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T16 IBMC 2026 2c Ingenieria Genetica 2 Alejandro Colman Lerner — Transcript

by Alejandro Colman-Lerner · 18,432 words · 3,204 segments · language en · Watch on YouTube

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0:00único que
0:01vamos a hacer un verde repaso de la
0:03clase del martes que no se dio acá se
0:06dio una bastante en el en la plaza de
0:09mayo, pero espero que hayan podido ver
0:11el video. Igual les hago un repaso ahora
0:15van a necesitar un poco de eso para lo
0:17que vienen en la clase de hoy y
0:18obviamente lo van a necesitar para los
0:20seminarios.
0:25Bueno, el otro día vimos que
0:31clonar,
0:33para clonar, que quiere decir poner un
0:35fragmento de ADN en otro lado. Sí, en
0:40este caso lo hacemos en un plásmido.
0:44Sí, necesitamos que ese plásmido después
0:46pueda replicarse en la bacteria donde lo
0:50vamos a transformar. Entonces tiene que
0:52tener un origen de replicación y para
0:55poder forzar a que solo crezcan aquellas
0:58bacterias que recibieron en el
0:59plástmido, es necesario poner un gen de
1:02resistencia en ese ADN circular. En este
1:05caso el gen de resistencia al
1:07antibiótico anficilina, pero podría ser
1:09otro.
1:12Los genes de resistencia pueden ser
1:13también reemplazados por genes que
1:15permitan la síntesis de algún aminoácido
1:17que la bacteria sea deficiente en sus
1:19propias síntomasis. Sí, no
1:22necesariamente tiene que ser
1:24antibiótico, aunque para las bacterias
1:26lo más común es usar antibiótico.
1:30Y el tercer elemento que tienen que
1:31tener los plásmidos es el MCS, el ciclo
1:36de clorado múltiple.
1:38La clase pasada vimos que
1:42existen unas enzimas
1:45que reconocen una secuencia, cada una,
1:48una secuencia específica que puede ser
1:50de cuatro bases, de cinco bases, de seis
1:52bases, de siete, de ocho, de distinta
1:54cantidad, ¿sí? Que es superespecífica y
1:58que ahí hacen un corte doble cadena. Acá
2:01tienen los nombres de varias enzimas. En
2:04la clase pasada vimos el ejemplo de Eco
2:06R1, que es una enzma de la restricción
2:09que produce naturalmente es periquia
2:12coli. Sí, que corta,
2:15como decía, doble cadena. Y acá tienen
2:19la presencia en este lugar de muchas
2:21otras de muchos otros sitios encima de
2:24restricción. Los plas nacen así, hay que
2:27hacerlos. Hay gente que se dedicó a
2:30poner sitios de restricción uno al lado
2:32del otro. ¿Para qué? Para permitir que
2:34yo pueda cortar mi inserto, mi ADN que
2:38quiero clonar y ligarlo específicamente
2:42en este lugar del plástico. ¿Alguna
2:45pregunta de esto?
2:49Toda la tiene o
2:54no es de amigación, es de ampicina. Ah,
2:57la conexionado
2:58R, resistencia anticillivid.
3:01El origen es el origen de replicación lo
3:03que permite que el pláido se replique en
3:05la bacteria.
3:06Claro. Y entonces esto es simplemente en
3:08este ejemplo,
3:10en este ejemplo, en otro plásmido va a
3:12tener resistencia a clorantelcol o
3:15tetracitlina
3:16o algún otro aminoácido eh antibiótico.
3:19Claro, pero
3:21la parte que nosotros estamos buscando
3:23clonar, digamos,
3:24no está. Claro, este es el plásmido.
3:26¿Dónde lo voy a clonar?
3:31Acá tenemos un ejemplo de clonado.
3:35Tenemos un ADN, por ejemplo, humano.
3:38Y tiene, resulta que tiene al azar las
3:42secuencias GAA TTC
3:45planqueadas por TAA GA TTC y en el medio
3:48tiene esta región roja.
3:50Si lo que quiero clonar es esto, corto
3:53con la enzima eco R1, que va a liberar,
3:56va a hacer un corte doble cadena y como
3:58explicamos la clase pasada, va a dejar
4:01extremos protentes para un lado y para
4:04el otro, porque no corta en forma
4:07simétrica, sino que corta de forma
4:09asimétrica.
4:12En este caso, esta encima deja extremos
4:14protruyentes de esta manera, que son
4:16cinco primas protruyentes, ¿no? Porque
4:18esto es una doble cadena, esta es la
4:20cadena va a dar CCO prima tres prima.
4:22Esto va 5 prima 3 prima. Y ven que de
4:24este lado cuelga una cola que empieza
4:26con el cinco prima, entonces es cinco
4:29prima protruyente.
4:31Esta colita se puede pegar por
4:34hibridación siguiendo las reglas de
4:36Watson y Creek con el plásmido, también
4:39cortado con la enzima Eco R1. Este
4:42plásmido lo corto con Eco R1 como está
4:44representado acá. ¿Y qué me va a
4:46liberar? me va a hacer que el plásmido
4:48aparezca en forma lineal y que le
4:50sobrenita a ATT y de este lado a ATT
4:53también. Esto es pegajoso con esto. Son
4:58extremos que son cohesivos y son
5:00compatibles
5:02al fragmento que quiero clonar. Tiene
5:04los mismos bordes que el pláus. Entonces
5:07lo junto en presencia de ligaza y ATP.
5:12se liga y se sella el plásmido con mi
5:16inserto clonado adentro.
5:20¿Entendieron?
5:22¿Alguna duda?
5:29Acá hay un videío que obviamente en la
5:31plaza no podía pasar. A ver si se
5:34escucha algo.
5:37Ah, no tengo el micrófono. Por ahí no se
5:38escucha nada.
5:59circular pieces of
6:03inside bacterial cells can be engineered
6:06to make such proteins as human insulin
6:08by inserting the
6:10that codes for that protein.
6:14Special enzymes called restriction
6:16enzymes which recognize, bind to, and
6:20cut specific DNA sequences are used to
6:23open up a plasm in preparation for the
6:26insertion of a gene. Some restriction
6:29enzymes leave the DNA with uneven ends,
6:32also known as sticky ends, shown here.
6:36the gene we wish to insert and the
6:38plasmid are both cut with the same
6:40enzyme. These sticky eds will be
6:43complementary, meaning they will readily
6:45bond with one another.
6:48In a follow-up reaction, gene fragments,
6:51cut plasmids, and an enzyme that
6:53connects DNA fragments are mixed
6:55together.
7:02This so-called light enzyme attaches the
7:06sticky ends in the solution to produce
7:08circular plasms that now carry the gene
7:12that codes for the desired protein.
7:28Se escuchó.
7:30Bueno, es un poco lo que estaba diciendo
7:32antes, ¿verdad? Bueno.
7:36Okay. También vimos la clase pasada
7:40cómo hacer una biblioteca
7:43genómica.
7:46Sí. ¿Qué era una biblioteca genómica?
7:50Era un conjunto de plásmidos que tienen
7:54clonados todos los fragmentos de un
7:57genoma particular. Por ejemplo, si está
8:00en una biblioteca genómica [tos] del
8:02genoma humano sacada, por ejemplo, de
8:05células linfocíticas de los glóbulos de
8:08la sangre, ¿sí? ¿Qué quiere decir? Si
8:10tengo una la genómica, tengo un tubo que
8:13tiene millones de plásmidos, cada uno
8:16tiene un pedazo del genoma humano.
8:20Entre todos los plásmidos tienen
8:22representado todo el genoma humano. Es
8:24una biblioteca del genoma humano.
8:28Eso lo puedo transformar en bacterias y
8:31voy a tener un montón de colonias, cada
8:33una de las cuales va a tener millones de
8:36bacterias. Cada colonia que todas tienen
8:39el mismo plástido.
8:41Cada cada colonia entonces tiene un
8:44pedazo del genoma humano.
8:48Si ven la clase de del martes, van a ver
8:51cómo se genera. Se corta con encima de
8:53restricción.
8:55En vez de hacer un corte total. En la
8:58clase pasada vimos que las encimas de
9:00restricción reconocen sitios, por
9:02ejemplo, de seis bases como eco R1 y eso
9:05está representado en promedio 4000 más o
9:08menos cada 4000 bases tengo la
9:10probabilidad de encontrar un sitio eco
9:12R1. Si fragmento el genoma humano de
9:153,000 millones de bases
9:17en pedazos de 4,000, voy a tener un
9:19montón de pedazos, mucho más de los que
9:21quiero. Entonces, lo que hago es una
9:22digestión parcial, no la dejo al enzima
9:26cortar todo el tiempo para que se
9:28generen fragmentos más grandes, que son
9:30esos fragmentos más grandes los que
9:32clono en el plásmido.
9:35Y voy a tener un montón de de plásmidos
9:37distintos con fragmentos del genoma
9:38humano.
9:42Este dibujo es para representar que en
9:45el genoma humano solo alguna de las
9:47partes va a tener los genes. Sí.
9:52Todas estas regiones en blanco serían
9:54las regiones intergénicas y dentro de
9:56cada gen aparte voy a tener muy poco de
9:59eso. Va a tener funciones codificantes
10:01para las proteínas porque mucho va a ser
10:02nitrones, ¿verdad?
10:09Una vez que tengo esas placas con las
10:12colonias de la biblioteca genómica,
10:14puedo hacer
10:17un ensayo para descubrir dónde está mi
10:21gen de interés. Mi gen de interés lo voy
10:24a ubicar porque voy a tener una sonda,
10:27¿sí? una sonda
10:31marcada radioactivamente es un pedazo de
10:33ADN que tiene algún parecido con lo que
10:36quiero encontrar. Puede ser que sea el
10:39gen de una especie que lo voy a y lo voy
10:41a buscar en otra especie o puede ser el
10:43propio gen, un pedazo del gen eh
10:47verdadero, ¿si? y quiero encontrar todo
10:49el clon, por ejemplo. Entonces, tengo un
10:51pedazo
10:53de ácido nucleico de ADN que tiene un
10:55pedacito de la insulina del de la región
10:58codificante de la insulina marcado
11:00radioactivamente y lo voy a tirar en mis
11:03500 placas.
11:05Cada una tiene un montón de colonias y
11:08cada colonia tiene un pedazo de genoma
11:09humano, alguna de los cuales tienen el
11:12pedazo del gen de la insulina. Entonces,
11:15la sonda radioactiva,
11:18perdón, esto es un pedazo de
11:21microcelulosa que lo obtuve de las
11:23colonias. Sí. Estas placas las guardé en
11:26la heladera,
11:28los pedazos de nitrocelulosa, los discos
11:30de nitrocelulosa, los misé, los
11:32desnaturalicé y les hecho la sonda
11:35radioactiva. La sonda radioactiva se va
11:37a hibridar de acuerdo a las condiciones
11:39de hibridación que yo decidí usar. ¿Se
11:42acuerdan que la clase pasada hablamos
11:44mucho sobre que si uso condiciones muy
11:47favorables para la hibridación, la sonda
11:49se va a pegar en montones de lugares?
11:52Eso es lo que llevamos lavado.
11:55Primero hago la hibridación y después
11:57empiezo a lavar. Si lavo en condiciones
11:59muy favorables para la hibridación, la
12:01sonda se va a quedar pegada. Si voy
12:04lavando en condiciones cada vez más
12:05difíciles, por ejemplo, subiendo la
12:07temperatura o disminuyendo la
12:09concentración de sales, voy a hacer que
12:11las cargas negativas de los fosfatos de
12:14la sonda se empiecen a repeler con las
12:16cargas negativas del ADN que está pegado
12:19acá, de los plásmos, de las colonias que
12:22estaban acá. Y a menos que sean s super
12:25específicos, se van a despegar. Sí. Y
12:28dependiendo de las condiciones de
12:30lavado, voy a obtener muy poquitas
12:32colonias que van a tener pegadas las
12:34ondas. Esas colonias son las que tienen
12:36el pedazo del genoma humano que a mí me
12:38interesa, porque son las que tienen las
12:40condiciones de humidación más
12:42restrictivas y donde logré que mi sonda
12:44se quede pegada. Sí, acá hay dos
12:47colonias que tienen el mismo pedazo o
12:50dos pedazos distintos del mismo gel,
12:54¿sí? que es el que me interesa porque es
12:55el que divida con la sonda. Eso está
12:58claro.
13:00No hay ninguna pregunta porque todos
13:02entienden
13:04o nadie entiende nada.
13:13Esto es un pedazo de película
13:16fotográfica,
13:17¿sí?, que se utilizó de verdad para
13:20encontrar estas manchitas.
