48modificando un gen. No importa si el gen
41:51es dominante o recesivo respecto del
41:54alelo que puede tener el otro
41:58el otro cromosomo.
42:02No, no que sean recesivos o dominantes
42:04no tiene que ver con que si se expresan
42:06o no se expresan, tiene que ver con si
42:07se expresa el fenotipo,
42:09no el gen. El gen se expresa.
42:13Ahora, ¿qué veo en el individuo? Veo el
42:16efecto del gen de color marrón, de ojos
42:19marrones o de azules. El azul no se
42:20expresa, no se expresa, queda tapado por
42:23el otro, pero se expresa.
42:26¿Okay? No nos mezclemos con la genética
42:30del fenotipo, que la genética clásica.
42:33Acá estamos modificando un gen y el gen
42:35se va a expresar si se expresaba antes.
42:37El gen se expresaba antes, yo hice una
42:39modificación, se va a expresar. Si lo
42:41arruiné, obviamente ese mensajero se va
42:42a traducir y va a ser una proteína
42:44abortiva.
42:45Pero si queremos hacer un knockout,
42:47si queremos hacer un knockout, va a ser
42:48una proteína abortiva en un alelo y en
42:51el otro no.
42:51Entonces después, ¿cómo veníamos en la
42:54cría que tiene realmente?
42:55Entonces ahora tenemos la cría que es
42:57heterocigota para un gen arruinado y el
43:00otro no, el otro sigue normal. Okay.
43:04Esas crías las voy a cruzar con una con
43:07un ratón walt de vuelta,
43:10¿okay? por las dudas que haya habido un
43:12corte o una modificación en otro lado
43:14que no no me di cuenta porque no voy a
43:16secuenciar todo el genoma, pero podría
43:18haber ocurrido lo que vos dijiste, que
43:20CAS 9 tocó algún lugar en otro lado y le
43:23pasó algo al genoma. Entonces, para
43:26asegurarme de que no estoy llevándome
43:29esa mutación, lo que voy a hacer es
43:31cruzar estos f0
43:34con un ratón al type, con una ratona
43:38alta.
43:40Y los van a la los hijitos van a ser
43:43heterocigotas.
43:44Sí, algunos sercigotas y algunos
43:46homocigotas porque este era
43:48heterocigotas. Un heterocigota contra W
43:50type va a generar una población de wal
43:53types y una población de heterocigotas.
43:55Sí, también los puedo genotipar
43:58analizándole el ADN por PCR, secuenciar,
44:01etcétera, lo que quiera. Me quedo con
44:03los que tienen la mutación que yo
44:05introduje con K9 de acá y esos son mis
44:08heterocigotas
44:10que están ya sacados, separados de
44:13cualquier otra mutación que haya podido
44:16quedar a haber aparecido en mi técnica
44:18original. Sí. Y si cruzo dos
44:21heterocigotas, ¿qué va a pasar?
44:25Algunas van a ser homocigota con el
44:27¿Qué porcentaje?
44:3115%.
44:33Si yo cruzo 12 heterocigotas,
44:36¿qué porcentaje de la cría va a ser
44:38homoigota knockout? En este caso,
44:4125%.
44:43Okay.
44:45Y si el gen era esencial,
44:49el que arruiné,
44:50se muere.
44:53¿Qué porcentaje va a ser homocigota?
44:57Lockout.
44:58Ninguno.
44:59Cero,
45:00porque es esencial. Entonces, uno de los
45:03resultados posibles de cruzar dos ceros
45:05yigotas
45:08es que no pasen, no tenga cría.
45:10Sí. Para que no tenga críaciigota. Voy a
45:13tener la otra. Okay. Es muy raro, pero
45:18es posible que el heterocigota ya de por
45:21sí tenga fenotipo. No digo es tan
45:23rápido. En general los heterocigotas
45:26knockout, es decir, tienen un gen normal
45:27y el otro mutado, no tienen problema,
45:30pero a veces sí.
45:34Marcelo lo nombró esto el otro día.
45:36El siempre es homoc
45:39el si son ratones son homocigotas. Ah,
45:43igual
45:43porque estuvimos hablando antes de que
45:45son endocados y entonces son muy
45:46homocigotas en todo.
45:50Okay.
45:51Igual siempre la cruza entre una
45:52telaigota y una homocigota te vacigot
45:54igual lo que estoy hablando es que los
45:57ratones en general son homocigotas para
45:59todos los aledos. Acá cuando digocigota
46:02me refiero solamente al gen que hice la
46:05modificación.
46:07Son enterocigotas para este gen. Para
46:09todo lo demás son homocigotas.
46:16Okay, entonces tengo esta es una forma
46:20de hacer los knockouts.
46:22Vamos a ver. Esto es importante, un
46:24busco de texto, pero es bastante
46:26importante que nos concentremos en esto.
46:32Como dijimos, si no tengo cría
46:36o si la cría se muere, quiere decir que
46:40es letal embrionario.
46:43O sea, cuáles son los posibles fenotipos
46:44de los knockouts.
46:46Puede ser que sea letal embrionario. Las
46:49crías homocigotas para el knockout no
46:51nacen. Es decir, se interrumpe el
46:53desarrollo tempranamente y aborda.
46:57¿Cuán tempranamente puede ser?
47:02Y depende en dónde tiene la injerencia
47:05del
47:10puede ser en cualquier estadio del
47:13desarrollo, incluso puede ser tan
47:15terrible que no genere ni óvulos.
47:21Sí. que los óvulos ya estén arruinados.
47:24Puede ser que las primeras divisiones
47:26celulares estén arruinadas porque era un
47:29componente del ciclo celular esencial y
47:31no se puede ni dividir la célula.
47:35Puede ser que sea un gen necesario para
47:38la migración del del
47:41óvulo fecundado por el por el el ¿cómo
47:45se llama? las trompas hacia el útero.
47:48Puede ser que sea un gen necesario para
47:50la implantación en el útero. Todas esas
47:53cosas son letales. Si no lo puedo hacer
47:58para cualquier parte, si no podían hacer
47:59la placenta. Después y después una vez
48:02durante el desarrollo puede ser que no
48:05puedan hacer distintas cosas, no se
48:06puede hacer el corazón,
48:09¿okay? Bueno, o sea, puede hacer la el
48:10cerebro, un sistema nervioso.
48:14Todas esas cosas van a ser que sean
48:17letales embrionarios. ¿Cuál es la
48:19conclusión del experimento? El gen
48:20noqueado es esencial para desamor. Es
48:23como le saqué el motor al
48:27¿Qué pasa? Y era esencial para entrar.
48:29¿Qué más? Nada más. Si no estudio algo
48:32más, no sé más nada. Esto puede ser lo
48:34que habían mencionado eh con respecto a
48:37lo de la falta de músculos eh la falta
48:41de músculo también que lo habían
48:42investigado y que se que los músculos y
48:44por eso lo pueden los órganos.
48:48Es esencial.
48:52Está bien.
48:54Ese sería un caso dramático pero poco
48:58informativo, digamos.
49:01Muchos genes tienen varias funciones.
49:03Puede ser que sean esenciales para el
49:05desarrollo, pero también puede ser que
49:07sean necesarios para otras cosas durante
49:09la vida adulta. Estos genes son
49:11esenciales. Son de esa clase, me los voy
49:13a me los voy a perder
49:16porque hice el knockout del gen
49:18directamente lo arruiné.
49:24Puede ser que no tenga ningún fenotipo.
49:28Hago el knockout. Todos los ratones
49:29homocigotas cuando nacen, crecen, se
49:31desarrollan y se reproducen normalmente.
49:37Eso es muy palabra.
49:40Okay, ahora es mucho menos trabajo hacer
49:42knockout que antes, pero imagínense que
49:43antes se pasaban dos años haciendo un
49:45knockout y resultaba que no tenía ningún
49:48fenotipo
49:50aparente. Para algo está el geno, pero
49:53no está nada cuenta. Entonces, ¿qué
49:56conclusiones saco? El gen noqueado no es
49:59esencial ni para el desarrollo, ni para
50:01la sobrevida, ni el funcionamiento
50:02normal del ratón. Posibles
50:04explicaciones, redundancia genética.
50:09Muchos genes están en varias copias.
50:12Okay. Durante la evolución, el genoma de
50:14los vertebrados sufrió duplicaciones.
50:17Hay varias copias de los genes que en
50:20general se especializaron
50:22en funciones particulares, pero todavía
50:24pueden hacer la función del otro. El gen
50:26A es mejor para una cosa, el gen B es
50:29mejor para otra cosa, pero si falta el
50:30gen A, el gen B todavía puede hacer lo
50:32que sea el gen A de alguna manera. Sí.
50:36Entonces se compensa y no me doy cuenta
50:38el problema que tiene. Seguramente tiene
50:40algún problema, pero tenemos que
50:41encontrar la condición adecuada para
50:43poder
50:45manifestar,
50:47¿no?
50:48Sí, pero no tiene nada que ver con que
50:49seigota o homoigota. Es dentro de
50:51Estos son homocigotas. Claro, pero digo,
50:53o sea, es otro del mismo, o sea, de la
50:56misma parte de la
50:58es un un parálogo, otro género que
51:03que vienen del mismo lado.
51:05¿Cómo
51:05que vienen del mismo lado?
51:07No tiene nada que ver si vienen de la
51:08mamá o del papá, son homocigotas. Y otro
51:11gen que no toqué.
51:14Hay otro gen en la célula que hace algo
51:16parecido.
51:18Okay.
51:22E otra explicación podría hacer una
51:25mutación sucesora que revierta.
51:29No, acá no pasó una mutación supresoral.
51:33No, yo hice una modificación y no veo
51:35ningún fenotipo.
51:37Alguien suprime el fenotipo, pero no es
51:40que es una mutación supresoral.
51:43No, no, pero digo, podría ser,
51:45podría. Lo que estoy diciendo es que hay
51:47otros genes que podrían compensar la
51:48falta de sistémica. No podría acá haber
51:51aparecido una mutación supresora porque
51:54la técnica que utilicé no lo permite.