13:24estas colonias radioactivas de las que
13:26se estaba hablando. ¿Cómo detecto las
13:28colonias radioactivas? Con una película
13:30fotográfica que detecte las emisiones
13:32radioactivas. Se van a poner negras en
13:34la película, la película fotográfica,
13:36que la parte que está apoyada al pedazo
13:39de nitrocelulosa que tiene la sonda
13:40radioactiva se va a poner negra.
13:44Esto es lo que veo acá.
13:47Acá hay una la imagen, digamos, obtenida
13:50de un disco de nitrocelulosa, de otro
13:52disco de nitrocelulosa, de otro disco de
13:54nitrocelulosa y de otro disco de
13:56nitrocelulosa. Están puestos los cuatro
13:58y arriba se le pone una placa
14:00fotográfica y se deja un tiempo en el
14:03cuarto oscuro, en una en una caja
14:07cerrada hermética para que no le entre
14:09nada de luz y se brele la película
14:12fotográfica, ¿correcto? Puede ser que
14:14haya que dejarlo una semana. Puede ser
14:16que haya que dejarlo más porque la
14:18cantidad de radioactividad que hay es
14:19muy poquito por
14:24eh se consigue un margen de error.
14:29¿Qué es un margen de error? Por ejemplo,
14:31si vos se supone que vos en el lavado lo
14:33que hacés
14:35buscas que la de una zona que quede
14:38quede cuidado sea el que tenga mayor
14:40compromidad con el
14:42puede pasar que hay un límite en el cual
14:44vamos poder producir más en unas
14:47condiciones de unación
14:49para que sí
14:51y quede justo un gen que es muy muy muy
14:55parecido, que también se tiende un
14:56montón, pero
14:57puede ser que encuentre clones manchas
15:00que correspondan exactamente al gen que
15:02estoy buscando o a un gen muy parecido.
15:06¿Por qué? Porque los genes a lo largo de
15:07la evolución se duplican.
15:10Sí, lo vimos con Alberto. Alberto
15:12explicós son shuffling, pero también en
15:14general los genes se duplican. Sí, los
15:17cromosomas se duplican. Nosotros tenemos
15:19por ahí cinco copias de un mismo gen que
15:22en la mosca grosófila es uno solo. Y en
15:26el desarrollo de los vertebrados se
15:29duplicaron o se duplicaron varias veces
15:32los genes. Entonces, los voy a encontrar
15:34a todos con mis ondas radioactivas.
15:36Dependiendo cuánto difieron a lo largo
15:38de la evolución,
15:40cuán fácil va a ser encontrar los
15:46acá tenemos una placa.
15:54¿Qué diferencia hay entre estas cuatro
15:56placas? ¿Les parece a ustedes?
15:59Número de colonias.
16:02Número de colonias.
16:04¿Y por qué hay más colonias acá que acá?
16:10por las condiciones de lavado.
16:12Exactamente.
16:15Esta es una hibridación menos rigurosa.
16:19Esta es una hibridación
16:21un poco más rigurosa. Un poco más
16:23rigurosa. Y esta es una condición ultra
16:25rigurosa. Tan rigurosa que, ¿qué?
16:29No quedó nada.
16:33Está bueno que no quede nada. Si en
16:36todas mis placas no hay nada, ¿qué pasó?
16:39Todo el trabajo que hice no descubrí
16:42nada. Sí, en esta hay demasiadas
16:45colonias, quiere decir que las
16:46condiciones de liquidación permitían que
16:48se uniera la sonda en cosas parecidas y
16:50no tan parecidas.
16:52¿Qué son los puntos afuera de las?
16:55¿Qué son los qué?
16:56Los puntos afuera de
16:57¿Qué puntos? de estas marcas, ¿no?
17:00Estos
17:02esos son marquitas que yo hago a
17:04propósito por ahí con una pintura flores
17:06fosforescente o algo que emita luz para
17:08poder alinear la placa radiográfica
17:12sobre las los discos de nitrocelulosa
17:16para saber dónde va. Si yo la levanto y
17:18no marqué nada, tengo las manchas esas y
17:20no sé dónde ubicarlas. Es para
17:23delinearlas.
17:29Okay, entonces esta sería una buena,
17:31perdón,
17:38esta sería por ahí una condición
17:41buena, es muy rigurosa, pero no tan
17:43rigurosa.
17:47Recordemos las condiciones que tengo que
17:50utilizar para controlar la rigurosidad.
17:53La temperatura, menor temperatura es
17:56menos riguroso,
17:59¿no? Porque al agitar menos la agitación
18:02térmica, sí favorezco que se queden
18:04pegadas dos las cosas. Soluciones
18:06concentradas en urea, formaldeído y
18:08formamida.
18:10Esas son todas moléculas que tratan de
18:13romper puentes de hidrógeno. Los puentes
18:16de hidrógeno es lo único que mantienen
18:17unida la sonda con el ADN en la
18:19microcelulosa. Si yo trato de destruir
18:22puentes de hidrógeno, entonces se va a
18:24despegar la sonda. Cuanto más ponga de
18:27urea, formaldeído o formamida,
18:31más difícil va a ser para la sonda
18:32unirse,
18:34más fuentes de hidrógeno va a requerir
18:36para que se quede agarrada.
18:41Concentraciones de sales, baja fuerza
18:43iónica,
18:45dificulta la interacción porque hace que
18:47los fosfatos se puedan repeler mejor.
18:50¿Correcto?
18:53Y
18:56el contenido de AT y GZ, eso es una
18:59propiedad de lo que quiero encontrar. Si
19:00justo lo que quiero encontrar está lleno
19:02de a y ts, va a ser menos puentes de
19:04hidrógeno que si está lleno de CS, ¿no?
19:09Entonces la la el la condición de
19:11hibridación también va a depender de mi
19:13sonda.
19:15Si justo estoy usando una sonda de 50
19:17bases en una zona rica en AT, por ahí
19:20tengo que hacer una usar una temperatura
19:22más baja que si la sonda está llena de
19:25Sí, más allá de que el resto del gen
19:27pueda tener lo que tenga, lo importante
19:29es la zona donde la sonda se va a pegar.
19:36Okay.
19:38Bueno, entonces voy a usar probablemente
19:41esta placa
19:43y voy a ir a la heladera.
19:46Sí, en la heladera había guardado la
19:48copia
19:50de el disco de nitrocirulosa con las
19:52bacterias vivas, porque esto está todo
19:55muerto. Acá no hay nada. Voy a la
19:58heladera de esta placa,
20:05pico la colonia,
20:08la crezco en medio de cultivo con
20:10antibiótico
20:12y hago una miniprep como la que hicieron
20:14ustedes en el TP,
20:16¿no? ¿Qué hicieron? Minip,
20:20preparación de DNA plasmídico hicieron.
20:23No sabían que eso usa miniprep.
20:26Mini prepí se llama
20:29porque es una preparación de cantidad
20:31pequeña de plát. Si quiero puedo hacer
20:33una maxi prep, tengo que crecer un
20:35cultivo mucho más grande, medio litro de
20:38bacterias
20:40para con 3 ml haces una minipre.
20:45Okay. La estrategia es la misma.
20:47[carraspeo]
20:49Y acá, ¿qué voy a tener? el plásmido que
20:52tiene el clon a donde se pegó la sonda,
20:56que probablemente sea lo que yo quiero,
20:58pero bueno, como lo estoy tratando de
20:59estudiar, lo puedo secuenciar y ver qué
21:02tiene. Al final de la clase de hoy vamos
21:05a ver cuál son cómo es la técnica de
21:07secuenciación de ADN.
21:12Okay, terminamos el repaso de la clase
21:14uno y empezamos en la clase dos.
21:20Okay.
21:22¿Ustedes ya vieron PCR, correcto?
21:25Bueno, entonces la PCR lo que hacíamos
21:27era una amplificación con primers de una
21:30región de ADN y justamente lo que voy a
21:33amplificar es la región entre un primer
21:35y el otro.
21:38Bueno, existe una técnica que utiliza la
21:41PCR como paso final, pero permite en vez
21:45de amplificar a partir de ADN,
21:48amplificar a partir de ARN.
21:52Entonces, en vez de usar molde de ADN,
21:54vamos a empezar con un molde de ARN, que
21:56lo podemos obtener, por ejemplo, de
22:01preparación de mensajeros,
22:04¿sí?, de algún tejido. Ahora vamos a
22:06ver.
22:08Entonces, tenemos el ARN. La PSR
22:11requiere ADN. Entonces, lo que tengo que
22:13hacer es convertir el ARN en ADN.
22:17¿Cómo hacemos eso? Utilizamos la enzima
22:20que ustedes ya conocen, ya conocen la
22:22transcript.
22:24Los retrovirus si inventaron la
22:27transcriptia reversa o por lo menos la
22:29usan.
22:31Entonces, alguna transpistas reversa de
22:33algún retrovirus se utiliza en esta
22:36reacción y se pone un primer.
22:39Sí, se pone un primer de ADN. Y ¿qué va
22:41a pasar? La transcript
22:45a hacer una cadena
22:48que va a ser igual al ARN, pero va a ser
22:52ADN. Como es una copia del ARN, ese ADN
22:56se llama ADN copia
22:59CDNA.
23:01Cada vez que escuchen o lean CDNA,
23:05quiere decir que eso fue copiado por
23:08transparasa reversa a partir de ARN.
23:13Como ustedes se imaginarán, esto tiene
23:15muchas consecuencias porque si estoy
23:18utilizando ARN mensajero, eso entonces
23:20no va a tener los intrones
23:23porque ya fue procesado. Entonces si yo
23:26hago el ADN copia de un gen humano, eso
23:30va a ser una copia del mensajero, no del
23:33ADN que le dio origen y entonces no va a
23:36tener todas las regiones que fueron
23:38eliminadas en el procesamiento del ARN.
23:43Entonces tengo el ADN copia y ahora
23:46necesito doble cadena de ADN para poder
23:49hacer la PCR. Pues
23:52cómo hago
23:54degradar el ARN. Para eso utilizo a una
23:56enzima específica que degrada ARN como
23:59la RNA H.
24:05La RNA H. Entonces me digiere la ARN.
24:08Entonces me queda una cadena simple de
24:11CDNA que se llama, sí, es el primer ADN
24:15y después la segunda cadena la puedo
24:17sintetizar ahora utilizando otro primer
24:21de ADN que pegue acá y sintetizo con una
24:25ADN polimerasa para este lado. Y lo que
24:28tengo acá al final es doble cadena a
24:31partir de simple cadena de la R.
24:39Esto se llama R transcript. Acá dice la
24:43RT. Esta parte está acá hice la
24:46retrotranscripción y al final acá agrego
24:49los primers, que pueden ser estos mismos
24:51o pueden ser otros. y a una persona
24:54común y corriente.
25:05¿Alguna duda?
25:09Vamos a verlo un poquito más después.
25:12Una pregunta. Entonces
25:15cuando uno hace primeración
25:21pas unos días una pausa entre haber
25:26hecho una copia
25:27parais
25:28por
25:29sí
25:30eh se guarda el DNA en simple cadena, el
25:33CDNA al principio, antes
25:36el DNA se puede guardar en simple cadena
25:38y es igual estable, ¿no?
25:39Sí, sí, no hay problema.
25:45Okay.
25:48A ver cómo entonces hacemos la
25:51preparación de CDNA de un determinado
25:55tejido.
25:58Supongamos que agarro,
26:01hago una preparación de ARN de cerebro.
26:06Sí. ¿Qué voy a obtener? Todos los RN
26:08mensajeros del cerebro.
26:13Okay. ¿Por qué hago un tapie de cerebro?
26:15¿Por qué no digo de piel
26:19o de hígado?
26:22Digamos, ¿por qué tengo que decir de
26:24dónde saco el AR?
26:25Solo va a tener lo que se expresa
26:27porque solo va a tener lo que se expresa
26:29en ese tejido.
26:31A diferencia del ADN, para preparar ADN
26:33es genónico, no me importa de dónde lo
26:35saco porque todas las células de cuerpo
26:38tienen el mismo ADN. Sí. Después vamos a
26:40ver alguna excepción a eso, pero en
26:42principio todas las células del cuerpo
26:44tienen todo el genoma.
26:47En cambio, los mensajeros dependen de
26:49dónde se expresan. Sí, en el cerebro se
26:52expresan mensajeros que no se expresan
26:53en el hígado, sino el cerebro sería
26:55hígado.
26:56¿Sí?
26:59Entonces, tengo el ARN purificado del
27:01cerebro y quiero hacer
27:05el CDNA de cerebro.
27:09¿Cómo hago?
27:10de cerebro. Le agrego un primer. ¿Qué
27:13primer le gusta a los todos los
27:16mensajeros por igual? Un primer que
27:19hbrida en la cola de poliado.
27:21Todos los mensajeros, por el hecho de
27:23ser mensajeros maduros, vienen polia.
27:26Entonces, si pongo un primer que sean
27:28todas T,
27:33va a pegarse acá. Y ahora voy a poner la
27:35transcript
27:37en una reacción de un rato voy a haber
27:39copiado todos los mensajeros de un
27:41tejido a CDNA, a la primera cadena CDNA,
27:46¿no? Una de las cadenas que va a ser una
27:48copia complementaria a los mensajeros.
27:53Y acá lo tengo degrado con RNAS H. Y
27:56ahora, ¿cómo hago para sintetizar la
27:58segunda cadena?
28:00Porque para el otro lado no tienen, no
28:03tengo de por
28:07cada mensajero es distinto.
28:10Una cadena, ¿cómo hago la otra cadena?
28:17Esta cadena,
28:19esta cadena de ADN que está roja acá,
28:23termina acá. ¿Y cómo hago para copiar
28:26para allá el? Bueno, eh, el cap no sirve
28:30de primer.
28:30Pues si no pod naturalizar, se aparece a
28:33cadena y dice molde
28:34de quién de para de sí misma.
28:38Yo tengo una cadena, simple cadena roja.
28:42Okay. ¿Cómo copio la cadena roja? Tengo
28:45que poner primas. Te puedes poner una
28:47cadena de y a dónde se va a hidar.
28:51Solo acá se va a hidar para allá.
28:54Yo necesito hacer poner un primer del
28:57lado cinco prima del mensajero.
29:00Necesitas copiar.
29:00Perdón. Lo que quiero saber es si aparte
29:03de ustedes están proponiendo ideas, el
29:05resto entendió cuál es la problemática.
29:09¿Dónde estoy un primer de la para la
29:11cadena roja que vaya para allá? Si cada
29:14mensajero tiene una secuencia diferente.
29:16Si haces unación parcial con Rafa
29:20de R que usar como
29:27por ahí se puede hacer eso.
29:30Nadie hace eso.
29:33Si yo hago una degradación del RNA
29:35parcial que no degradar el mensajero,
29:38que acá está ibridado el mensajero, si
29:40lo degrado en un poquito nada más. Ahí
29:43va a haber extremos sin tres primas
29:46donde la polimerasa podría copiar.
29:49Por ahí se puede hacer eso. Lo que se
29:50hace es agregar
29:53eh fragmentos [carraspeo]
29:55de eh ADN. Sí,
30:02sí que se agregan y a partir de ahí la
30:06que sean al azar y entonces la la ADNA
30:09polimerasa se va pedazos cortos de ADN.
30:12que pueda en distintos lugares y
30:15entonces con eso se hace la segunda
30:16cadena.
30:19No entiendo cuál es el problema
30:22de, o sea, entiendo que en la cola de
30:25polía.
30:26Claro, ponemos la cola de polía de este
30:28lado, va para allá y ahora tengo que ir
30:30para allá.
30:31¿Cómo voy para allá? Tengo prime.
30:33Claro, pero si vos lo conocés la
30:35secuencia
30:35de todos los mensajeros.
30:39Tengo miles de mensajeros de cerebro. No
30:42voy a hacer primers específicos uno para
30:44cada mensajero, aunque los conozca. En
30:46principio por ahí ni los conozco, ¿sí?
30:49Pero no voy a hacer un primer para cada
30:50uno. Necesito al azar. Entonces pongo
30:54fragmentitos chiquititos de ADN cortitos
30:56al azar. Sí. Y la segunda cadena la hace
30:59el ADN a polimerasa.
31:01Esos son random primers.
31:03Random primers.
31:07Sí.
31:09Entonces ahora voy a tener CDNAS
31:14que no van a ser perfectos porque
31:16depende donde puse los primers, donde
31:19finalmente hibridaron los primers, pero
31:21voy a tener una doble cadena de a partir
31:25de los mensajeros que van a tener
31:26representados
31:28en forma de doble cadena a todos los
31:30mensajeros de los repartidantes.
31:32Sí, todos los genes específicos del
31:34cerebro en este caso van a ver pasado
31:38sus mensajeros, o sea, los genes se
31:40expresaron, se hizo flicing, tenemos los
31:42mensajeros. Esos mensajeros ahora los
31:44hice CDNA y tengo ahora ADN doble
31:47cadena, que no tienen trones.
31:51Sí. Y esos les puedo ahora clonar en
31:55plásmidos. ¿Cómo hago para clonarlos en
31:58plásmidos?
31:59Necesito agregarles extremos.
32:02pegajos que peguen en el plástico para
32:06poder clonar.
32:08Okay.
32:10Este es el CDNA que tengo, que tiene la
32:12A, las as sí que tenía eran antes eran
32:16as y ahora son dexidas porque ahora pasó
32:18a ser ADN y tiene las ts en el B porque
32:21son los que puse de primer originalmente
32:23para las reversa.
32:26¿Qué eh otra cosa, ¿qué moles entonces
32:30las que se van a real en los
32:33polimerizars?
32:34Ah,
32:34y la DNA polimerasa después va a unir
32:36todo y va a quedar todo porque va a ser
32:38unir translation. Ah, y entonces por
32:41probabilidad que te todo el transitor,
32:46entonces ahora qué hago ahora le puedo
32:49agregar si hay unas enzimas que se
32:52llaman
32:54transferazas terminales,
32:56que si yo le doy a la transferasa
32:58terminal,
33:00hay distintas formas, se le pueden
33:02agregar de un lado CCC, del otro lado
33:05CCC y esto se puede ligar en un plásmido
33:09al cual le agregué gjejg o gjejg, ¿sí?
33:12Con una enzima que se llama
33:13transferencia terminal o de otras
33:15maneras también. Entonces, me la la
33:17transferencia terminal no necesita
33:19molde. Yo agrego ces dexis ces, agarra
33:23el ADN y le empieza a agregar c.
33:28Okay. Y si le agrego GS, va a agregar G.
33:31Entonces, si al plido le agregué s y al
33:34CMA le agregué CCS, ¿qué va a pasar
33:37cuando los juntos se van a hibridar?
33:39Pongo ligaza, se sella y finalmente
33:43tengo clonado mi CDNA en el plástumo.
33:50Se entiende
33:51Solo COP.
33:53¿Por qué uso COP? porque tienen más
33:55fuentes de hidrógeno y mejoran la
33:57interación, pero no es obligatorio
33:58usarlo. CCC.
34:01Lo que sí tengo que usar es algo
34:03complementario
34:05entre eh los RNAS y el pláidon.
34:09Okay. Al pláidon por ahí lo puedo cortar
34:11con una enzima que deje extremos
34:14protruyentes deje giramente.
34:16Y solo le agregas al
34:17Y solo le agrego al CNA CC. Eso seguro
34:21que puedo hacer también. Ahí encima se
34:23reconocen c c cc jejeje y lo cortan y
34:26dejan colgando
34:29las jejejes.
34:32Se entiende bien.
34:34Parto entonces de mensajero, hice DNA y
34:37ahora lo clono.
34:39¿Y cómo?
34:44Hay unas enzimas que vos pones tu ADN,
34:48la doble cadena y le pones de sustrato
34:51de oxi C y polimerizas, le agregas
34:55dependiendo cuánto tiempo le pones, cuán
34:56largo va a ser y eso lo convenga lo que
35:01te convenga tal cual.
35:03Okay. Entonces, lo importante es que
35:05pasamos de mensajero sacado de un tejido
35:10de ARN, pasamos a ADN doble cadena y
35:13después lo clonamos en plmidos.
35:16Entonces, estos tubos de plásmidos van a
35:18tener en el tubo representados todos los
35:22mensajeros que habían un determinado
35:24tejido. ¿Cómo se llama ese tubo?
35:27Entonces, es una biblioteca de CDNA de
35:31cerebro.
35:33Entonces, habíamos visto
35:35en la clase pasada y al principio de
35:37esta clase las bibliotecas genómicas que
35:40tienen fragmentos de ADN de un genoma
35:42que incluyen las secuencias entre genes,
35:45las secuencias de los genes, los
35:46sincrones, los exones, todo el genoma
35:49está representado. En cambio,
35:52estas bibliotecas, ¿qué tienen
35:54representado? Nada más.
35:57Soloones.
36:00Solo los exones. Y solo de qué, de un
36:02tejido particular.
36:05Es todo codificante.
36:06Es todo codificante.
36:09Exacto.
36:12Están las zonas cinco primas no
36:13traducidas, las zonas tres primas no
36:15traducidas. Sí,
36:18todo codificante
36:21y es específico del tejido donde lo
36:24saqué.
36:25Okay. Incluso tengo que especificar muy
36:28bien de dónde lo saqué. Por yo digo de
36:30cerebro. De cerebro de qué, pongamos que
36:32sea ratón. De cerebro de ratón, adulto
36:35o recién nacido o embrionario.
36:39No es lo mismo el cerebro de un bebé que
36:41el cerebro de un adulto. Sí. Tampoco es
36:44lo mismo un cerebro en distintas
36:46condiciones de alimentación, en
36:47distintas condiciones. Yo tengo que
36:49especificar muy bien de dónde saqué el
36:52RNA que usé para hacer el CDNA.
36:57Biblioteca de CDNA.
37:01El resultado es una biblioteca con miles
37:04de CDN distintos.
37:10Rando para
37:13se degrad
37:17no me importa más.
37:20No se clona ni nada, o sea, queda en el
37:22camino. ¿Puedo degradarlo si quiero
37:24específicamente o no?
37:28En el plástino nunca se une el ARN.
37:31A partir de acá ya no hay más ARN. El
37:34ARN quedó degradado por la RNAS H
37:37acá.
37:46Sí, pero se va a degradar, ¿no? No me
37:47importa más el RN. Cualquiera RN que
37:50quiera no va a ser clonado acá.
37:58Eh, yo para la cadena
38:03e
38:05de no me va a cambiar el original.
38:11Cambiar en qué sentido la secuencia.
38:13Claro,
38:13no porque solo se van a unir si son
38:17si tienen una liquidación perfecta.
38:23Okay, solo si la humiliación es
38:25perfecta.
38:31Okay. Entonces, tengo en mi tubo los
38:35plasmidos con la biblioteca
38:38de CDNA.
38:45M.
38:48Tengo mis plásmidos. Sí.
38:51los transformé. Voy a tener entonces
38:53ahora miles de colonias de bacterias.
38:57Cada una tiene un serenidad diferente.
39:02Sí, que proviene de un mensajero
39:04diferente.
39:09Las bibliotecas siempre hablamos de
39:11color.
39:11Las bibliotecas las puedo tener en el
39:13tubo de ensayo.
39:15Ah, o sea,
39:16los plásmidos ligados.
39:19Sí. sin las bacterias o puedo
39:21transformar las bacterias.
39:23Ah,
39:24y obtengo las colonias.
39:25Claro. Y ahí tendrías que hacerlo. Por
39:27ejemplo, de
39:30Exactamente. Es la misma técnica o
39:32alguna otra técnica que tenga más
39:33eficiencia. Claro.
39:35Sí. Para tener los bacterias. Ahora, si
39:37yo quiero comprar o algún investigador
39:41de Noruega me quiere mandar CDNA de
39:44experimento que hizo, me va a mandar un
39:46cubo con los plasmos, no me va a mandar
39:49las bacterias,
39:51yo las transformo. Yo
39:54se usa R
39:57para hacerse DNA.
39:59Para hacerse DNA me preguntan si solo se
40:01usa RNA mensajero.
40:04Sí. Y cuando quiero hacer CNA, lo en
40:06realidad lo que quiero hacer es una
40:07copia del ARN a se puede hacer de ADN
40:11ribosomal,
40:13de ADN de transferencia,
40:15de cualquier ARN. Lo que pasa es que no
40:17tiene mucha gracia porque ya los
40:19conozco. El ARN de transferencia son los
40:23transferos. El ARN ribosomal de una
40:25especie es uno solo, o sea, son todos
40:27iguales. El ARN 28s de cada uno de RN
40:30los ribosomalos. Sí, lo puedo hacer,
40:33pero lo interesante del ADN copia es que
40:36puedo hacer la copia de todos los
40:38mensajeros
40:40que son distintos y puedo preguntarme
40:42qué se expresa en esta célula distinto
40:44de esta célula. Bueno, extraigo el ARN y
40:47puedo hacer entonces el ADN copia y ahí
40:49va gastar todo lo que se estaba
40:50expresando en esa célula en ese
40:52determinado momento. Si hago CDNA de
40:55páncreas seguramente voy a encontrar
40:59CDNAS de el gen de la insulina. porque
41:01se expresa páncrecreas y no voy a
41:04encontrar si el expreso se ha ocenid de
41:06cerebro.