51:56Ah,
51:57okay. Sí puedo generar mutaciones
52:00supresoras de otra manera que no vamos a
52:03una mutación supresora, para los que
52:06escuchan la pregunta, quiere decir que
52:08otro gen no relacionado sufre un cambio
52:11que permite compensar a la mutación que
52:14yo hice. Pero no puedo hacer eso porque
52:15no le di tiempo. Yo hice acá una
52:19modificación genética, generé un ratón,
52:21no tiene más el gen, no pasa nada, tiene
52:24que ser el resto del genoma
52:27lo compensa o o sea, redundancia
52:31genética. Existe otro gen en el genoma
52:34del ratón con similar con secuencia
52:36similar
52:37al noquear cuyos productos cumplen
52:39funciones similares. Lo que les acabo de
52:41decir por ahí hay dos genes necesarios
52:43para sintetizarina.
52:45Okay. O hay dos vías para sintetizarina.
52:48La ruiné una y la otra sigue
52:49funcionando, entonces no se muere.
52:53Puede ser que haya compensación
52:55funcional. Sí. Durante el desarrollo del
52:58ratón knockout se sobreexpresa otro gen
53:00no necesariamente similar al noqueado.
53:02Esto es compensa la ausencia del
53:03producto noqueado. ¿Qué quiere decir
53:05eso? Las células, si ustedes no toman
53:08agua, ¿qué pasa?
53:11Tienen sed. Se va deshidratando y tienen
53:14sed. Si no comen, ¿qué pasa? Tienen
53:16hambre. ¿Para qué? Para restablecer el
53:19estado,
53:21¿sí? El estado natural de la célula. Eso
53:23se llama homeostasis. ¿Sí? Si ustedes
53:25comen mucha azúcar, ¿qué van a hacer?
53:28Liberan insulina para que se vaya la el
53:31azúcar de la sangre
53:33y las células se va el azúcar a las
53:35células porque no puede subir mucho el
53:37azúcar en la sangre. Si la temperatura
53:39corporal de ustedes sube, ¿qué va a
53:40pasar?
53:43Van a empezar a sudar, van a generar
53:46comportamientos fisiológicos que van a
53:48tratar de bajar la temperatura. Si
53:50tienen frío, ¿qué va a pasar? Van a
53:51empezar a tiritar, van a querer
53:54abrigarse, van a hacer cosas para
53:55compensar el cambio. Sí. Lo mismo pasa a
53:59nivel genético. Cuando yo deleto un gen,
54:03hay alguna función que por ahí no se
54:05cumple bien y la célula trata de
54:07responder, de compensar. Tiene
54:10mecanismos de compensación de
54:12homeostasis que podrían involucrar que
54:15otro gen se empiece a expresar más de la
54:17cuenta cuando normalmente no lo habría
54:19hecho para poder compensar. Entonces,
54:21eso puede causar que no me dé cuenta del
54:24la función del fenotipo que estaba
54:29ocurriendo cuando hice el knockout.
54:30¿Cuál era la función del gen? No me di
54:32cuenta porque otro gen lo está
54:33compensando.
54:36¿Entienden la hipótesis de la
54:38compensación funcional?
54:51Una pregunta, si hay resonancia
54:53genética,
54:55¿por qué es una confusión que no haado
54:57esencial para para porque hay otro?
55:03La función puede ser esencial. Por
55:05ejemplo, si yo quiero replicar el ADN y
55:09hay tres polimerazas que replican el
55:11ADN. Si hago el noockout de una, las
55:14otras van a replicar el ADN. La función
55:16replicar el ADN es esencial. Es
55:19esencial. Pero ese gen es esencial, ¿no?
55:24Porque están los otros.
55:26Okay.
55:31En el auto hay cosas que son esenciales
55:33y cosas que no son esenciales.
55:35Sí.
55:37¿Cuáles no son esenciales?
55:38La radio.
55:39La ¿qué?
55:40La radio.
55:41La radio. Pero la radio es una función
55:44de entretenimiento del conductor.
55:47Cuando no hay entretenimiento del
55:48conductor, ¿qué pasa?
55:50Hay un mecanismo de compensación.
55:53El conductor habla por teléfono para
55:56entretenerse de otra manera. Ahí hay
55:58otra función que lo compensa. Sí, las
56:00luces
56:02largas son esenciales, ¿no? Porque las
56:05luces las digo las muy largas,
56:09las porque están las otras luces que
56:11funcionan, no pasa, no es que
56:13necesariamente me mato si no tengo las
56:16luces largas. Okay. Las ruedas son
56:19esenciales,
56:20pero hay cuatro.
56:23Pero una rueda no puede compensar la
56:25falta de otra rueda, ¿okay? Aunque haya
56:27cuatro, o sea, no está garantizado de
56:30que si está si hay cuatro copias del
56:31gen, uno va a poder compensar la falta
56:34de unos genes van a poder compensar la
56:35falta de los otros. ¿Okay? ¿Por qué las
56:37ruedas no pueden compensar?
56:41Porque se expresan en distintas partes
56:44del auto,
56:47tienen promotores distintos. La rueda de
56:49adelante de la de la derecha. tiene
56:52promotor que se expresa a la derecha y
56:54si bien es idéntica a la de atrás, no lo
56:57puede compensar porque se expresa en
56:59otro dominio.
57:01Podría pasar que haya genes duplicados
57:03que se especializan en los lugares del
57:05cuerpo donde se expresan. Entonces
57:07podrían compensar, pero no lo hacen.
57:09Okay.
57:12Lo en cambio el freno compensa. Si me
57:15falta un poco de los frenos de adelante,
57:17me andan mal los frenos de pie, tengo el
57:19freno de mano. Okay. Es distinto, pero
57:23puede cumplir un poco la función, ¿no?
57:27Un exón siempre para un dominio.
57:30¿Cómo?
57:30Un exón siempre va te va a dar un
57:32dominio.
57:33Pregunta descolgad. Bien. Exón.
57:36Un exón siempre codifica para un
57:38dominio, ¿no? Muchas veces sí.
57:48Okay. Otra posibilidad es que haya un
57:50cambio en el fenotipo,
57:52pero que no lo percibimos. Es decir,
57:54estamos en el caso en el que hacemos un
57:55knockout de un gen y no le vemos
57:59fenotipo, ¿okay?
58:01No le vemos fenotipo porque no lo
58:03pusimos en condiciones en donde se
58:06manifieste ese fenotipo. Por ahí esa ese
58:09ratón no puede comer lactosa,
58:12pero no le doy lactosa, por ejemplo.
58:16O puede ser que ahora no pueda aguantar
58:19subir a una montaña el ratón, pero está
58:22en el laboratorio. ¿Cómo? No lo sé. No
58:24lo sé. Puede ser que sea un gen
58:26necesario para las alturas.
58:30No me voy a dar cuenta. Okay.
58:34Entonces, esto lo que genera es que los
58:37a ratones que tienen un gen noqueado y
58:39no tienen un fenotipo aparente y no le
58:42encuentran genes redundantes, no saben a
58:44qué, para qué función tienen. Y la gente
58:47lo que hace son experimentos distintas
58:49funciones, ¿sí? Para ver qué podría ser.
58:54O puede ser que el G tenga una función
58:56en el adulto, muy adulto.
58:59Sí. Entonces, hasta que no llegue a ese
59:01momento no lo voy a saber. Fuera.
59:03Tenemos que esperar 2 años para saber
59:05que tenía una función en el ratón viejo.
59:15Y lo más interesante para poder publicar
59:17un lindo paper, sí, siempre es que haya
59:21un fenotipo manifiesto.
59:23Silencio, por favor.
59:27Silencio. Silencio.
59:30Fenotipo manifiesto. Las críasotas para
59:33el noocoutu nacen y presentan alguna
59:35alteración en su fenotipo que puede o no
59:38afectar su subsistencia fnatal.
59:41¿Okay? Por ejemplo, puede ser que no se
59:45puedan reproducir,
59:47no generen una parte del cuerpo, tengan
59:50los músculos esqueléticos mal
59:52desarrollados,
59:54sí tengan problemas de comportamiento,
59:57no puedan dormir, por ahí les falta un
59:59gen para el sueño.
1:00:02Sí, este tipo de resultados, obviamente
1:00:04el más interesante, permite describir la
1:00:06función del gen noqueado y en ciertos
1:00:07casos establecer modelos de ratones
1:00:09equivalentes a enfermedades
1:00:11hereditarios. humanas y usarlos para
1:00:14ensayar terapias génicas
1:00:16o de algún otro tipo.
1:00:18¿Okay? El ratón se utiliza, Marcelo lo
1:00:21dijo, como modelo de enfermedades
1:00:23humanas de las que se pueden.
1:00:27Sí.
1:00:29Los genes knockout generan condiciones
1:00:32fisiológicas que se asemejan a las
1:00:34condiciones que que tiene gente que
1:00:37tiene algún problema genético que le
1:00:39produce la mala mal funcionamiento de
1:00:41algún gen.
1:00:43Sí.
1:00:47Eh,
1:00:48sí.
1:00:50¿Por qué pasa eso? ¿Por qué se usan
1:00:52específicamente ratones? ¿Por qué se
1:00:54usan ratones en vez de
1:00:58cerdos? Porque tienen un comportamiento
1:01:01de laboratorio muy bueno, son fáciles de
1:01:03manipular, son relativamente fáciles de
1:01:06tener en los bioterios y tienen una vida
1:01:09de de replicación suficientemente
1:01:11rápida. Okay. Son menos inteligentes que
1:01:14los cerdos aparte,
1:01:16pero las enfermedades hereditarias
1:01:18serían en cualquier animal de la misma
1:01:20manera. Las enfermedades hereditarias
1:01:22serían igual en cualquier animal, no
1:01:24depende la fisiología del animal. Hay
1:01:26cosas que no vas a poder hacer un modelo
1:01:28de ratón. Sí. Enfermedad por ahora sí.
1:01:32¿Cómo usaras otro animal por ahí? Sí.
1:01:35Usar otro animal sí. Pero bueno, ahí
1:01:37empiezan las cuestiones de que la qué
1:01:39animales son permisivos para usar en el
1:01:40laboratorio, para hacer experimentos.
1:01:42Hay cosas que solo las puedes testear en
1:01:43monos, por ejemplo. Pero, ¿cuántos
1:01:45experimentos vas a hacer en monos? ¿Por
1:01:47qué vas a hacer experimento en monos? O
1:01:49sea, no es
1:01:51para eso. Humanos
1:01:54el modelo que obtengamos de algo que
1:01:56funciona. Encontramos conseguimos un
1:01:58modelo que funciona que pero en qué
1:02:02grado de similitud va a tener con
1:02:05va a tener el grado que tenga. Eh, tenés
1:02:10que ver muchos de los medicamentos se
1:02:13prueban en en ratones. Primero, si tenés
1:02:18un modelo de ratón de lo que querés
1:02:20curar con tu nuevo fármaco, usas el
1:02:22ratón. Sí. ¿Cuánto representa eso a lo
1:02:26que va a pasar después cuando en el
1:02:27humano? Y a veces sí, a veces no.
1:02:31Curas el cáncer en ratón, curaste el
1:02:33cáncer en humano por ahí sí, pero en
1:02:35general no. Sí.
1:02:41Bien. Depende, depende, ¿no? Es el tema
1:02:44de la materia eso.
1:02:47¿Tienen alguna duda de esto de cómo
1:02:49interpretar los knockouts?
1:02:52Tres formas, tres cosas pueden pasar.
1:02:55Letal, embrionario, no tengo fenotipo o
1:02:58tengo fenotipo. Y las conclusiones que
1:03:00voy a sacar son distintas.
1:03:03O sea, en es como que nosotros agarramos
1:03:06esto aquí para para ver eh
1:03:11si se sean algunos cables.
1:03:14No, no te escuché la pregunta.
1:03:17O sea, si si el es aleatorio,
1:03:21el knockout no es aleatorio,
1:03:23nosotros escogemos dónde va
1:03:26Nosotros escogemos el gen que queremos
1:03:29noquear.
1:03:35Si el gen que quiero noquear está causa
1:03:40un fenotipo parecido a una enfermedad,
1:03:43podría haber descubierto la causa de una
1:03:45enfermedad.
1:03:47Y podría usar a ese ratón para tratar de
1:03:50ver cómo curo la enfermedad
1:03:53o no.
1:03:56Sí, no todo está dirigido a curar
1:03:58enfermedades. Mucho es queremos saber
1:04:00cómo funcionan las cosas,
1:04:02¿sí? O tienen valor biotecnológico, como
1:04:06estuvimos viendo con los transferénicos.
1:04:08Por ahí no quiero curar nada, quiero
1:04:09producir algo de valor para vender
1:04:14por alguna razón. que puede tener que
1:04:16ver con la salud o no es más
1:04:18investigativos investigamos causa, o
1:04:21sea, no hemosado para Exactamente.
1:04:25Exactamente.
1:04:27Bien,
1:04:29también puedo hacer si el gen, un gen
1:04:32está fallado en en
1:04:35un determinado
1:04:37en el adulto, por ejemplo, podría haber
1:04:39una copia de un gen que sea el mismo
1:04:42gen, pero que se exprese en el embrión.
1:04:45Hay muchos genes que están duplicados y
1:04:48algunos expresan el embrión y algunos
1:04:50expresan el adulto. Si falla el del
1:04:52adulto, puedo tratar de despertar el gen
1:04:55del embrión en el adulto.
1:04:58Sí, van a haber un problema en la guía
1:05:01de seminarios donde se hace eso para
1:05:04tratar un tipo de anemia.
1:05:12¿Okay?
1:05:13Entonces uso CAS N9 con la guía. Yo le
1:05:17digo CAS9, CAS 9 con la guía. La guía me
1:05:20dice dónde corta. Si le doy, si no le
1:05:23doy con qué reparar, la célula lo repara
1:05:25como puede y genera algún tipo de
1:05:27mutación. En algunos casos sí, en otros
1:05:29casos no, pero si le doy algo con que
1:05:32recombinar, va a utilizar eso para
1:05:34reparar el daño.
1:05:37Okay. Y ahí es donde ahí es ahí donde
1:05:39puedo dirigir mis cambios [carraspeo] a
1:05:41donde yo quiero, como lo puedo hacer en
1:05:44un ovocito recién fecundado, puedo hacer
1:05:46la modificación genética en todo el
1:05:48individuo.
1:05:51¿Está claro?
1:05:53Bueno, ahora también lo puedo hacer en
1:05:56células en cultivo. Sí, muchos de los
1:05:59experimentos que se hacen en el
1:06:00laboratorio se hacen con células de
1:06:02ratón o células humanas en cultivo o
1:06:05otros organismos que no son
1:06:06multicelulares levaduras. ¿Sí?
1:06:10Entonces ahí también podemos usar K9 y
1:06:14no es necesario ahí inyectar la enzima
1:06:19ya preensamblada con la guía como
1:06:21habíamos mostrado que se hacía para los
1:06:23ooccitos, sino que lo que voy a hacer es
1:06:27cotranspectar. ¿Se acuerdan de la
1:06:28palabra transpectar?
1:06:31Es la el término que utilizamos para
1:06:34ponerle ADN a células en cultivo que
1:06:37sean eucariotas.
1:06:41el fragmento lineal para reparar con un
1:06:44plásmido, con un promotor que dirija la
1:06:46expresión de CAS9 y otro plásmido que
1:06:50tenga un promotor para la guía. Como la
1:06:52guía no es un mensajero, no puedo
1:06:55utilizar la un promotor de Pul 2, como
1:06:57vimos en clase. Tengo que usar un
1:06:59promotor que transcriba mensajeros, que
1:07:01no se le ponga cap eso.
1:07:05Okay. Entonces, uso el promotor de Pol
1:07:083. Pol es la en ARN polimerasa
1:07:12que transcribe los transfer.
1:07:15Okay.
1:07:21¿Qué? La diferencia respecto a simple
1:07:23transfectar.
1:07:24Transpectar y cotranspectar. ¿Qué
1:07:26diferencia hay?
1:07:29Yo soy autor o coautor.
1:07:32¿Qué diferencia hay? Si lo hiciste vos,
1:07:35dos, ¿lo hice yo solo o hay otro? Al
1:07:37menos. Pueden ser 20 coautores.
1:07:41Si yo transecto, transfecto una
1:07:42molécula, un tipo de molécula de ADN. Si
1:07:45cotranspo, mezclo distintas.
1:07:49Acá estoy cotransectando tres cosas. dos
1:07:51plásmidos y un ADN lineal.
1:07:55Este ADN lineal puede ser un pedazo de
1:07:57un plásmido o puede ser un producto de
1:07:58PCR.
1:08:00O sea, transpectar o transpectar es
1:08:02lo mismo.
1:08:03CL pero me refiero el proceso para poder
1:08:05generar mi ADN para no transfectar es
1:08:09que se meta dentro de la célula. Okay.
1:08:11Okay.
1:08:12Es como transformar bacterias,
1:08:14transfectar células eucariotas
1:08:17de organismos multicelulares.
1:08:20No terminé de entender en lo que estamos
1:08:21buscando hacer
1:08:22acá. Estamos buscando hacer lo mismo que
1:08:24estábamos mostré antes con cas, solo que
1:08:27en una célula de cultivo en vez de
1:08:29microinyectando en un ovocito,
1:08:32en vez de microinyectar un ovocito de
1:08:33ratón quiero mis células en cultivo, que
1:08:36las tengo en el laboratorio, hacerles
1:08:38una modificación genética a esas
1:08:40células.
1:08:42¿Cómo lo hago? No quiero hacer un ratón,
1:08:45quiero hacerlo en el laboratorio, en la
1:08:46placa en cultivo. No me voy a obligar a
1:08:49que lo hagan ratón. Y aparte si son
1:08:50células de mono, las quiero hacer. No
1:08:53voy a hacer un mono. Okay. Entonces,
1:08:55¿qué voy a hacer? Le tengo las células
1:08:57en cultivo, les agrego el ADN, ponerle
1:09:01que quiero arruinar este gen. Le agrego
1:09:04este ADN lineal, le agrego un plásmido
1:09:06con K9, le agrego un plásmido con la
1:09:08guía. Y acá dentro, ¿qué va a pasar?
1:09:10dentro de la célula se va a expresar
1:09:12CAS9, se va a expresar la guía, se van a
1:09:14ensamblar, van a cortar y este la célula
1:09:18va a usar esta maquinaria para hacer la
1:09:21recombinación homóloga.
1:09:22¿Por qué tiene que estar separado?
1:09:24¿Quiénes
1:09:25CAS y su
1:09:27no pueden estar en el mismo plido, pero
1:09:29tienen que ser unidades
1:09:30transcripcionales separadas porque esto
1:09:32tiene un promotor de pol dos y esto
1:09:33tiene un promotor de pol 3.
1:09:36No tienen que estar en plasmios
1:09:37separados, pero pueden estar en plasmios
1:09:39separados.
1:09:44Entonces, de esa manera voy a lograr
1:09:46modificaciones genéticas en las células
1:09:48en cultivo
1:09:52para los experimentos que yo quiera
1:09:53hacer en el laboratorio.
1:09:57¿Alguna pregunta?
1:09:59Vos dijiste que ponemos un promotor para
1:10:02la guía de CAS9, pero que eh
1:10:05la guía de CAS9 es ahí en ese plasmido
1:10:07es ADN, como la guía es ARN, alguien lo
1:10:10tiene que transcribir
1:10:11para que se transcriba le tengo que
1:10:13poner un promotor. Pero si le pongo,
1:10:15¿qué?