41:09Entonces podés entender la expresión
41:10diferencial de los genes que genes
41:12expresan en un lugar o qué genes
41:14expresan en otro. Por ejemplo,
41:19esa es una mano está apuntando algo,
41:22¿no?
41:26Eh, entonces se podríamos
41:29la vivo, sumaría
41:34como hoeping o se usa otras cosas
41:38como housekeeping. ¿Para qué? Para
41:39representar los genes que están en
41:41empresas constitutivamente.
41:42Sí. para ver si hay cantidad,
41:46para hacer los eso lo voy a hablar
41:48ahora. Alguno de los NMAs que aparecen
41:50acá, ¿sí? Van a ser los mismos
41:53independientemente del tejido.
41:56Esos son los genes que se expresan en
41:57todos los tejidos. Entonces, si yo
41:59preparé ARN mensajero y quiero saber de
42:02que preparé la misma cantidad de gen
42:04mensajero, lo puedo rematizar [tos]
42:06a los genes constitutivos. Por ejemplo,
42:09los mensajeros deina. Laina es necesaria
42:12en todos los tejidos.
42:13Sí. Entonces, si yo relativizo la
42:16cantidad que hay del gen de la del
42:19mensajero de la insulina relativo a
42:21laina, puedo decir hay 100 a un, por
42:24ejemplo. Sí. Entonces voy después al
42:27cerebro y en vez de encontrar 100 a un
42:29voy a encontrar cer a un porque no hay
42:32nada de mensajero de insulina en el
42:34cerebro o por ahí hay algún mensajero,
42:36pero nada que ver con la cantidad que
42:37hay en
42:40en el sentido propio donde se expresa.
42:43¿Okay? Siempre tengo que relativizar a
42:45un gen constitutivo, ¿sí? Entonces, y a
42:49eso iba a ir ahora de todas estas
42:51colonias que va a haber acá,
42:55hay una diferencia importante entre el
42:57ADN genómico de una biblioteca genómica
43:00y el ADN proveniente del CDNA.
43:03La cantidad de copias de CDNA de un
43:06determinado gen va a depender de cuánto
43:09se expresa.
43:11Los genes que se expresan mucho van a
43:13estar muy representados acá.
43:17Okay. Los genes abundantes, como los
43:20genes de las proteínas, los mensajeros
43:22de las proteínas ribosomales, por
43:24ejemplo, que se hacen un montón de
43:26ribosomas en las células, van a aparecer
43:28en gran cantidad respecto de algún gen
43:31particular, por ejemplo, el factor de
43:33transcripción MIOD que induce la
43:36diferenciación de las células
43:37musculares, no se expresa en gran
43:39cantidad relativo a los genes
43:42constitutivos como lo de los genes de
43:43los riosomes. Entonces va a estar
43:45representado en distinta proporción en
43:48mis colonias.
43:51Eso se entiende. La cantidad de colonias
43:53de cada CDNA diferente es la cantidad de
43:57expresión del gen que dio origen al CDNA
44:01clonado en el plásmido que tiene cada
44:03colonia.
44:05¿Me entiende?
44:08Eso se puedear
44:10en comillas y plástico
44:16que tenían son todos iguales. Pláidos
44:18estoy usando, estoy usando el mismo
44:20plándido para todos,
44:21¿no? Como había plástidante de alta,
44:23pero eso es en cada bacteria. Claro,
44:25estoy hablando entre colores. Ah, okay,
44:30eh esto es a disposición todas las
44:34secuencias que pueden dar en ese
44:37específico de Okay. Para usarlo.
44:40Exacto. ¿Para qué quiero hacer el CDNA?
44:44Okay. Para distintas cosas. Sí, quiero
44:48aislar un gen, quiero aislar el CDNA. Y
44:50ahora vamos a ver las propiedades que
44:52tienen las bibliotecas de CDNA.
44:54distintas de las bibliotecas genómicas
44:56para qué lasanas podemos usar.
45:00Entonces ahora si quiero una bacteria de
45:03acá
45:05agarrar con una sonda, por ejemplo, la
45:08sonda de insulina nuevamente, si el
45:10tejido era cerebro, no voy a encontrar
45:12ninguna colonia.
45:15Si el tejido era páncreas, voy a
45:16encontrar una colonia, por ejemplo,
45:18esta. Esa colonia, ¿qué va a tener
45:20ahora? El CDNA de insulina.
45:24¿no?
45:29¿Qué pasa si eh crezco ahora el cultivo
45:33de este de esta colonia y acá voy a
45:35tener un plásmido que tiene clonado el
45:38CDNA de insulina?
45:41Ahora, ese CDNA lo puedo utilizar si
45:44quiero, por ejemplo, expresar insulina
45:47en bacterias.
45:53¿Qué le voy a tener que poner? El
45:55promotor.
45:56Le voy a tener que poner un promotor
45:58procariótico al lado del sitio de
46:00clonado que utilicé para clonar el CDNA.
46:08Ahora lo vamos a ver un punto más.
46:13Bueno,
46:19ahora vamos entonces a recapitular y
46:21vamos a comparar bibliotecas genómicas o
46:24clones genómicos. Sí. Y clones de CDNA.
46:29Las bibliotecas genómicas tienen pedazos
46:33del genoma y cada uno es un clon de un
46:35pedazo del genoma.
46:38Las bibliotecas de CDNA tienen cada una
46:40un CDNA de un mensajero y cada una
46:43entonces es un clon del CDNA de ese gen.
46:50Están en plángidos que como vimos son
46:51elementos de ADN circular, se pueden
46:54encontrar en bacterias, ¿sí? Además del
46:56ADN cromosómico de la bacteria. Deición,
47:01¿sí?
47:01[resoplido]
47:01vectores de clonado son los plásmidos
47:04que obviamente tienen origen de
47:06replicación y al menos otros dos
47:08elementos característicos, un gen de
47:10resistencia y un sitio único de corte
47:12para una enzima de reflexión o polilín o
47:15sitio declonado múltiple MS. Es todo lo
47:18mismo, son es decir lo mismo. Sí. sitio
47:21declonado polylincan es un
47:26poli es un sitio de múltiples sitios
47:28enima restricción sí donde yo pongo lo
47:31que quiero se llama polylinter o mcs o
47:34sitio de clonado múltiple que son qué
47:37son plasmidos y después están los
47:40vectores de expresión que es lo último
47:41que habíamos mencionado recién son
47:44plásmidos similares a los vectores de
47:46clonado, pero que tienen en un elemento
47:48adicional tienen promotores
47:50procarioticos os eucarióticos,
47:53dependiendo donde yo quiera expresar mi
47:57gen clonado,
47:59sí
48:01están contiguos al lado del sitio
48:03declonado, ¿sí? Y aparte tienen un sitio
48:06de replicación para células eucariotas,
48:08si es que quiero expresarlo en células
48:10eucariotas.
48:13¿Okay? Entonces, el vector de expresión
48:16es un vector que tengo que definir de
48:19expresión en dónde. Vector de expresión
48:21en bacterias, vector de expresión en
48:23levaduras, vector de expresión en
48:27ratones. Va a tener que tener diferente,
48:30¿qué? Diferente promotor
48:34y por ahí diferente origen de
48:35replicación.
48:37Vuelvo se hace, o sea, si yo quisiese
48:41expresarme los Ah, no lo puedo expresar,
48:45lo puedo expresar donde quiera. Puedo
48:46expresarlo en bacterias, puedo
48:47expresarlo en células animales, tengo
48:49que saber lo que estoy haciendo y
48:50ponerle los elementos regulatorios
48:52ustedes ya fueron aprendiendo,
48:54apropiados para la célula donde quiero
48:56expresar.
49:02Acá tienen un dibujo de los vectores de
49:04expresión. Acá tienen un vector de
49:06expresión procariótico. Procariótico
49:10dice acá. Y acá tienen un vector de
49:11expresión eucariótico. El procariótico
49:14tiene sitio declonado
49:17que recuerden pueden ser muchos sitios,
49:19muchas son diferentes.
49:23Un promotor procariótico, el gen de
49:25resistencia y el origen de replicación.
49:27Con esto ya me alcanza. El promotor
49:30procariótico puede ser constitutivo o
49:32inducible.
49:33Ustedes ya saben, hicieron el TP de
49:36inducción, ya
49:38lo van a hacer a los del lunes. Sí, lo
49:40hicieron.
49:42Van a ver que van ahí van el TP van a
49:45inducir el Operón L. Entonces ahí es es
49:49un promotor inducible con glucosa está
49:51reprimido y con lactosa o intentesge.
49:54¿Sí? Entonces, si acá puse el promotor
49:57L, lo que esté acá se va a expresar si
49:59lo estoy induciendo. Si puse un promotor
50:01constitutivo, se va a expresar todo el
50:03tiempo.
50:07Acá dice, acá va una n, ¿no?
50:11Bueno, el vector de expresión
50:12eucariótico
50:14es diferente porque tiene, en vez de
50:16tener promotor procariótico, tiene
50:18promotor eucariótico.
50:21¿Y qué va a tener? El sitio declonado y
50:23atrás, ¿qué le voy a poner? el sitio de
50:25corte y polia deción,
50:28¿okay? Para que se corte el mensajero
50:31donde tiene que costarse, porque el CDNA
50:33que voy a clonar no viene con el sitio
50:35de corte completo.
50:38Sí, por ahí sí, por ahí no. No fijarme
50:40cómo me quedó porque depende dónde se
50:42pegó, bien cómo quedó finalmente
50:44clonado, si el sitio de corte y la
50:46alineación quedó elado o no.
50:49Y este también puede ser
50:52el promotor eucariótico va a tener las
50:55mismas características que las que yo
50:58quiera. Si quiero que sea conitivo, por
51:00ejemplo, puedo ponerle el promotor de
51:02actina,
51:04¿sí? O un promotor fuerte de un virus.
51:07Me gusta mucho el promotor de el
51:09citomegalobitis
51:10CMB
51:12uno.
51:14Okay, eso va a hacer que se exprese
51:16mucho en las células donde yo lo meta.
51:19¿Se acuerdan cómo se llama? Lo vimos la
51:20clase pasada. Cuando meto un plasmido en
51:23una célula animal, se dice que lo voy a
51:25transpectar en vez de transformar.
51:28Entonces, si yo transpecto este vector
51:30de expresión en una célula animal,
51:32dependiendo del promotor que ponga acá,
51:34se va a expresar o no.
51:38Si pongo un promotor constitutivo, se va
51:39a expresar en cualquier célula que lo
51:41transfecte.
51:43Ahora, si pongo un promotor específico
51:45de cerebro y lo transcté en células de
51:48mama, ¿se va a expresar?
51:51¿No se va a expresar?
51:53Okay, supongamos que yo quiero expresar
51:56acá un gen que viene del CDNA de la
52:00insulina de vuelta y ahora lo quiero
52:03expresar en la leche de la vaca.
52:08¿Qué promotor tengo que poner acá?
52:13El promotor de la insulina.
52:14No,
52:15no
52:16t que ver con el
52:19¿Qué quiere decir el promotor que tenga
52:20que ver con la leche de la vaca?
52:23Promotor la leche de la vaca.
52:25¿Cómo?
52:25Un promotor que siempre se exprese
52:27dentro de la vaca.
52:29Dentro de la vaca.
52:32En la en el músculo de la vaca, en la
52:34colita de cuadril. ¿En
52:37dónde se tiene que expresar?
52:41En el tejido mamario, en las células se
52:44producen las proteínas de la leche. ¿Sí?
52:48Entonces tengo que poner acá un promotor
52:50de células de el epitelio mamario.
52:56Y eso de poner el promotor de dónde, o
53:00sea, vas a hacer de dónde son tus
53:01células es porque el inidor o elor se
53:06produce solo en desarrollidor.
53:11¿Por qué? ¿Cómo funcionan los
53:12promotores?
53:14¿Qué necesito para que un promotor se
53:15exprese?
53:18Para que funcione el promotor, necesito
53:20primero que se arme el complejo basal de
53:23transcripción. Para eso necesito la
53:25datab, por ejemplo,
53:27¿okay? Que se peguen ahí los factores
53:29TP2D y todos esos para que la polimeras
53:32se pueda pegar. ¿Y qué más necesito?