1:10:16No,
1:10:21le pongo un promotor, pero que no sea un
1:10:23promotor de mensajero. No quiero que
1:10:25tenga cap y polar, no sirve. Eso tiene
1:10:29que ser ARN para la guía de K9, que es
1:10:32un ARN desnudo, sin nada, sin ninguna
1:10:35modificación en ninguna parte.
1:10:38promotor
1:10:39por con de la
1:10:42acá está el promotor, un promotor
1:10:45constitutivo,
1:10:47un promotor constitutivo que se exprese
1:10:50en las células que voy a transmitar y el
1:10:52río abajo clonee el marco de lectura de
1:10:57la enzima K9.
1:10:59Entonces acá se hace un mensajero, se
1:11:00traduce adentro de la célula y se hace
1:11:02la enzima.
1:11:03Sí. Y aparte se transcribe de este
1:11:06plásmido con la RNA poltre la guía. El
1:11:09RNA de la guía.
1:11:11Pero la RNA 3 está dentro de la célula,
1:11:14por supuesto. No es la RNA por 3, es un
1:11:17promotor de la que lo reconoce la RN
1:11:20polimerasa 3. Para que la polimerasa se
1:11:23pueda unir ahí.
1:11:24Acá se une polimerasa 3 y transcribe
1:11:27transcribe la guía de CAS 9.
1:11:30Acá hay un promotor de Pol, pero no digo
1:11:34de Pol
1:11:36son promotores de mensajeros, son del
1:11:38ARN Pol 2, sí que puede ser un promotor
1:11:42fuerte, por ejemplo, el promotor de
1:11:43actino, un promotor que se exprese
1:11:45constitutivamente en todas las células.
1:11:48Entonces, me garantizo de que cuando
1:11:49esto entre acá se exprese.
1:11:51O sea, cuando la RN ya es el producto
1:11:55final, eh hay otra polimeraza para eso
1:11:58no quiero que se traduzca esto, no
1:12:00quiero que tenga capa, no quiero que
1:12:02tenga polia, entonces tengo que usar una
1:12:04polimerasa que no haga eso, como la
1:12:06polimerasa de los ARN de transferencia.
1:12:09Sí,
1:12:12es que tienen promotores diferentes, no
1:12:14tiene databox y eso
1:12:17es otro promotor con otra lógica.
1:12:22No hay que confundirse. Las polimerazas
1:12:25no se pueden confundir.
1:12:28Y sobre el nombre Crisper Cas9, ¿qué
1:12:32parte sería Crisper y qué parte sería C?
1:12:34es el
1:12:36la
1:12:40no crisper es el proceso que
1:12:43descubrieron donde hay enzimas con guías
1:12:46que cortan y agarran pedazos de lo que
1:12:50cortan y lo enchufan adentro de la
1:12:51bacteria como una especie de eh libro de
1:12:55notas de todos los virus que fueron eh
1:12:57infectando la bacteria. Eso es el
1:13:00proceso de Crisper que tiene una enzima
1:13:02que se llama CAS 9.
1:13:04¿Okay?
1:13:05Okay. Tiene otras enzimas que no estamos
1:13:07usando. Lo único que queremos usar
1:13:09aparte de K9 es la guía. Y la guía la
1:13:12hago por mi cuenta. No uso la maquinaria
1:13:15nativa de Crisper.
1:13:18Okay. Se dice Crisper. La gracia es la
1:13:22enzima K9 y la guía. Y hay otras enzimas
1:13:25que hacen cosas parecidas que me pueden
1:13:27servir de manera diferente. Yo les estoy
1:13:29explicando la el uso más básico y más
1:13:32conocido.
1:13:35[carraspeo]
1:13:43Hacemos un intervalo ahora y después
1:13:44viene la última parte. 10 minutos de
1:13:46intervalo.
1:13:4810 minutos de intervalo. Una pregunta,
1:13:50perdón, una cosita rápida.
1:13:53Se agregan losores del CAS 9 y de la
1:13:56guía del CAS 9 para volver como para
1:13:58potenciar la tasa de modificación para
1:14:01que en un momento los propios se
1:14:02empiecen a modificar porque también
1:14:04producen
1:14:07producen la guía, pero después se van,
1:14:09no quedan para siempre, solo sirve
1:14:12cuando se repara con el ADN
1:14:18motores para sacar nu la guía.
1:14:22y se hace que se haga la modificación y
1:14:24listo. No se quedan los
1:14:34Yo creo que te contuniste
1:14:37mi respuesta. Yo no te entendí la
1:14:39pregunta.
1:14:47El promotor de es un productor
1:14:50constitutivo
1:14:52de alina de cualquier cosa y río abajo
1:14:56nuev
1:15:01adentro de los para que se ensamblen y
1:15:04cort
1:15:17El otro día le encontré a
1:15:32propiamente la encima Trae la guía o
1:15:35está flotando por ahí y eso ahí.
1:15:37No, no me da la pata. Voy a hacer por
1:15:39Está flotando por ahí. Eso está rojo y
1:15:40azul.
1:15:40Y la agarra la CAS nu.
1:15:42No, CAS nu no la agarra. Cas nu corta y
1:15:45se va.
1:15:45Perdón.
1:15:46La la célula la agarra para hacer la
1:15:49recombinación homóloga.
1:15:50Okay. Okay. Sí, sí. Okay. Entonces,
1:15:54aunque no lo diga ahí también tengo que
1:15:56poner la polimeraz dos y tres para que
1:15:58se pueda alcoholficar el cambio,
1:15:59¿no? Entro de la célula. La célula tiene
1:16:02todo. Ah.
1:16:03Ya lo ponemos adentro de la célula.
1:16:05Transfectar dice ahí.
1:16:08Transfectar es poner dentro de la
1:16:09célula.
1:16:11Lo tengo que Sí, lo voy a explicar de
1:16:13vuelta.
1:16:24Ah, ¿cuánto tiempo de descanso tenemos?
1:16:2710 minutos.
1:16:29Ahora ya te quedan siete.
1:16:32Ok. Ok.
1:17:25[risas]
1:17:43por comodidade.
1:17:47se hace pronuncio porque después el
1:17:50ratón bar
1:17:53se hacen el núcleo para que ahí ocurre
1:17:57se va, no se queda más
1:18:00una sola vez
1:18:05que queda queda un día para quedaría
1:18:17Yo quiero que la
1:18:21o la de
1:18:26le doyes
1:18:56Amén.
1:20:56Gracias,
1:22:03Eh,
1:22:35más que nada
1:22:38deducir cosas.
1:23:17Te digo que tenés una pregunta.
1:23:20No,
1:23:25bueno,
1:23:28ya sé
1:23:35qué les parece esta aula
1:23:40más cómoda, la Pero para la claseiro
1:23:49más
1:25:00Bueno, ¿en qué espera para volver?
1:26:29baj.
1:26:37Bueno, empiezo
1:26:39acá. Había unas preguntas que me
1:26:41hicieron que me gustaría. Eh,
1:26:45Chicos, ¿ustedes se van o vuelven?
1:26:56Los estoy esperando a ustedes.
1:27:13Quería aclarar
1:27:15sobre esta misma
1:27:18slide. Me hicieron unas preguntas.
1:27:22A ver, dos cosas. En el caso de los
1:27:25obocitos, microinyecto, la proteína ya
1:27:29hecha, porque me conviene, es muy
1:27:32eficiente y tengo que microinyectar
1:27:34cadaito con algo. Igual algo tengo que
1:27:36microinyectar. Sí, puedo microinyectar
1:27:40ARN de CAS9 o puedo inyectar el ADN de
1:27:44C9 para que se transcriba, lo cual es
1:27:46mucho más lento o puedo inyectar la
1:27:48proteína ya hecha.
1:27:49que es lo más rápido y eficiente.
1:27:53[carraspeo]
1:27:54En el caso de las células en cultivo,
1:27:56tengo millones de células que quiero
1:27:58modificar. Sí, no es una sola, no voy a
1:28:02microinyectar cada célula. Lo que voy a
1:28:05usar es la técnica de transpción que me
1:28:08permite introducir ADN foráneo en
1:28:10células animales.
1:28:13¿Y qué le inyecto? Solo le inyecto ADN,
1:28:17en este caso de tres clases. El ADN
1:28:20lineal con el que voy a reparar el corte
1:28:23que va a ser. ¿Quién? CAS9.
1:28:26CAS9. La pongo directamente al encima,
1:28:29¿no? Pongo el gen de CAS9. El gen de
1:28:32CAS9 sí, bajo el control de un promotor
1:28:36que va a ser leído por estas células.
1:28:39Esas células tienen todas sus
1:28:40polimerasas y sus cosas funcionan
1:28:43normalmente. Lo único que tengo que
1:28:44hacer es darle las instrucciones a la
1:28:46célula.
1:28:48¿Cuáles son las instrucciones? El gen y
1:28:51el promotor. Esto adentro de la célula
1:28:53se va a expresar y esto dentro de la
1:28:55célula también se va a expresar. Acá se
1:28:58va a expresar y traducir y acá se va a
1:28:59expresar el mensaje, el el ARN no más
1:29:02que se va a ensamblar en la enzima y acá
1:29:04dentro va a ocurrir la modificación.
1:29:07¿Cuánto va a durar? va a durar poco
1:29:09porque estos plásmidos no se pueden
1:29:11replicar adentro de la célula.
1:29:14Entonces va se va a transcribir un
1:29:17tiempo por ahí un día y después ya no se
1:29:19va no va a estar más. Las células que
1:29:21surjan de acá no van a tener cas9 ni la
1:29:24guía.
1:29:25Es posible que la maquinaria de
1:29:27reparación tome el plasmido, lo
1:29:29linealice y lo meta dentro del
1:29:31cromosoma.
1:29:32Podría ocurrir en algunos casos en que
1:29:34lo meta dentro de la célula. un
1:29:36un evento muy poco frecuente. Sí, podría
1:29:38ocurrir.
1:29:41¿Por qué no la secuencia de nu la guía
1:29:45en el fragmento lineal que está?
1:29:48La guía. Estas dos cosas yo no quiero
1:29:51que queden en la célula,
1:29:53yo quiero que quede en la célula lo que
1:29:55yo quiero que quede en la célula. Si a
1:29:57mí se me ocurrió que la guía quiero que
1:29:58quede en la célula, la pongo.
1:30:01Pero estos son las herramientas para que
1:30:04esto se meta acá, nada más.
1:30:09Okay,
1:30:13listo. Bueno, ahora voy a cambiar de
1:30:15tema, después me pueden preguntar de lo
1:30:17que quieran.
1:30:21En la primera clase habíamos hablado de
1:30:23que todas las células tienen el mismo
1:30:25genoma y que eso queda verificado por
1:30:29los experimentos de clonado
1:30:33que se hicieron con la oveja Doli y
1:30:35antes con la rana. Sí, con Xenopus. Sí.
1:30:41En este experimento, ¿qué habíamos
1:30:42hecho? Habíamos destruido el núcleo del
1:30:45óvulo de una oveja y lo habíamos
1:30:49reemplazado por el núcleo sacado de otra
1:30:51oveja. El núcleo acá adentro
1:30:56se reprograma.
1:30:58Hay cosas en el citoplasma del óvulo que
1:31:01hacen que el núcleo, que era un núcleo
1:31:03de una célula de epitelio de mama, pase
1:31:06a ser el núcleo de una pase a ser una
1:31:09célula de un núcleo de una célula
1:31:11totipotente que puede generar todos los
1:31:14tejidos del cuerpo, incluida la
1:31:15placenta, porque si no no funcionaría el
1:31:19clonal. Quiere decir que acá adentro
1:31:21pasa la reprogramación de la célula del
1:31:24núcleo, porque el citoplasma tiene
1:31:27material que le permite al núcleo
1:31:29cambiar su destino, revertir en el
1:31:33tiempo, volver a cuando era joven y era
1:31:36solo óvulo y empezar a expresar los
1:31:39genes de las células embrionarias.
1:31:42¿Correcto?
1:31:47Bueno, y yo les había contado que en
1:31:502012 le había vividieron el Premio Nobel
1:31:52a John Gurdon porque había hecho ese
1:31:54mismo experimento
1:31:56que hablamos recién en la rana, en
1:31:59Xenopus Laevis. Sí. y a Yamanakaca
1:32:03porque descubrió cómo hacer para en el
1:32:06laboratorio agarrar unas células
1:32:08diferenciadas, por ejemplo, de epitelio
1:32:10de mama o de neurona o de lo que sea y
1:32:13revertirla a célula embrionaria. ¿Okay?
1:32:17Entonces, ahora les voy a contar cómo se
1:32:19hace eso
1:32:25a todos menos a los que no volvieron.
1:32:29[carraspeo]
1:32:31Bueno, Yamanakaca
1:32:34sí dijo, "Bueno, si las células
1:32:37embrionarias son embrionarias, quiere
1:32:40decir que deben tener factores de
1:32:42transcripción que no están en otros
1:32:45tejidos y que hacen que se expresen los
1:32:47genes de células embrionarias." Algo que
1:32:50ustedes también podrían haber dicho,
1:32:52¿correcto? Porque ustedes saben que las
1:32:54células expresan lo que le corresponde a
1:32:56su tejido gracias a que tienen factores
1:32:58de transcripción específicos para ese
1:33:00tejido, porque los genes están en todos,
1:33:04¿correcto?
1:33:06Entonces, él empezó a buscar cuáles eran
1:33:08esos factores y entonces de la lista de
1:33:10factores de transcripción que conocían
1:33:12dijeron, "Bueno, deben ser alguno de
1:33:14estos 24 factores de transcripción."
1:33:18Y efectivamente, cuando agarran células,
1:33:22por ejemplo, de fibroblastos
1:33:25y las transfectan con los 24 factores de
1:33:28transcripción a la vez, las células se
1:33:32desdiferencian en células, se
1:33:35transforman en células embrionarias.
1:33:38Okay. Pero 24 es un montón. Y dijo,
1:33:40bueno, seguramente no son los 24, deben
1:33:44ser algunos y otros no.
1:33:46Entonces, sobre esta misma
1:33:50slide me hicieron unas preguntas.
1:33:54A ver, dos cosas. En el caso de los
1:33:57ovocitos, microinyecto la proteína ya
1:34:01hecha, porque me conviene, es muy
1:34:04eficiente y tengo que microinyectar cada
1:34:06booscito con algo. Igual algo tengo que
1:34:08microinyectar. Sí, puedo microectar ARN
1:34:13de CAS9 o puedo inyectar el ADN de CAS9
1:34:16para que se transcriba, lo cual es mucho
1:34:18más lento o puedo inyectar la proteína
1:34:20ya hecha, que es lo más rápido y
1:34:23eficiente.
1:34:26En el caso de las células en cultivo,
1:34:29tengo millones de células que quiero
1:34:30modificar. Sí, no es una sola, no voy a
1:34:34microinyectar cada célula. Lo que voy a
1:34:37usar es la técnica de transpción. que me
1:34:40permite introducir ADN foráneo en
1:34:42células animales.
1:34:45¿Y qué le inyecto? Solo le inyecto ADN,
1:34:49en este caso de tres clases. El ADN
1:34:52lineal con el que voy a reparar el corte
1:34:55que va a ser ¿Quién? CAS9.
1:34:58CAS9 la pongo directamente al encima,
1:35:01¿no? Pongo el gen de K9. El GC 9, ¿sí?
1:35:06Bajo el control de un promotor que va a
1:35:09ser leído por estas células. Esas
1:35:11células tienen todas sus polimeras y sus
1:35:13cosas funcionan normalmente. Lo único
1:35:16que tengo que hacer es darle las
1:35:17instrucciones a la célula.
1:35:20¿Cuáles son las instrucciones? El gen y
1:35:23el promotor. Esto adentro de la célula
1:35:25se va a expresar y esto adentro de la
1:35:27célula también se va a expresar. Acá se
1:35:30va a expresar y traducir y acá se va a
1:35:31expresar el mensaje, el el ARN no más
1:35:34que se va a ensamblar en la enzima y acá
1:35:36dentro va a ocurrir la modificación.
1:35:39¿Cuánto va a durar? Va a durar poco
1:35:41porque estos plásmidos no se pueden
1:35:43replicar adentro de la célula.
1:35:46Entonces va se va a transcribir un
1:35:49tiempo por ahí un día y después ya no se
1:35:51no va a estar más. Las células que
1:35:53surjan de acá no van a tener CAS9 ni la
1:35:56guía. ¿Es posible que la maquinaria de
1:35:59reparación tome el plasmido, lo
1:36:01linealice y lo meta dentro del
1:36:03cromosoma?
1:36:04Podría ocurrir en algunos casos en que
1:36:06lo meta dentro de la célula. Es un un
1:36:08evento muy poco frecuente.
1:36:10Sí, podría ocurrir.
1:36:13¿Por qué no la secuencia de nu la guía
1:36:17en el fragmento que teniendo?
1:36:20La guía. Estas dos cosas yo no quiero
1:36:23que queden en la célula.
1:36:25Yo quiero que quede en la célula lo que
1:36:27yo quiero que quede en la célula. Si a
1:36:29mí se me ocurrió que la guía quiero que
1:36:30quede en la célula, la pongo.
1:36:33Pero estos son las herramientas para que
1:36:36esto se meta acá nada más.
1:36:41Okay.
1:36:45Listo. Bueno, ahora voy a cambiar de
1:36:47tema. Después me pueden preguntar de lo
1:36:49que quieran.
1:36:53En la primera clase habíamos hablado de
1:36:55que todas las células tienen el mismo
1:36:57genoma y que eso queda verificado por
1:37:01los experimentos de clonado
1:37:05que se hicieron con la oveja Doli y
1:37:07antes con la rana. Sí, con xenopus. Sí.
1:37:13En este experimento, ¿qué habíamos
1:37:14hecho? Habíamos destruido el núcleo del
1:37:17óvulo de una oveja y lo habíamos
1:37:21reemplazado por el núcleo sacado de otra
1:37:23oveja.
1:37:25El núcleo acá adentro
1:37:28se reprograma.
1:37:30Hay cosas en el citoplasma del óvulo que
1:37:33hacen que el núcleo, que era un núcleo
1:37:35de una célula de epitelio de mama, pase
1:37:38a ser el núcleo de una pase a ser una
1:37:41célula de un núcleo de una célula
1:37:43totipotente que puede generar todos los
1:37:46tejidos del cuerpo, incluida la
1:37:47placenta, porque si no no funcionaría el
1:37:51clonal. Quiere decir que acá adentro
1:37:53pasa la reprogramación de la célula del
1:37:56núcleo, porque el citoplasma tiene
1:37:59material que le permite al núcleo
1:38:01cambiar su destino, revertir en el
1:38:05tiempo, volver a cuando era joven y era
1:38:08solo óvulo y empezar a expresar los
1:38:11genes de las células embrionarias.
1:38:14¿Correcto?
1:38:19Bueno, y yo les había contado que en
1:38:222012 le había vividieron el premio Nobel
1:38:24a John Burdon porque había hecho ese
1:38:26mismo experimento
1:38:28que hablamos recién en la rana, en
1:38:31Xenopus Laevis. Sí. y a Yamanca porque
1:38:35descubrió cómo hacer para en el
1:38:38laboratorio agarrar unas células
1:38:40diferenciadas, por ejemplo, de epitelio
1:38:42de mama o de neurona o de lo que sea y
1:38:45revertirla a célula embrionaria. ¿Okay?
1:38:49Entonces, ahora les voy a contar cómo se
1:38:51hace eso
1:38:57a todos menos a los que no volvieron.