53:38¿Qué necesito poner en el promotor?
53:42El enhancer. Tengo que poner el sitio de
53:44unión de los factores de transcripción
53:47específicos del tejido donde yo quiero
53:49que se ofrece.
53:51Por eso digo, pongamos acá un promotor
53:54que funcione en el tejido mamario. Si lo
53:57que quiero es expresar lo que quiera
53:59creonar acá, por ejemplo, la insulina en
54:02la leche,
54:06porque ahí es donde van a estar los
54:08factores de transcripción que van a
54:09reconocer los enhancers que tiene este
54:12promotor.
54:13Y así nos expresa en otro lado la
54:16insulina o lo que yo quiera expresar.
54:19¿Okay? Mañana Marcelo les va a contar
54:22técnicas que se utilizan para meter
54:26plásmidos como estos en animales para
54:29poder hacer lo que les acabo de decir.
54:31Por ejemplo, expresar insulina
54:34en tejido mamalico.
54:36Okay.
54:40Los factores de transición que seja de
54:43Sí.
54:44que vas a usar el promotor
54:48porque reconocer a la promotor, no
54:50pueden olvidarse de esto, es como de lo
54:52más importante. Los promotores
54:55son tejidos específicos o constitutivos.
54:59Si son constitutivos, se van a expresar
55:01en todo el objetivo. Si a vos no te
55:03molesta,
55:05si a vos no te molesta que la insulina
55:08se exprodidos, probablemente sí te
55:10importe en el caso de insulina. Pero si
55:12no te importa, por ejemplo, estás
55:14expresando la proteína fluorescente
55:15verde y querés que todo el animal sea
55:17fluorescente verde, entonces pones un
55:20promotor constitutivo.
55:23Si vos querés que se ponga verde
55:24solamente la piel, pones un promotor
55:28específico de células de la
55:31pregunta,
55:33si el promotor constructivo es, o sea,
55:35va a funcionar en todo lado del cuerpo
55:37porque todo el cuerpo va a tener la
55:39parte de transir para poder para poder
55:42transir
55:43pregunta la clase. ¿Por qué un promotor
55:46constitutivo se expresan todos los
55:48tejidos?
55:54Constitutivo quiere decir que se
55:56expresan todos los tejidos, pero esa no
55:58es la explicación de por qué se expresan
56:00todos los sonarios en todos los
56:02sentidos.
56:04Eso es por qué la evolución hizo que se
56:06expres en todos los sentidos. Yo quiero
56:08que me digas cuál es el mecanismo
56:09molecular que permite que se exprese en
56:12células de hígado y en células de piel y
56:14en células de cerebro.
56:19La respuesta es, tiene que haber
56:21factores de transcripción que se unan a
56:24ese promotor en todos los tejidos.
56:28Y eso puede ser por dos razones.
56:30O bien el factor de transcripción es
56:33constitutivo,
56:35entonces se expresan todos los tejidos y
56:37todos los promotores que tengan ese
56:38sitio lo van a poder unir y se va a
56:40expresar en cualquier lado. O
56:44el promotor tiene suficientes sitios de
56:46unión. para suficientes factores de
56:48transcripción para que en cada tejido
56:51alguno haya,
56:55¿no?
57:00encer en cáncer sitios de binding,
57:03sitios de unión para factores de
57:05transcripción y puede ser las dos cosas
57:07también algunos promotores constitutivos
57:09pueden ser por una razón, otros
57:12promotores constitutivos por la otra
57:13razón.
57:16Operativamente se expresan en todos los
57:18sentidos, pero la razón sí es que
57:21existen factores de prescripción para
57:22que se unan ahí.
57:28No puedo, por ejemplo, hacer
57:32a cuanto
57:36armarme una secuencia
57:38fuera de fuera de fuera de tiempo.
57:41Okay. No podemos charlar sobre una
57:43pregunta particular acá con los alumnos
57:45de la primera fio.
57:48Después las charlamos.
57:50Bien. ¿Está claro, muchachos muchachas?
57:58Okay.
58:01Acá arriba dice clon genómico y acá dice
58:04clon de CDNA.
58:06Y vamos a ver distintas características
58:09que tienen que saber, tienen que saber,
58:11pero inmediatamente.
58:14No lo tienen que aprender de memoria,
58:15pero lo tienen que aprender sí o sí.
58:21Clon genómico. ¿Qué tiene acá? Inserto
58:26un pedazo del genoma, por ejemplo, de un
58:28gen.
58:30Si fuera un gen, ¿qué va a tener? Exones
58:33intrones.
58:38En cambio, el inserto de CDNA
58:41solo tiene exones, no tiene ni
58:43secuencias regulatorias. Los promotores
58:45están en la biblioteca de CNA.
58:49Los promotores
58:51sí pueden [resoplido]
58:52pueden o no
58:55pueden.
58:58No se transcriben los promotores.
58:59Los promotores no se transcriben.
59:01Lo único que está en el CDNA es lo que
59:03se transcribe,
59:05¿okay? Y que tenga polidad.
59:11Eso es otro tema. Acá dice clon de CDNA
59:16y acá dice clon genómico. No dice si hay
59:19un promotor acá o no.
59:22Acá son los secuencias que fueron
59:25transcritas en el tejido donde lo saqué
59:28el mensajero
59:30sin intrones.
59:33Entonces si tengo que elegir uno para
59:34expresar en bacterias, ¿cuál voy a usar?
59:41¿Por qué? Porque si no estamos
59:43utilizando un material que está plagado
59:45de introdones y las materias no tienen
59:49que no
59:50entienden si tiene crones la bacteria no
59:53lo va a poder procesar.
59:55Okay.
59:57Bien.
59:59Este tiene promotor
1:00:03propio. El clon. El clon es lo que metí
1:00:07acá. El clon tiene promotor,
1:00:11puede tener, va a haber clones que van a
1:00:14ser el promotor,
1:00:17¿okay? Que por ahí no tiene pena al
1:00:19lado, pero el promotor puede estar.
1:00:23Podría haber un inserto que tenga el
1:00:24promotor y un gen chiquito.
1:00:28Los de CNA tienen promotor,
1:00:31no tienen promotor.
1:00:35Se obtiene de un banco de genes de
1:00:37cualquier tejido.
1:00:40Ya dijimos, el genoma está en todas las
1:00:43células. Entonces, no importa de qué
1:00:45célula hice mi banco o biblioteca de
1:00:48genes, va a estar lo que quiero. En
1:00:51cambio, el clon de CDNA hay que
1:00:54obtenerlo de un CNA, de un tejido
1:00:56correspond que uno quiera que sepa, que
1:00:59se exprese el clon que uno quiere tener.
1:01:02Sí, si uno quiere que se expres
1:01:06eh
1:01:08genes específicos del cerebro, tengo que
1:01:11usar un CDNA obtenido del cerebro.
1:01:17No puede expresarse en bacterias porque
1:01:19no hacen splicing.
1:01:22Okay.
1:01:24Sí puede expresarse en bacterias si se
1:01:26clonó arriba abajo de un promotor
1:01:28bacteriano.
1:01:31Acá hay una cosa importante. Se clonó.
1:01:35Antes habíamos dicho al lado de un
1:01:36promotor, que lo podría poner acá, pero
1:01:38la palabra más importante acá es río
1:01:41abajo,
1:01:43¿okay? Porque el promotor lo podría
1:01:44haber puesto acá, pero el CDNA tiene que
1:01:47estar orientado correctamente,
1:01:50tiene que estar río abajo, ¿sí? En el y
1:01:53quedar adecuadamente puesto,
1:01:56pero no podría haberseado
1:01:59deota.
1:02:07O sea, no entiendo por qué solo si es un
1:02:09productor bacteriano porque el productor
1:02:12no se transcribe, entonces no importa si
1:02:15yo le agrego, le tengo que agregar,
1:02:18se puede expresar en bacterias y digo,
1:02:21¿cómo hago para que se expresen
1:02:22bacterias? Le tengo que yo agregar
1:02:24afuera un promotor bacteriano.
1:02:26Claro, independientemente de si el
1:02:28transcricto viene de cariota por
1:02:30carioto.
1:02:31Sin duda.
1:02:33Ah, entonces no entiendo por qué dice si
1:02:35yo no abajo un bacterial,
1:02:37porque acá tengo que poner un promotor
1:02:38bacterial.
1:02:41Ah,
1:02:42no importa de dónde viene el CNA, puede
1:02:44venir de otra bacteria, pero si no le
1:02:45pongo un promotor bacteriano en
1:02:47bacterias no se va a pensar.
1:02:52Eh, el tamaño de estas bibliotecas va a
1:02:54ser diferente.
1:02:57Mucho más grande a pesar de que puede
1:02:59haber en
1:03:00Me preguntan acá el tamaño de la
1:03:03biblioteca genómica versus la CDNA va a
1:03:06ser muy diferente. Es decir, las
1:03:08bibliotecas genómicas son mucho más
1:03:10grandes. ¿Qué quiere decir grande? O
1:03:13sea, que tenemos más fragmentos
1:03:16diferentes para completar.
1:03:18La diversidad de fragmentos del genoma
1:03:21va a determinar el tamaño del genom.
1:03:23Claro. Pero somos la misma especie y un
1:03:25solo tejido.
1:03:27Para la misma especie
1:03:30es dudoso a veces porque depende de la
1:03:31diversidad. Si consideras las variantes
1:03:34de flying,
1:03:34claro.
1:03:35Puede ser que haya mucha diversidad en
1:03:37el saquero también.
1:03:38Entonces podría ser que tengan en un
1:03:40solo tejido más cantidad de fragmentos
1:03:42diversos que en todo el concreto de la
1:03:45existencia.
1:03:45Habría que hacer la cuenta,
1:03:48por ahí puede ser. Okay.
1:03:50Okay. Eso lo habíamos hablado de cada
1:03:54gen [carraspeo] de cada gen que se
1:03:57exprese puede haber múltiples
1:03:58mensajeros,
1:04:00¿no? Poring alternativo.
1:04:05Entonces de un mismo gen puede ser que
1:04:07tenga distintos CDNAs.
1:04:11Algunos van a contener unón, otros no lo
1:04:13van a contener. Puede haber sitios de
1:04:15polización alternativa. Todas las
1:04:17variantes que generen diversidad de
1:04:19mensajeros van a generar diversidades
1:04:22DNAs,
1:04:24¿okay? Y puede ser que un gen tenga un
1:04:26patrón de splicing en un tejido y un
1:04:28patrón diferente de splicing en otro
1:04:30tejido. Entonces, voy a tener ese DNA
1:04:32del mismo gesto de distintos tejidos que
1:04:35van a ser distintos por van a cambiar en
1:04:38alguna parte.
1:04:40Sí, el exón cuatro por ahí se expresan
1:04:42cerebro y el exón tres por ahí se
1:04:43expresan hígado.
1:04:53Acá cada inserto en el clon genómico
1:04:57puede en teoría tener más de un gen
1:04:59porque es un pedazo de ADN cualquiera.
1:05:02Por ahí agarró dos genes.
1:05:05Sí. En cambio, en el CDNA siempre es de
1:05:08un gen, porque viene de un mensajero.
1:05:14¿Está claro?
1:05:27Esto para recordar lo que ya hablamos
1:05:29varias veces, el genoma
1:05:32en un genoma eucariota multicelular como
1:05:34el humano, las regiones de genes están
1:05:37muy desparramadas, separadas por
1:05:40regiones blancas que son intergénicas.
1:05:43Si abro acá uno de esos genes, voy a
1:05:45encontrar las regiones regulatorias del
1:05:47promotor y después los exones en
1:05:51azulcito y en amarillo
1:05:54los cintrones para recordar que el
1:05:56mensajero del cual vamos a hacer el CDNA
1:05:59es una muy pequeña porción de el gen.
1:06:03Okay.
1:06:06Entonces,
1:06:09¿se acuerdan lo de las ondas que vimos
1:06:11antes?
1:06:13Si yo uso sonda de mensajero
1:06:17radioactivo
1:06:19contra una biblioteca genómica
1:06:23de este gen que puede estar fragmentado,
1:06:26esto pueden ser 300,000 pares de bases,
1:06:29por ejemplo, por decir algo. Entonces,
1:06:31si yo los cloné los fragmentos en
1:06:34fragmentos de 30 a 40 k bases, ¿sí? Va a
1:06:38haber muchos fragmentos que van a tener
1:06:40esta parte de la región codificante.
1:06:43En las colonias va a haber muchas
1:06:44colonias con distintos plásmidos que van
1:06:47a tener alguna este pedazo, otra este
1:06:49pedazo, alguna un pedazo solapado de por
1:06:51acá, otra el pedazo de por acá. Si mi
1:06:53sonda era todo el mensajero radioactivo,
1:06:56¿qué voy a ver? Muchas colonias. Todas
1:07:00las colonias van a tener van a tener lo
1:07:01mismo, ¿no? Cada una va a ser distinta,
1:07:05pero todas van a machear alguna parte
1:07:07del mensajero.
1:07:09El fragmento de acá va a pegarse con la
1:07:12parte de acá de la sonda, el fragmento
1:07:14de acá con la parte más prima de la
1:07:16sonda. ¿Okay? Entonces, con una sonda de
1:07:18mensajero puedo encontrar los clones en
1:07:23todo el género.
1:07:25Ahora, al revés, si yo usara de sonda un
1:07:28pedazo de intron
1:07:30y estoy buscando en una biblioteca de
1:07:32CNA, ¿qué va a pasar?
1:07:35No voy a encontrar nada,
1:07:38aunque sea el mismo gente.
1:07:46Esto ya lo vimos. Todo esto ya lo vimos
1:07:54bien.
1:07:55Acá está el resumen de las
1:07:57características del clon genómico y el
1:07:59clon de CDNA. Voy a avanzar. ¿Queda
1:08:02alguna duda de estas características que
1:08:04tienen que saber?
1:08:06Sí, ahí dice que el el clon genómico se
1:08:10puede expresar deas tanto con su propio
1:08:12productor, si productor
1:08:17el clon genómico puede expresarse en
1:08:19células eucariotas tanto con su propio
1:08:22promotor como si se lo cambia por otro
1:08:24deolen eucariótico.
1:08:26Sin embargo, dependiendo de qué promotor
1:08:29tenga, en qué ser las eucariotas se va a
1:08:31expresar,
1:08:33¿no?
1:08:35No solo por el tejido, sino por
1:08:37especies. Si yo quiero que se ofrecen en
1:08:39levadura, le tengo que poner un promotor
1:08:41de levadura. Si uso un promotor de
1:08:43células de fibroblazo, de células de
1:08:46tejido humano, no va a andar en la
1:08:48levadura. Por más que sean ecariotas. Si
1:08:51quiero que se expresen plantas, mejor
1:08:53que le ponga un promotor de plantas.
1:08:56Y si quiero que se ofrece la hoja de la
1:08:58planta, mejor que le ponga un promotor
1:08:59de hoja de planta y no de raíz.
1:09:04para guardar porque sea multipción.
1:09:06¿Podría ponerme los dos promotores y en
1:09:08base a lo que
1:09:10se exprese, puedo poner los dos
1:09:12promotores,
1:09:18pongamos que tenemos el CDNA este. Acá
1:09:21le puedo poner un promotor bacteriano o
1:09:24le puedo proponer un promotor
1:09:25eucariótico, pero puedo poner los dos.
1:09:29ocupado
1:09:30está ocupado en lugar por ahí alguien
1:09:33puede ingeniar para que un promotor
1:09:35procariótico no moleste el promotor
1:09:37eucariótico y a la vez superponer en las
1:09:39secuencias. Pero no tengo idea si lo vas
1:09:42a poder lograr. En principio, como
1:09:44ocupan lugar los promotores, no sería
1:09:47prudente hacerlo, pero yo creo que se
1:09:49puede hacer la ingeniería para que lo
1:09:52para lograrlo. No sé, me imaginé que
1:09:56arriba abajo, algo real, no ya tener que
1:09:59mutar al resultado final va a ser que no
1:10:01va a ser el mismo promotor eucariótico
1:10:03ni procariótico original, voy a tener
1:10:05que hacer una modificación.
1:10:07Se puede poner el bacteriano dentro de
1:10:09un intron.
1:10:11Puedo poner el bacteriano en un intron.
1:10:12Entonces va a transcribir de acá para
1:10:13allá. Me voy a perder el primerón.
1:10:16No puedo poner un intron en el primer
1:10:18eh.
1:10:22Aparte si tiene intresia no lo va a
1:10:24poder usar.
1:10:26Ah,
1:10:26solo me tiene sentido hacerlo con el
1:10:28CNA.
1:10:32Entonces, ¿alguna pregunta sobre las
1:10:33características estas?
1:10:36Sí. entender por qué tenemos una sonda
1:10:39genómica en CDNA no se va a ver nada
1:10:42más.
1:10:43Yo no dije que si usamos una sondas
1:10:45genómica contra el CDNA no se va a ver
1:10:48nada. Lo que dije es que si la sdas
1:10:50genómica viene de un intron, no se va a
1:10:53ver nada en el clon de CNA porque el
1:10:56CDNA no tiene intr. Ahora, la sonda
1:11:00genónica puede tener exones también. En
1:11:02ese caso sí se va a ver.
1:11:08Recuerden cómo hicimos esto, ¿no? El CNA
1:11:11con la RT. La RT, no PCR, la RT
1:11:14solamente. Sí.
1:11:20Bueno, esto ya lo saben.
1:11:27Ahora vamos a ver una técnica
1:11:29relacionada que les va a resultar muy
1:11:31fácil dado todo lo que ustedes ya saben.
1:11:34Se llama Sa
1:11:40y porque inventó un señor que se llamaba
1:11:42Faula.
1:11:45Fíjense lo que hace la técnica.
1:11:48que ustedes ya saben todo lo necesario
1:11:50acá para entender. Agarramos
1:11:53genoma que nos interese o cualquier
1:11:56pedazo de ADN, lo corto con encima de
1:11:59restricción hasta que se corte todo.
1:12:03¿Okay? No quiero disestión parcial,
1:12:04quiero disestión total. Y se van a
1:12:07generar fragmentos de distinto tamaño.
1:12:09¿Por qué se van a generar fragmentos de
1:12:11distinto tamaño si una enzima como eco
1:12:13R1 reconoce un sitio cada 4,096 pares de
1:12:16bases?
1:12:19promedio
1:12:21porque es promedio. 4096
1:12:23es la probabilidad de encontrar, no
1:12:26quiere decir que sea seguro. Entonces,
1:12:28los sitios de corte van a estar
1:12:29dispersos al azar. Se van a generar
1:12:31fragmentos de distinto tamaño,
1:12:34fragmentos de distinto tamaño que
1:12:37entonces los puedo separar en un gel de
1:12:40agarosa como el que hicieron ustedes en
1:12:42el laboratorio.
1:12:44Siembro del lado negativo y el ADN,
1:12:47¿hacia dónde va? Hacia el lado positivo.
1:12:50¿Cuál va a ir más rápido?
1:12:53El más pequeño. ¿Cuál va a ir más lento?
1:12:56El más largo.
1:12:58Sí. Entonces tengo acá mi
1:13:02gelo
1:13:04encima
1:13:06un filtro de nitrocelulosa
1:13:11y eso sube por capilaridad el agua. Si
1:13:15pongo muchas servilletas encima de esto,
1:13:17el agua va a arriba y va a arrastrar el
1:13:20ADN
1:13:22consigo que va a quedar pegado en la
1:13:24nitrocelulosa, así como se había quedado
1:13:26pegado antes en cuando hicimos el
1:13:30análisis de los discos de nitrocelulosa
1:13:32de las arterias. Va a quedar todo el ADN
1:13:34pegado, pero donde estaba. El que corrió
1:13:37mucho va a quedar de este lado, el que
1:13:39corrió poco va a quedar de este lado.
1:13:41Esto está representado por este
1:13:43chorreado rojo que obviamente no tiene
1:13:45ningún color por ahora.
1:13:50Y ahí lo desnaturalizo con hidróxido de
1:13:52sodio. Rompo todos los puentes de
1:13:54hidrógeno entre base y base y se quedan
1:13:56pegados esos ADNs en la nitrocelulosa en
1:13:59el lugar donde habían corrido.
1:14:02Sí. Entonces, ahora tengo una copia en
1:14:06nitrocelulosa de esta corrida.
1:14:09No es la copia, es la corrida porque acá
1:14:12quedó el ADN. La ADN se fue acá.
1:14:16Okay. Y ahora, ¿qué hago? Tengo todos
1:14:19los fragmentos acá genoma
1:14:22y voy a buscar el gen A B C D o el gen
1:14:27de insulina o lo que quiera yo buscar
1:14:30con una sonda radioactiva o unas sondas
1:14:32fluorescentes también puedo usar,
1:14:36o sea, ADN
1:14:38sintetizado con isótopos radioactivos o
1:14:41ADN sintetizado sin isótopos
1:14:43radioactivos, al cual después le
1:14:45modifiqué en una puntita, le puse una
1:14:48cola fluorescente para que yo después lo
1:14:49pueda detectar.
1:14:53¿Y qué va a pasar? La sonda se va a
1:14:55hibridar en algún lado y ahí de vuelta
1:14:57tengo que lavar. ¿Con qué condiciones
1:14:59voy a lavar? Depende la sonda. ¿Cuánta
1:15:02homología hay entre las onda y lo que
1:15:04quiero encontrar? Si lo que quiero
1:15:06encontrar es muy parecido, voy a ser muy
1:15:09riguroso. Si lo que quiero encontrar es
1:15:11muy diferente, voy a ser menos riguroso.
1:15:15Si quiero encontrar los genes omióticos
1:15:18que había descubierto en Drosófila y los
1:15:20quiero encontrar en vertebrados o digo
1:15:23estarán envertebrados, tengo que hacer
1:15:25unación muy rigurosa o poco rigurosa
1:15:32sería poco riguroso.
1:15:34Si la sonda es de drosófila, es decir,
1:15:36una mosca, y quiero encontrar el gen en
1:15:40en una rana que es un vertebrado, tengo
1:15:43que hacer una sonda poco rigurosa. ¿Sí?
1:15:46Y por ejemplo, puede ser que mi sonda
1:15:49revele dos bandas, una de 2 kes y una de
1:15:524 kbases.
1:15:54¿Qué quiere decir eso?
1:15:58¿Cuántos genes encontré?
1:16:04Uno, dos.
1:16:06No sabes,
1:16:07no sabés. ¿Qué sabes? Está
1:16:11sé que hay algo
1:16:13y que esto está cortado con Eco R1 acá y
1:16:15acá y acá y acá. No sé si estos estaban
1:16:17pegados entre sí y justo después los
1:16:20cortó y separó al un gen en dos pedazos
1:16:23o si bien son dos fragmentos y este
1:16:25tiene un gen y este tiene otro gen. Por
1:16:27decir algo.
1:16:30Con lación
1:16:32siempre se hacen eh de 6 kg bases
1:16:37o de cuatro, ¿no?
1:16:39Ah, puede ser el salazar.
1:16:42La enzima de restricción corta donde
1:16:43corta. En este ejemplo había un
1:16:45fragmento de 2 kbas bases y uno de 4
1:16:47kbas bases. En este ejemplo era un solo
1:16:50fragmento que fue cortado en dos. Un
1:16:52solo una sola región que fue cortado en
1:16:54dos. Esta y esta. Ambas son reconocidas
1:16:57por las ondas,
1:17:00pero podría ser de 10 kbas, de 20
1:17:02kbases, depende de la SA, de la
1:17:04presencia o ausencia del sitio de corte
1:17:06de encima de restricción que use.
1:17:14Bueno, entonces con la técnica de
1:17:16Saudan, dependiendo de la sonda que
1:17:18utilice, puedo encontrar fragmentos de
1:17:21ADN del genoma original.
1:17:24Entonces,
1:17:26no solo con la sonda puedo encontrar un
1:17:29clone en la bacteria que tenga el
1:17:30plásmido con el fragmento de ADN, sino
1:17:33que puedo eh descubrir el tamaño de ese
1:17:36fragmento si lo corro en un sábado. La
1:17:39diferencia entre usar lo paraar una
1:17:42lágida que tiene colonias es que después
1:17:44tengo algo vivo del cual preparar un
1:17:46plagio. Acá la única información que
1:17:49tengo es que hay un fragmento de 4 kil
1:17:51bases que reconoce las ondas, pero no
1:17:53los tengo para hacer nada con él, solo
1:17:56lo veo.
1:17:58Está muy esto.
1:18:01¿Correcto?
1:18:06No se podría hacerment, o sea, está
1:18:09desnaturalizado, pero no se puede
1:18:10[carraspeo] volver libre.
1:18:11No, no puedes hacer nada. Podés hacerlo
1:18:13de vuelta
1:18:15con otra muestra y esa muestra no no es
1:18:18de naturalizarla.