1:39:01[carraspeo]
1:39:03Bueno, Yamanakaca
1:39:06sí dijo, "Bueno, si las células
1:39:09embrionarias son embrionarias, quiere
1:39:12decir que deben tener factores de
1:39:14transcripción que no están en otros
1:39:17tejidos y que hacen que se expresen los
1:39:19genes de células embrionarias." Algo que
1:39:22ustedes también podrían haber dicho,
1:39:24¿correcto? Porque ustedes saben que las
1:39:26células expresan lo que le corresponde a
1:39:28su tejido gracias a que tienen factores
1:39:30de transcripción específicos para ese
1:39:32tejido, porque los genes están en todos,
1:39:36¿correcto?
1:39:38Entonces, él empezó a buscar cuáles eran
1:39:40esos factores y entonces de la lista de
1:39:42factores de transcripción que conocía
1:39:44dijeron, bueno, deben ser alguno de
1:39:46estos 24 factores de transcripción.
1:39:50Y efectivamente, cuando agarran células,
1:39:54por ejemplo, de fibroblastos
1:39:57y las transfectan con los 24 factores de
1:40:00transcripción a la vez, las células se
1:40:04desdiferencian en células, se
1:40:07transforman en células embrionarias.
1:40:10Okay. Pero 24 es un montón. Y dijo,
1:40:12bueno, seguramente no son los 24, deben
1:40:16ser algunos y otros no.
1:40:18Entonces empezó a sacar factores de
1:40:20transcripción hasta encontrar cuáles si
1:40:23los sacaba ya no eran células
1:40:25embrionarias, no se transformaban en
1:40:27células embrionarias y se quedó con
1:40:30cuatro factores de transcripción:
1:40:34MIC, OCT 4, Sox 2 y KLF4.
1:40:43Entonces, si yo cotranspecto
1:40:47estos plácidos que tienen un promotor
1:40:49constitutivo,
1:40:52cada uno con CDNA
1:40:55de estos cuatro factores de
1:40:57transcripción,
1:40:58a las los meto a las células esas, las
1:41:01células esas van a empezar a expresar
1:41:04genes de células embrionarias. se van a
1:41:08reprogramar como le pasaba al óvulo de
1:41:12al núcleo
1:41:15microinyectado en el óvulo y van a
1:41:17empezar a expresar genes específicos de
1:41:20células embrionarias y van a formar
1:41:22estas pelotitas que son los células
1:41:26embrionarias.
1:41:32¿Qué les parece a ustedes que serán
1:41:35estos factores de transcripción?
1:41:42¿Qué dijiste?
1:41:45No, pero está bien. ¿Por qué la
1:41:48hipótesis de que son genes maestros?
1:41:52Porque cuando se activan activarán un
1:41:55montón de de otros genios que hacen que
1:41:58esa célula sea, claro, por ejemplo,
1:42:01factores de transcripción
1:42:04para que se expresen ciertos genes que
1:42:06van a terminar de darleidad
1:42:09de la célula.
1:42:10Hay que cambiar la identidad de la
1:42:11célula. Pasamos de células de músculo o
1:42:14células de fibroblasto a expresar un
1:42:17patrón de expresión completamente
1:42:19diferente. Necesito genes maestros que
1:42:22reprogramen todo, que empiecen
1:42:24[resoplido] a expresar un perfil
1:42:28completamente diferente. ¿Sí? Y aparte
1:42:31esos genes son genes maestros porque
1:42:34cuando yo los estoy poniendo en
1:42:35plásmidos que no se replican,
1:42:39están un tiempito y después ya no hacen
1:42:41falta más. La célula una vez
1:42:43reprogramada sigue sola. Eso es lo que
1:42:46habíamos visto que hacen los genes
1:42:48maestros. Los genes maestros se expresan
1:42:49en algún momento del desarrollo y hacen
1:42:52que las células se transformen en el
1:42:54tejido que van a hacer, pero después no
1:42:56son más necesarios.
1:42:59La célula se queda sola en su nuevo
1:43:02estadío, en su nuevo estado de
1:43:04diferenciación.
1:43:06Esto fue una gran revolución. Justamente
1:43:09le dieron el premio Nobel a llamar acá.
1:43:11No, por nada.
1:43:14Sí. Y entonces es posible estos dos Socs
1:43:182 y O 4 son
1:43:21[carraspeo] genes maestros.
1:43:23KF4 también funciona como gen maestro,
1:43:26pero tiene algunas otras funciones y en
1:43:28cambio MIC es un gen facilitador, es un
1:43:30factor de transcripción presente en
1:43:32todas las células, pero es muy
1:43:33importante para la mitosis, ayuda mucho
1:43:36a la mitosis, así que al principio es
1:43:39necesario que esté mic, después las
1:43:40células se las arreglan solas una vez
1:43:43que son reprogramadas.
1:43:48¿Tienen
1:43:53preguntas de esto?
1:43:55Clarísimo. E
1:43:58respecto a la énfasis facilitador, no es
1:44:01nunca maestro, pero no entend
1:44:03ayuda en la mitosis. Es necesario para
1:44:05la mitosis de las células. Si esta
1:44:07célula se tiene que dividir, entonces es
1:44:09necesario que esté micro. Y no sé por
1:44:11qué otras razones hace falta micro. Ya,
1:44:13porque te iba a preguntar que no todas
1:44:16las células que se dividen necesitarían
1:44:19entonces de oí
1:44:20que luego vuelve a mic particular del
1:44:23proceso para tener una célula
1:44:24exclusivamente potente.
1:44:26No sé exacto por qué hace falta una
1:44:28cantidad elevada de mic al principio
1:44:30para la reprogramación.
1:44:35¿Okay?
1:44:36Eh, en cáncer tendrían que activarse los
1:44:38cuatro genes juntos para poder generar
1:44:41eh que las células vuelvan a un estado
1:44:45pluripotente.
1:44:47No entiendo la pregunta. ¿Qué tiene que
1:44:48ver el cáncer acá?
1:44:49Eh, en un tumor que se desdiferencia,
1:44:54¿tendría necesariamente que activar las
1:44:56cuatro o
1:44:58los tumores se desdiferencian de otras
1:45:00maneras?
1:45:01No se desdiferencian a células
1:45:03embrionarias. por ahí algún tipo de
1:45:05tumor, sí, pero el tumor tiene
1:45:07mutaciones genéticas que hacen que no no
1:45:10se hace otra cosa.
1:45:11Okay.
1:45:20En los plásmidos se van a perder, no se
1:45:23van a poder expresar a partir de los
1:45:25plásmidos. Ahora, si la célula
1:45:27embrionaria lo quiere expresar, lo va a
1:45:30expresar. De hecho, los va a expresar.
1:45:33Estos genes van a empezar a expresarse a
1:45:37partir de los genes endógenos de las
1:45:38células.
1:45:41Estos son los que empiezan, después se
1:45:43pierden los plásmidos y al OC 4 y Sox 2
1:45:47se van a expresar en las propias células
1:45:49que yo transfecté.
1:45:52Desarrollo embrionario normal
1:45:55se van a expresar como se expresan todos
1:45:56los genes durante el desarrollo
1:45:58embrionario normal. Pero una vez que se
1:46:00diferencia la célula ya no más,
1:46:05pero no te entiendo bien. Estos
1:46:07plásmidos se pierden a los días.
1:46:10Claro, pero no pregunto de plá, sino que
1:46:14si son si estos penes normalmente son
1:46:17exclusivos de células
1:46:19son exclusivos. La combinación es
1:46:22exclusiva de células pluripotentes.
1:46:26Okay.
1:46:28Eh, ¿cómo es? ¿Cómo son las citas en
1:46:31inglés?
1:46:33¿Cómo
1:46:34cómo son? ¿Cómo es la cita en inglés? I
1:46:36PSC para
1:46:38induced pluripotent st cells.
1:46:44La I, o sea, P pluripotent st cells son
1:46:47las células. En este caso no son
1:46:49naturales, son inducidas,
1:46:52por eso se llama induced plurotent
1:46:55systeme.
1:46:59Okay.
1:47:01Bueno, ahora voy a aprovechar esto para
1:47:05explicar cómo se hace esto, cómo hago.
1:47:09Algunas de las células que yo transfecté
1:47:11se van a reprogramar, pero muchas otras
1:47:13no. Yo necesito quedarme solamente con
1:47:17las células que se reprogramaron. ¿Cómo
1:47:20sé cuáles son las células que se
1:47:22reprogramaron de todas las que yo
1:47:23transfecté?
1:47:29Voy a matar a todas las que no se
1:47:31reprogramaron. ¿Cómo mato las que no se
1:47:34reprogramaron? Poniendo una resistencia
1:47:37en el antibión y en cuanto
1:47:40usó antibiótico. Pero, ¿por qué no? No,
1:47:44todas las células reciben los plásmos,
1:47:47solo que no se reprograman todas. La hay
1:47:50una probabilidad de reprogramarte,
1:47:54le entran los factores de transcripción,
1:47:56pero no es que todas las células que lo
1:47:58reciben necesariamente se van a
1:47:59reprogramar. Algunas se van a
1:48:01reprogramar y otras no, pero todas van a
1:48:04recibir lo que yo le agrego acá. ¿Cómo
1:48:07hago para matar a todas las que no se
1:48:09reprogramaron, que son las que se
1:48:10pusieron verdes acá?
1:48:14Tal vez un antibiótico que percione las
1:48:16células del tejido delmo adulto que no
1:48:18sea diferenciario, diferencial,
1:48:21pero yo quiero matar a esas. El
1:48:23antibiótico va a hacer que no se muera.
1:48:26Y la resistencia, el gen de resistencia.
1:48:29Le pongo un antibiótico. Las que van a
1:48:31sobrevivir son las que expresen el gen
1:48:32de resistencia. ¿Cómo hago para que
1:48:35expresen el gen de resistencia solo las
1:48:38que se reprogramaron? poniéndole cuatro
1:48:41mejor,
1:48:42cuatro
1:48:44eh factores de transcripciónamente
1:48:47tienen esos cuatro factores de
1:48:48transcripción
1:48:48de estos
1:48:49de estos
1:48:51si pongo los cuatro enhancers
1:48:52si pongo los cuatro enhancers
1:48:54va a funcionar con cualquiera de los
1:48:55factores. Vos querés que solo los
1:48:58cuatro.