1:18:20Pero esto ya está acá. Se terminó el con
1:18:23esto se terminó el experimento. Lo
1:18:25guardo.
1:18:25Lo cortaste. Entonces, no lo puedo
1:18:27volver a usar.
1:18:28No lo puedo volver a usar. Exacto.
1:18:30Porque lo cortaste
1:18:31y lo desnaturalicé y se pegó a la
1:18:33electrocelulosa. Esto está abuminado.
1:18:36Ah,
1:18:38¿qué tiene la
1:18:41su composición? química es como es un
1:18:44papel y te pega. Okay, esa es una muy
1:18:47buena pregunta para el chat.
1:18:54Okay. Hay una técnica muy muy parecida
1:18:57para ARN.
1:19:00Sí, ustedes ya conocen el western.
1:19:02Western. La palabra western no tiene, no
1:19:05es una persona que se llama western,
1:19:07sino que como había una persona que se
1:19:08llamaba Saudan, se inventó esta técnica
1:19:10que se llamó entonces Norther y después
1:19:12se inventó la técnica de West. Okay. La
1:19:15que no hay es
1:19:20northern blood. Blood quiere decir esta
1:19:22parte de acá cuando transfiero de la
1:19:25garosa a la antcelulosa.
1:19:29Okay, [carraspeo] eso es blotear,
1:19:32especializar la el verbo to blot inglés.
1:19:37Okay. Entonces, ¿qué hago acá? En vez de
1:19:39cortar ADN con enzima de restricción,
1:19:42como había hecho para la técnica de
1:19:45ahora, ¿qué hago? preparo a RN de un
1:19:47determinado tejido,
1:19:51¿okay? Y que lo meto y lo corro en un
1:19:54gel de agarosa de vuelta.
1:19:57Acá hay que hacer algo diferente a lo
1:19:59del ADN. El ADN, se saben ustedes,
1:20:01obviamente que es doble cadena, entonces
1:20:03no tiene estructura secundaria.
1:20:06En cambio, el ARN, al SAT simple cadena,
1:20:08forma estructuras secundarias,
1:20:10¿sí? tortquillas, pliega de distintas
1:20:13maneras y eso afece cómo corren la
1:20:15granosa. Yo quiero que corran solo por
1:20:18el tamaño, no por la forma.
1:20:21Entonces, lo tenemos que planchar así
1:20:22como a las proteínas planchamos
1:20:24hirviéndolas con ese
1:20:29a las a los ARN los planchamos
1:20:33agregándoles formal de formal deo. Sí,
1:20:37¿saben lo que es el formal de oído?
1:20:39¿Sabes
1:20:41lo que es un albellido? ¿Qué es un
1:20:43albellido?
1:20:48Eh,
1:20:49funcional.
1:20:50¿Cuál?
1:20:53Puede ser que tiene la doble glób
1:20:55oxígeno.
1:20:56Es un oxígeno que con doble enlace con
1:20:58el carbono y y un hidrógeno en una punta
1:21:01un carbono.
1:21:02Carbono, oxígeno y en el caso del formal
1:21:05de hidro tiene un solo carbono, entonces
1:21:07tiene dos hidrógenos.
1:21:09un carbono unido a un oxígeno con dos
1:21:12hidrógenos. Ese es el formal de
1:21:16forma de es una molécula que le gusta
1:21:19hacer fuentes de hidrógeno.
1:21:22Entonces, el formal deido se va a meter
1:21:25en las en las fuentes de hidrógeno que
1:21:27forma el ARD consigo mismo y los va a
1:21:29destruir porque va a ser él el puente de
1:21:32hidrógeno con las bases.
1:21:35Entonces, lo plancha. Es como el SDS
1:21:38para las proteínas,
1:21:40¿okay?
1:21:41Pero el SS no es un anterior, no es un
1:21:44detergente.
1:21:48Entonces, con el formal de Ido, plancho
1:21:50el RNA, que entonces corre solo por
1:21:53tamaño de negativo a positivo.
1:21:59Luego lo transfiero igual que antes, lo
1:22:02tengo en una membrana y ahora lo hibrido
1:22:04con una sonda radioactiva hecha de ADN o
1:22:07de ARN, como quiera yo, en general. son
1:22:10de ADN. ¿Y qué va a pasar? Va a revelar
1:22:13una banda de, por ejemplo, 2,1 kes.
1:22:19¿Y eso qué es?
1:22:25¿Qué representa esta banda de 2,1 kes?
1:22:28No sería todo el mensajero que estoy
1:22:31buscando. El
1:22:32Ahí es donde fue el ARN mensajero que
1:22:35estoy buscando. ¿Y qué tamaño tiene?
1:22:392,1.
1:22:40kilobas, 2100 bases. Okay. Entonces,
1:22:46si esto tiene 2100 bases,
1:22:50¿qué tamaño tiene
1:22:55la zona codificante?
1:23:00La cu, ¿qué tamaño tiene la zona
1:23:02traducida?
1:23:07Si yo tengo que decir qué tiene este re
1:23:09mensajero al principio, que está el cap
1:23:12después que hay.
1:23:14Ah,
1:23:17pregunta
1:23:17si yo hago y
1:23:20codificante
1:23:22después del
1:23:23cinco primas.
1:23:25Después del capen los exones unidos y al
1:23:28final el polía. Eso estamos todos de
1:23:31acuerdo. Entonces, ¿quiere decir que la
1:23:33suma de los exones más el polio de A da
1:23:372100? Porque un no sé qué tama, no tengo
1:23:40ningún tamaño, una base, ¿sí?
1:23:47¿Cuánto es zona cinco prima no
1:23:49traducida?
1:23:52No lo sabemos. No lo sabemos, pero por
1:23:55ejemplo que sean 100 bases,
1:23:58¿okay? Y después sabes una crestucida
1:24:01que pueden ser otras 100 bases. Y si la
1:24:04cola de polía eran 100 bases, 100,
1:24:07¿cuánta zona no traducida hay? 300. Sí.
1:24:13Si ustedes tienen que contestar en el
1:24:14parcial, ¿qué tamaño tiene la zona no
1:24:16traducida, aclaren si están incluyendo o
1:24:18no la colgar en general no hace falta?
1:24:21Puedo decir la zona no traducidas de C
1:24:23prima que son 200 bases en este ejemplo
1:24:26más la cola de alcohol.
1:24:30Entonces, ¿cuánto queda traducido
1:24:33de los 2100?
1:24:35Menos.
1:24:35¿Cuánto?
1:24:361800.
1:24:381800.
1:24:39Sí, es menos que
1:24:42Pero nos tuviste que dar la el largo del
1:24:45primerado y
1:24:47asiendo. Eso no lo podíamos saber.
1:24:49No lo podíamos saber. Okay,
1:24:50pero con lo que yo dije sí.
1:24:53Entonces, ¿cuántos aminoácidos hay?
1:24:56¿Cuántos aminoácidos tiene la proteína
1:24:59de este mensajero?
1:25:031800
1:25:05di 3
1:25:06-1
1:25:06-1.
1:25:08¿Por qué -1?
1:25:09Porque el stock.
1:25:11Entonces ahí cuando ustedes contestan la
1:25:12zona no traducida, o yo se los digo o
1:25:14ustedes lo tienen que preguntar, incluye
1:25:16el conod la zona tres prima no
1:25:18traducida, ¿o no?
1:25:21porque no es traducida, pero bueno, en
1:25:23realidad lo puedo considerar como
1:25:25traducida porque lo lee y lo
1:25:28entonces ahí hay que aclarar. Entonces
1:25:30es 1800 di 3 menos 1 o no, dependiendo
1:25:33si considero el stock como 3 UTR o no.
1:25:38¿Y qué tamaño tiene entonces la proteína
1:25:41codificada? El peso molecular
1:25:43aproximado.
1:25:46110
1:25:47Eso por 110.
1:25:49Okay. Bueno, todo eso podemos sacar del
1:25:52nord block con alguna información extra.
1:25:56Tengo una pregunta relata, no entiendo
1:25:59por qué lo hacemos correr al
1:26:01electropores al princip, o sea, porque
1:26:03después esa banda la sacas de otra
1:26:05electropesi
1:26:06esta banda no la saco, miro. Ah, mira,
1:26:08hay un mensajero de 2,1 kbases.
1:26:10Pero, ¿dónde ves esa esa banda? Porque
1:26:13se radioactiva, porque le pegué la
1:26:15sonda.
1:26:16Lo que habíamos hecho con las colonías
1:26:17de
1:26:18Claro. Y lo mismo del Saudo.
1:26:21Sí, me perdí un poco.
1:26:23A ver,
1:26:24este es el
1:26:26técnica que vimos antes.
1:26:29el ADN
1:26:31cortado en distintos lugares por la
1:26:33encima de restricción y se separan por
1:26:36los tamaños de restricción que quedaba
1:26:40y los revelo con la sonda radioactiva y
1:26:42veo los dos pedazos. Quiere decir que la
1:26:45sonda revela una región genónica de 2
1:26:48kbas bases y 4 kbas bases.
1:26:52Pero, ¿para qué? Pero, o sea, el tamaño
1:26:55no va a cambiar por pasarlo con una
1:26:56electrofluores y solo vas a saber el
1:26:58tamaño.
1:26:59Claro. Y es lo que tiene que saber,
1:27:02¿está el gen o no está el gen. Por
1:27:04ejemplo, tenía la sonda de grosófila y
1:27:08lo hice con el genoma de ratón.
1:27:12¿Encontré algo? Sí. ¿Qué encontraste? Y
1:27:14una banda de 4 k es una de 2 k.
1:27:18Quiere decir que el gen que use la sonda
1:27:20de hidrosófila está en las células eh
1:27:22humanas.
1:27:30Si no te pregunto después.
1:27:33En la técnica de Nordan, lo que voy a
1:27:36ver es si un determinado mensajero está,
1:27:39por ejemplo, en podría ocurrir que en
1:27:41cerebro aparezca la banda de 2,1 y en
1:27:44hígado no aparezca. ¿Qué quiere decir
1:27:47eso? Que el gen
1:27:49que el gen no se expresa en hígado. O
1:27:52podría ocurrir que en cerebro sea de 2,1
1:27:54y que hígado sea de 2,5.
1:27:57¿Qué querría decir?
1:27:59Que se tiene alternativo.
1:28:02También podría entonces aparte
1:28:05el splicing es tal que se incluye un
1:28:07exón en en hígado que no se incluye en
1:28:10cerebro, pero podría ocurrir que en
1:28:13hígado aparezcan las dos bandas.
1:28:15¿Qué quiere decir eso?
1:28:18Que se incluyen y no se incluyen, que es
1:28:20un splic alternativo y que el 50% de los
1:28:23mensajeros, por ejemplo, lo incluyen y
1:28:25el 50% no lo incluye. Dependiendo de la
1:28:27situación ustedes sabrán interpretar lo
1:28:29que quiere decir.
1:28:33Es lo que van a hacer en los problemas
1:28:34de las guías.
1:28:43Acá tienen
1:28:46un poquito más explicado, dibujado cómo
1:28:49interpretar
1:28:52cómo se hace la técnica, la
1:28:53transferencia. Acá tenemos un gel de
1:28:57agarosa donde vamos a hacer la
1:28:59electroforesis.
1:29:00Acá en el carril de la izquierda esas
1:29:03rachitas, ¿qué serán?
1:29:06Los marcadores de peso molecular.
1:29:08Acá tengo mis tres calles que corrieron,
1:29:10el ADN o el ARN, da lo mismo. Después lo
1:29:14pongo acá con el la nitrocelulosa.
1:29:19Acá está el gel de este gel acá, eso
1:29:22todo acá. Ahí puse la nitroccelulosa y
1:29:24arriba pongo un montón de cerveilletas.
1:29:27Okay. Y entonces el líquido va a ir para
1:29:30arriba, se va a mojar todo esto y va a
1:29:33arrastrar al ácido nucléico que va a
1:29:36quedar pegado en la membrana
1:29:38nitrocelulosa, que ahora la levanto, la
1:29:41pongo en una bolsita donde tiene el
1:29:43líquido con la sonda radioactiva que va
1:29:46a ir moviéndose en el líquido y se va a
1:29:48quedar pegada en algún lado. Después lo
1:29:51lavo, lo lavo, lo lavo en las
1:29:52condiciones de que a mí me parecen
1:29:54adecuadas y finalmente obtengo mis tres
1:29:58bandas. En este caso, en este carril,
1:30:00una de acá, una de acá, una acá.
1:30:02Dependiendo de lo que sea el caso que yo
1:30:04hice por qué aparecen tres bandas
1:30:08de distinto tamaño.