1:48:58Claro, solo los cuatro.
1:48:59Eso, ¿cómo hago para que se exprese el
1:49:03gen de resistencia solo en las células
1:49:06reprogramadas?
1:49:10resistencia
1:49:12con qué promotorqua.
1:49:17Un promotor que sea reconocido.
1:49:19Si pongo cualquiera va a expresarse en
1:49:21todas las células
1:49:22y si le ponés muy abajo de uno de los
1:49:24promotores, el pláido se mete en todas
1:49:27las células.
1:49:27Sí, el plásmido se mete en todas las
1:49:29células, pero no se reprograman todas
1:49:31las células.
1:49:33Yo quiero seleccionar a las que se
1:49:35reprograman.
1:49:37motor que solamente se yo le pongo estos
1:49:40cuatro plásmidos a un millón de células,
1:49:441000 se reprograman.
1:49:46El resto no se reprogram por decir un
1:49:49número. ¿Qué quiere decir que se
1:49:51reprograma?
1:49:53Que se transforman en células
1:49:54pluripotentes.
1:49:56¿Cómo sé que son células pluripotentes?
1:49:58Porque están extensción y está
1:50:00habilitando genes que son propios.
1:50:03Se están expresando genes propios de las
1:50:07células pluripotentes.
1:50:09Y si
1:50:10solo de las células pluripotentes.
1:50:12¿Cómo sé que una célula es pluripotente?
1:50:15Porque expresa genes de de célula
1:50:18pluripotente,
1:50:19¿o no?
1:50:21Entonces, quiere decir que hay
1:50:23promotores que solo responden a los
1:50:26factores de transcripción que se
1:50:28despiertan en las células pluripotentes
1:50:32gracias a estos factores de
1:50:33transcripción.
1:50:36Lo entonces lo que tengo que hacer es
1:50:38encontrar algún gen que a mí me guste
1:50:40que solo se exprese en células
1:50:42pluricotentes y usar ese promotor.
1:50:52Solo preguntarte esto.
1:50:53Sí.
1:50:54¿Qué?
1:50:55Eh, podríamos ponerle una proteína
1:50:58fluorescente al final de un gen que
1:51:00sabemos que se expresa con un promotor
1:51:02que necesita esos eh factores de
1:51:04transcripción
1:51:05para que se ponga verde.
1:51:06Exacto.
1:51:06Sí,
1:51:10vuelta.
1:51:11De vuelta.
1:51:12Todo de vuelta.
1:51:15Tengo mis células. Tengo mis células que
1:51:18quiero reprogramar.
1:51:21Tengo mis células transfectadas con los
1:51:24cuatro plásmidos.
1:51:27Todas expresan lo que expresan, algunas
1:51:30se reprograman. Yo quiero quedarme con
1:51:32las que se reprograman
1:51:35y formen estas montañitas
1:51:38y todas las otras se murieron. ¿Okay?
1:51:41¿Cómo hago? Lo que hago es agregarle a
1:51:43estas células un gen que tenga
1:51:48resistencia a un antibiótico y para
1:51:50conveniencia nuestra también la proteína
1:51:53fluorescente, una fusión del gen de
1:51:56resistencia y después del gen de
1:51:58resistencia que es una enzima que
1:52:00degrada al antibiótico, sigue la
1:52:02proteína fluorescente. Entonces, las
1:52:04células que expresen el gen de
1:52:06resistencia van a permitir a la célula
1:52:10sobrevivir la presencia del antibiótico
1:52:12y al investigador verla verde.
1:52:17Le tengo que poner un promotor
1:52:20que sea específico de células
1:52:22pluripotentes.
1:52:24Un promotor que no se expresen las
1:52:25células antes, ni que se exprese en
1:52:28ninguna otra célula a las cuales podrían
1:52:30haber sido reprogramadas por RAR. un
1:52:33promotor específico de células
1:52:35pluripotentes. Por ejemplo, el promotor
1:52:38de el gen Nanog.
1:52:42Nanog no nos importa lo que hace. es un
1:52:45gen que solo se expresa en células
1:52:47pluripotentes.
1:52:49Entonces ese promotor, porque ese
1:52:51promotor va a tener enhancers
1:52:53específicos que van a ser reconocidos
1:52:56por factores de transcripción en las
1:52:58células que fueron reprogramadas por los
1:53:02factores deataj.
1:53:09Entonces esas células se van a poner
1:53:10verdes, no solo verdes, sino que se van
1:53:12a van a resistir al antibiótico. Si la
1:53:16célula adulto tenía esta forma
1:53:18semitriangular, la célula cloripotente
1:53:22inducida por la los factores de
1:53:24llamanaca va a ser redonda.
1:53:27Son mesféricas las células
1:53:28prelurotentes.
1:53:29¿Estamos insertando el gen completo con
1:53:31su promotor o estamos insertando el gen
1:53:33río abajo del promotor que sabemos dónde
1:53:35está? sin su gen, solamente el promotor.
1:53:39El promotor y esto es un gen de
1:53:42selección, ¿no? Estoy seleccionando las
1:53:46células que yo quiero porque le puse un
1:53:48promotor de que se expresa en las
1:53:50células que yo quiero
1:53:53sin el gen nanod, [carraspeo] solamente
1:53:55el promotor.
1:53:56Claro, claro. Pero le estamos metiendo
1:53:58también el promotor, además de el gen de
1:54:00resistencia y el GFP, ¿no? que buscamos
1:54:03nanog en la célula y le metemos justo
1:54:05después el
1:54:06Exactamente. Esto es una construcción
1:54:07independiente que yo hice.
1:54:10No entiendo por qué el antibiótico.
1:54:12Quiero matar a las que no se
1:54:13reprogramaron. Quiero quedarme solo con
1:54:16las que se reprogramaron.
1:54:18Y pero si todas tien
1:54:21No se reprograman todas
1:54:22no. Pero
1:54:23las quiero matar a las que no se
1:54:25reprogramaron. El gen de la resistencia
1:54:27lo ponés,
1:54:30¿dónde lo ponés? ¿No lo ponés en
1:54:33en las células?
1:54:33En el plásmido,
1:54:35en otro plásmido, en las células. Las
1:54:38células se tienen que tener este este
1:54:40gen de selección para poder
1:54:41seleccionarlas.
1:54:43¿Cuál es el promotor
1:54:44de un gen que solo se va a expresar si
1:54:48las células se reprogramaron
1:54:49exitosamente?
1:54:50¿Okay? Entonces, para saber que las
1:54:52células efectivamente se reprogramaron,
1:54:54ponés el promotor y después para que
1:54:56solo te queden esas, le pones además el
1:54:58gen de la resistencia, así las otras se
1:55:00mueren y estas no. Y encima verde para
1:55:02veras.
1:55:05Y esa construcción,
1:55:07¿cómo?
1:55:07Perdón, esa construcción está en un
1:55:09plmido o la metimos adentro del genoma.
1:55:12Las metimos adentro del genoma. Entonces
1:55:13también tuvimos que seleccionar
1:55:15previamente las cuales les habíamos
1:55:17metido.
1:55:17Sí, especialmente al principio donde no
1:55:19se sabía cómo que la técnica iba a
1:55:21funcionar, ahora ya no hace falta. Pero
1:55:23para entenderlo es lo mejor es eso. Eh,
1:55:27el la adición de la proteína GFP
1:55:30es verdaderamente necesario porque si un
1:55:32no es necesario, me gusta verlo verde,
1:55:35pero no es necesario. No,
1:55:36pero si uno pone el gen de resistencia
1:55:39al antibiótico río abajo de por ejemplo
1:55:42al al de, por ejemplo, alguno de los
1:55:45genes maestros que supone que uno está
1:55:47arquivando, eso no quiero cambiar, no
1:55:50quiero tocar nada. Acá es un reportero
1:55:52externo, no modifico ningún gen de la
1:55:55cl. Digo, si uno, por ejemplo, a uno de
1:55:57estos genes maestros
1:56:01e
1:56:03bajo maestro, pero sí, perdón. Seguimos,
1:56:06chicos. Acá quiero aprovechar para que
1:56:10distingamos entre gen de selección,
1:56:14gen de selección que sería en este caso
1:56:18la resistencia al antibiótico G418.
1:56:21y reportero.
1:56:23El reportero es algo que me reporta algo
1:56:27que está pasando y que es de mi interés.
1:56:30Es un periodista que me reporta. En
1:56:33inglés reporter es periodista. Sí, los
1:56:37esto es un reporter gen. Okay. Es un gen
1:56:40que me está diciendo lo que está pasando
1:56:42en la célula. En este caso, yo quiero
1:56:44saber si se encendió el promotor de
1:56:47nanom. Aparte de poder matar a las
1:56:49células con el antibiótico, puedo ver
1:56:51que se aparecen células verdes. Sí, en
1:56:54este caso, el reportero que us es una
1:56:56proteína fluorescente, pero también se
1:56:58pueden utilizar
1:57:00otras cosas de reporte. Por ejemplo, la
1:57:03beta elastocidaza que ustedes usaron en
1:57:05el TP de inducción. ¿Ya hicieron todos
1:57:07el TP de inducción?
1:57:09Hoy
1:57:10nadie, solo el turno del lunes de la
1:57:12semana pasada, ¿correcto? Esta semana
1:57:15van a estar en los lap que se expresa la
1:57:17betagal. La betagal es lo que van a
1:57:19medir en este pecho. Eso se puede poner
1:57:21como gen de reportero también en las
1:57:24células y hay unas técnicas para teñir a
1:57:27las células que expresan la betagal. Sí.
1:57:30También en planta se utiliza otra otro
1:57:33gen bacteriano que se llama Gus,
1:57:36¿okay?
1:57:40que es la beta glucuronidasa que también
1:57:43se usa de reportero. Quiero decir la
1:57:46variad reporteros es muy grande [risas]
1:57:49muy común las proteínas fluorescentes de
1:57:51varios colores
1:57:53en que no es lo mismo que el gen de
1:57:55selección,
1:57:56¿okay? con el que mato a las que no lo
1:57:58tienen.
1:58:03Bueno, entonces ahora la pregunta es,
1:58:05¿cómo sabemos que efectivamente
1:58:08logramos reprogramar las células?
1:58:13Expresan una, pero me conformo con eso
1:58:18no me conformo con eso. ¿Cómo sé que
1:58:20está bien reprogramada la célula?
1:58:24que somos en esta bolita realmente son
1:58:26células pluripotentes.
1:58:30Si otras cosas van a ir a otros caminos
1:58:32si puedo hacer otra situación,
1:58:34puedo tratar de diferenciarlo a otras
1:58:36cosas con otras condiciones que le
1:58:38agregue de afuera y hacer que sean
1:58:40neuronas. Se puede agarrar las células
1:58:42pluricipotentes y diferenciarlas a
1:58:44neuronas o diferenciarlas a células de
1:58:46músculo. Eso se puede hacer, pero eso
1:58:50solo me dice que esas cosas sí las
1:58:52pueden hacer.
1:58:53¿Cómo sé que pueden hacer todo?
1:58:57Y deberían poder ser capaces de dar un
1:58:59organismo entero, ¿no?
1:59:00Deberían ser capaces de dar un organismo
1:59:02entero, ¿no?
1:59:04¿Qué piensan?
1:59:06Dice, pero
1:59:08entonces esa es la prueba.
1:59:11Sí.
1:59:13Lo que hago es microinyectarlas
1:59:17en un embrión temprano.
1:59:21Si estas células eran de ratón, por ahí
1:59:24me conviene que vengan de un ratón
1:59:25marrón, por ejemplo, y los microinyecto
1:59:29estas células en un embrión temprano, en
1:59:32el estadio de blastocisto
1:59:34de un ratón blanco.
1:59:39¿Qué va a pasar? se van a mezclar con
1:59:41las propias células del embrión en
1:59:43desarrollo y van a ocupar su lugar
1:59:47que les toque en suerte de acuerdo a la
1:59:50posición en la que quedaron enganchadas
1:59:52adentro del blastocisto.
1:59:55Eso va a permitir que se generen adultos
1:59:58quiméricos
2:00:00que van a tener pelaje marrón y pelaje
2:00:02blanco mezclado, porque algunas células
2:00:05van a venir de las del blastocisto que
2:00:08ratón blanco y algunas partes del cuerpo
2:00:11van a venir de las células del ratón
2:00:13marrón. Si estaban bien reprogramadas,
2:00:17va a haber
2:00:19células marrones en todas las partes del
2:00:21cuerpo mezcladas con los blancas,
2:00:23distintos parches y distintos ratones en
2:00:26las que haga esto, distintas partes del
2:00:28cuerpo.
2:00:33[tos][carraspeo]
2:00:34Eso me entendieron. Quimeras, alguno va
2:00:38a tener marrón la zona de la pelvis.
2:00:42Esos probablemente tengan sean células
2:00:45reprogramadas que hayan también estén en
2:00:47las gónadas,
2:00:50en los espermatozoides y en los óvulos.
2:00:53Entonces, ¿qué hago? Agarro algún
2:00:54ratoncito quimérico que tenga la zona de
2:00:57la pelvis marrón y lo cruzo con otra
2:00:59hembra blanca
2:01:04y ahí voy a tener
2:01:08qué? Un heteroigota. que va a ser
2:01:13hecho a partir de las pluripotentes.
2:01:15Sí, exacto. De las pluripotentes.
2:01:18Okay. O si los cruzo entre sí dos que
2:01:21tengan la pelvis marrón, va a dar un
2:01:23ratón marrón completo.
2:01:26Okay.
2:01:28Entonces así puedo generar ratones que
2:01:32sean
2:01:35reprogramados a partir de células de un
2:01:38individuo. Esos ratones, ¿qué son?
2:01:43clones son clones de las células estas
2:01:48del individuo de donde salieron estas
2:01:50células.
2:01:52Si yo agarro células
2:01:54de alguien
2:01:56y les hago esto, este procedimiento y
2:01:59los microinyecto en un embrión humano,
2:02:03va a salir
2:02:05una quimera del un individuo con otro
2:02:08individuo y después podría termino
2:02:10clonando, puedo clonar a un individuo
2:02:13también, puedo generar. ¿Está bien? Eso
2:02:15es lo que digo. ¿Se entiende tod?
2:02:17Es que yo tengo una, o sea, el el
2:02:20organismo primera, ¿qué tiene? Partes
2:02:22con células que vienen distintos ADN,
2:02:24orígenes.
2:02:25Claro.
2:02:26Y otros ADNs, ¿o no?
2:02:28Claro.
2:02:29Es como que tenga un brazo con células
2:02:30de otro ADN.
2:02:31Exactamente.
2:02:33Y eso
2:02:34eso
2:02:36es así. Ah, y pero entonces, ¿cómo
2:02:39pasamos de eso de un clones?
2:02:42Ese esas esos parches son clones de de
2:02:45las células de acá.
2:02:46Sí. Si están en las bónadas, voy a
2:02:48producir espermatozoides de este
2:02:51individuo
2:02:51y ahí sí va a ser todo un individuo de
2:02:53todas las mismas mismo ADN que viene de
2:02:56y ahí como están todas las células del
2:02:58cuerpo hechas, pues demuestro que la
2:03:00reprogramación fue completa.
2:03:05Si la reprogramación no hubiera
2:03:07solucionar, ¿qué obtendría? obtendría,
2:03:09por ejemplo, si las células esas no
2:03:12pueden diferenciarse a neuronas,
2:03:15obtendría que nada del sistema nervioso
2:03:18proviene de células marrones.
2:03:21¿Sí? O sea, ponerle que no pueden hacer
2:03:24ectodermo. Ustedes no sé si saben lo que
2:03:26es el ectodermo. Sí. una la capa del de
2:03:29del desarrollo que genera la piel y el
2:03:31sistema nervioso.
2:03:33Si no pudiera diferenciarse actodermo,
2:03:36entonces no habría nada de piel marrón.
2:03:44No hay un fenómeno de rechazo.
2:03:49Estoy comparando como por ejemplo cuando
2:03:50te trasplendan un
2:03:52No, acá se desarrolla depende si cómo se
2:03:55desarrolla el sistema inmune. Sí, yo
2:03:57creo que no. Correcto. Sin feundación no
2:04:00tenés un
2:04:03o porque si están las gonadas se tienen
2:04:04que fecundar con el otro ratón y tenés.
2:04:07Bueno, pu usar dos gónadas que sean las
2:04:09dos marrones.
2:04:14Bien. Okay. Entonces obviamente genera
2:04:18que podamos generar no necesariamente
2:04:21clones de individuos completos, sino de
2:04:23tejidos.
2:04:24Puedo ser un hígado nuevo, ¿sí? De
2:04:28alguien que le gusta tomar mucho alcohol
2:04:30y tuvo cirrosis.
2:04:32Okay. Así si le hacemos un hígado nuevo
2:04:35y sigue tomando alcohol y destruyes el
2:04:38nuevo hígado.
2:04:42E bueno,
2:04:44pero para tener el mismo ADN,
2:04:47perdón, es que no entiendo porque vos
2:04:49tenés vas a usar dos organismos que
2:04:51tienen el mismo ADN. Si los dos son,
2:04:53si son los dos clores. Claro.
2:04:55O sea, vas a tener un tercero que tiene
2:04:57dos copias de lo mismo, literal lo
2:04:59mismo.
2:05:00Sí.
2:05:02Okay.
2:05:04¿Y qué más? También
2:05:08el tipo de sangre, por ejemplo, lo
2:05:09determina un solo tipo de células. Las
2:05:12células hematopoyéticas
2:05:14vienen de un tejido,
2:05:17¿no? Ponele que esta parte de acá vaya a
2:05:20las células hematopoyéticas. Por ahí es
2:05:22una mezcla de dos células, una marrón y
2:05:24una blanca
2:05:26y combina.
2:05:28Claro, no que quede una parte de un tipo
2:05:30de sangre y otra parte de otro.
2:05:32Podría ser, podría ser que quede así.
2:05:34Dependiendo de cuántas células son las
2:05:36que se diferencian a células madres
2:05:38hematopoyéticas.
2:05:40Si viene de más de una célula.
2:05:42Exactamente.
2:05:42Claro. Tipo, sí, ¿verdad?
2:05:44Cuanto más temprano sea el embrión, más
2:05:47células van a ser colonizadas por esta
2:05:50por las nuevas que yo agregué. Estas
2:05:52quemas se pueden hacer con más cantidad
2:05:56o se podr meter 10 que puede ser más
2:05:58distintos. Sí,
2:06:00se podría. No sé bien para qué, pero sí,
2:06:02esto solamente se los mostraba porque
2:06:05sería la técnica para demostrar que la
2:06:07reprogramación que hicimos antes
2:06:09reprogramó completamente a las células.
2:06:11¿Podría no ser viable si el sistema
2:06:13inmune, por ejemplo, estuvo hecho por
2:06:15las células blancas y la sangre por las
2:06:18células marrones y entonces tiene un
2:06:19tipo de sangre que no reconoce?
2:06:21Escapa completamente esta materia.
2:06:24Okay. Bueno, em,
2:06:29y listo, terminamos. ¿Tienen preguntas?
2:06:32Temprano terminamos
2:06:36la próxima clase.
2:06:37Sí, está grabando.
2:06:38Perfecto. Bueno, ahora paramos. ¿Quieren
2:06:41saludar?
2:06:43Nosotras somos las pesadas.
2:06:45[risas]
2:06:46¿Ustedes no están?
2:06:489 años

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