1:30:12Eh, habíamos visto, por ejemplo, la otra
1:30:15técnica de blot que era
1:30:1824. En este caso se el anticuerpo está
1:30:22unido al al ADN sonda o el ADN sonda se
1:30:26une por
1:30:26acá no hay ningún anticuerpo. El ADN
1:30:29sonda se une
1:30:31El ADN sonda se une
1:30:33sin ningún mediador, ningún factor que
1:30:35lo ayude unirse.
1:30:36¿Quién ayuda a que la sonda se una a la
1:30:40ADN en la membrana en la hipocelulosa?
1:30:44Dos personas lo ayudan. Haso y Crip. Ah.
1:30:49por por complementaridades, simplemente
1:30:51no hay nada que necesit.
1:30:53Okay.
1:30:57Okay.
1:31:00Nada que ver con los anticuerpos.
1:31:05El resultado es parecido una banda por
1:31:08razones diferentes.
1:31:11A lo que tienen en común es que los
1:31:13anticuerpos se unen a las proteínas por
1:31:16puentes de hidrógeno y otras
1:31:18interacciones que pueden ser
1:31:19interacciones débiles. Sí. Y acá se unen
1:31:22por puentes de hidrógeno. Okay.
1:31:25Siguiendo las recomendaciones,
1:31:27instrucciones de quién?
1:31:30De Watson y CR.
1:31:35Acá tenemos un detalle más zoom, ¿okay?
1:31:39Del gel. Acá hay una solución que
1:31:42mantiene, ¿sí? E, ¿cómo se dice?
1:31:45Desnaturalizado al ADN para que se
1:31:48transgiera y quede pegado
1:31:50desnaturalizado. Por eso dice alcal,
1:31:54¿okay? Una solución alcalina.
1:32:02Esto ya lo ya lo vimos bien. Okay.
1:32:06Entonces, las sdas, la sonda
1:32:12es la que manda y determina qué veo.
1:32:16Okay, como habíamos ya dicho un poco
1:32:18antes, si este es mi gen en el genoma,
1:32:22¿okay?,
1:32:23y lo corté con la enzima E estos
1:32:26lugares.
1:32:27Las sondas pueden ser todas estas que
1:32:29están acá en verde.
1:32:32Lo que voy a ver en el sound va a ser
1:32:34diferente,
1:32:36aunque material cortado es el mismo. Si
1:32:40uso la sonda esta, ¿qué voy a ver?
1:32:48Esta sonda es híbrida acá.
1:32:53Entonces voy a ver el fragmento de 3,2 k
1:32:55bases y algún fragmento de acá que no sé
1:32:58taman.
1:33:00Okay, pero no voy a ver nada de esto.
1:33:04Si uso la sonda esta de 1,3 kbas, ¿qué
1:33:07voy a ver?
1:33:10El cargamento 0,9. ¿Y qué más?
1:33:13Voy a ver qué bandas voy a ver.
1:33:16anterior también.
1:33:20¿Qué bandas voy a ver en el gel? En la
1:33:22membrana
1:33:24voy a ver una banda de 0,9, voy a ver
1:33:27una banda de 3,2 y voy a ver una banda
1:33:29de 7,4
1:33:31porque con 20 bases ya alcanza que
1:33:34hibride. No necesito hibridar toda la el
1:33:38fragmento. Con hibridar en un pedacito
1:33:40nada más se queda pegado ahí. Aunque el
1:33:43resto esté explotando, la sonda se queda
1:33:45pegada.
1:33:47Pero el fragmento verde no es tan largo
1:33:50como para cubrir el primer fragmento
1:33:52verde no es tan para cubrir toda la
1:33:54zona. Toda la
1:33:55está
1:33:55sí
1:33:56no es tan largo como para cubrir. ¿Qué?
1:33:58Toda la zona de 3,2,
1:34:00¿no? Justamente es lo que tiene que
1:34:02explicar
1:34:03solamente vas a ver el pedacito que
1:34:04cubre la sombra,
1:34:05¿no?
1:34:08¿Qué fragmento va? Vamos a este que es
1:34:09más fácil. Este, ¿qué fragmentos va a
1:34:12revelar?
1:34:15El de 0,9, el de 3,2 y el de 7,4.
1:34:20Porque se une, porque se une un poquito,
1:34:23un poquito.
1:34:24Y ya está con eso,
1:34:25con eso alcanza porque tengo que me
1:34:27agarro y a dónde me agarré y me agarro
1:34:29un fragmento de 3,2 kbases. ¿Cómo sé que
1:34:32es 3,2 kbases? Y porque migró en el
1:34:35tamaño de 3,2 kes y en un cachito se le
1:34:38agarró la sonda. Esta parte, ¿qué
1:34:40importa? Nada. Esta parte fue importante
1:34:42para la movilidad, pero para agarrarse
1:34:44con esto alcanza.
1:34:46Okay.
1:34:48Yo para agarrarme de alguien necesito
1:34:49con agarrarme la mano alcanza, no me
1:34:51tengo que agarrar de toda la persona.
1:34:55¿Por qué necesitamos hacer el blog no
1:34:58puedoar?
1:35:01Es mucho más fácil controlarla el lavado
1:35:04en la membrana. Lo lavo que vaida. tiene
1:35:07que entrar el líquido, salir el líquido,
1:35:09entrar en líquido, salir el líquido.
1:35:13Es muy incómodo
1:35:17esta sonda. ¿Qué va a revelar?
1:35:222,7 y 7,4. Y esta sonda
1:35:247,4
1:35:257,4. Okay. Es decir, el tamaño depende
1:35:30del fragmento,
1:35:32pero qué veo depende de la sonda
1:35:36y de las condiciones deción.
1:35:49Pausa.
1:35:51Hacemos un intervalo
1:35:54hasta y media. Uno podría hacerlo. No
1:35:57conozco existía.
1:36:01Okay.
1:36:02Hago alguna basado en algunas preguntas
1:36:04que me hicieron, hago una aclaración de
1:36:06acá de las técnicas estas. Sí, se
1:36:09generan los fragmentos que quiero
1:36:11separar o bien por corte con restricción
1:36:15en la técnica de Sauro, o bien por los
1:36:18mensajeros que ya tienen su propio
1:36:19tamaño cada uno.
1:36:22Para la técnica de Nor se corre la
1:36:26electrforis,
1:36:28se separan entonces los fragmentos, se
1:36:29transfieren en la nitrocelulosa,
1:36:32en la nitrocelulosa se incúan con la
1:36:34sonda. En el caso del ADN hay que
1:36:37desnaturalizarlo, tiene que ser doble
1:36:39cadena. Es doble cadena, tiene que ser
1:36:40simple cadena para que se pueda unir a
1:36:42la sonda. La sonda es lo que yo quiero
1:36:45usar de sonda de acción. Puede ser una
1:36:48sonda una especie de la misma especie,
1:36:50con lo cual voy a hacer que las
1:36:53hibridaciones se hagan en condiciones de
1:36:55máxima de velocidad,
1:36:57si es que quiero encontrar el gen que
1:36:58corresponde a la sonda. Sí, pero si
1:37:01quiero encontrar genes parecidos que no
1:37:03son exactos a la sonda, voy a distribuir
1:37:05la velocidad. Y puede ser que puedair
1:37:07encontrar genes parecidos que antes no
1:37:09me había dado cuenta que estaba.
1:37:13La sonda va a encontrar la región con la
1:37:16que tiene homología. En este ejemplo
1:37:20de 1,3, estas acá hay varias sondas.
1:37:23Cuando yo hago la iluminación, elijo qué
1:37:25sonda usar. En este ejemplo es, si uso
1:37:28la sonda de 1,3, voy a ver tres bandas.
1:37:32Si uso la sonda de 250, voy a ver una
1:37:36banda. Si uso la de 100, voy a ver dos
1:37:39bandas. No es que uso todas las sondas a
1:37:41la vez, uso la sonda que quiero.
1:37:44Mientras más chica la sonda, más grandes
1:37:46son de fragmentos.
1:37:49Cuanto más chica la sonda, más chances
1:37:51hay de encontrar un solo fragmento.
1:37:53Exactamente.
1:37:55Pero también podría haber un sitio de
1:37:57corte justo acá en el medio.
1:38:02¿Les quedó alguna duda de esto? Lo van a
1:38:04ver en los seminarios.
1:38:09Bueno, ahora voy a contarles un poco
1:38:10cómo es la técnica de secuenciación,
1:38:15es decir, cómo se
1:38:18sabemos qué base viene luego de cada
1:38:20otra, ¿okay?
1:38:24Y
1:38:27no podía dejar de mencionar que le
1:38:29dieron
1:38:32el Premio Nobel en el año 80, ¿sí? A
1:38:36Gilbert y a Sanger por dos técnicas de
1:38:39secuenciación que descubrieron unos años
1:38:42antes, que no es que descubrieron las
1:38:44técnicas, sino que inventaron las
1:38:46técnicas. Sí. El mismo año que le dieron
1:38:49el Premio Nobel a Paulberg, que fue el
1:38:51primero que hizo una molécula de ADN
1:38:53recombinante. Como vimos la clase del
1:38:56martes, ADN recombinante es todo lo que
1:38:58estamos viendo acá, que es agarrar un
1:39:00pedazo de ADN de una especie de un lugar
1:39:03y ponerlo en otro lugar. Ese ADN está
1:39:06combinado de una manera que no estaba
1:39:08combinado antes. Por eso se dice ADN
1:39:10recombinando.
1:39:12Lo que él fue hizo fue clonar un
1:39:14fragmento de coli de esqueletra coli en
1:39:18el virus circular de mono SB40.
1:39:23Se puso un fragmento de una bacteria en
1:39:26un ADN del virus de Noamito. Ese es el
1:39:29primer ADN recomendado.
1:39:36Gilbert con Maxam hicieron una técnica
1:39:39que se llamó en ese momento la técnica
1:39:41de Maxam y Gilbert y Sangber hizo la
1:39:44técnica de Sander, que es la técnica que
1:39:46se siguió usando por muchos, muchos
1:39:50años. Ahora hay unas técnicas
1:39:52diferentes, sí, que también se usan,
1:39:55pero la técnica de sanger se sigue
1:39:57utilizando modificada, pero es la misma
1:39:59y es lo que les voy a explicar ahora.
1:40:07Método de sanger.
1:40:10El método de sanger de secuenciación es
1:40:12un método que utiliza la una ADN
1:40:15polimiderasa para extender la secuencia
1:40:19de lo que quiero secuenciar.
1:40:21Okay, entonces
1:40:24vamos a agarrar un ADN. Sí,
1:40:28pongamos que queremos secuenciar esto.
1:40:31No tengo la secuencia, pero es lo que
1:40:33quiero secuenciar.
1:40:35¿Qué hago? Agrego un primer.
1:40:39Es decir, que esto es tres prima, CCO
1:40:40primas. El primer tiene que ir de CCO
1:40:42prima tres primas. AT CA va a ir ahí.
1:40:45Todos lo ven
1:40:49y qué pasa si yo agrego DNA polimerasa y
1:40:52los deoxinucleótidos.
1:40:55La polimeraza polimeriza secuencia algo,
1:40:58¿no? Lo único que hice fue copiar.
1:41:02Ahora, si en esta mezcla la enveneno
1:41:07con
1:41:09didoxinucleótidos,
1:41:11es decir, nucleótidos, el el
1:41:14deoxinucleótido tiene el oxidrilo 3
1:41:17prima y le falta el oxidrilo dos prima,
1:41:19si no sería. ¿Se acuerdan?
1:41:23¿Qué pasa si mezclo
1:41:26entre medio de los de los
1:41:27deoxinucleótidos un nucleótido que no
1:41:30tenga el oxido 3 prima?
1:41:33La gria polimerasa no se da cuenta
1:41:37cuando lo pone, pero después, ¿qué va a
1:41:39pasar? No va a poder seguir
1:41:42porque le falta el oxidrilo este para la
1:41:45siguiente base. Va solo va a poder poner
1:41:48una base, ¿sí o no?
1:41:52Por eso se llaman terminadores,
1:41:56chain terminators. Terminan la cadena.
1:41:59Si la polerasa agarra ese, se terminó.
1:42:02Esa molécula no la va a poder continuar.
1:42:06Okay. Entonces, tengo esta molécula
1:42:08secuencial, este primer, pongo una
1:42:11mezcla donde pongo muy una cantidad
1:42:13pequeña, el 1% de videooxinucleótidos,
1:42:18que son los terminadores. Pongo una A, T
1:42:21C o G en forma de videóxis.
1:42:26En la técnica original poníamos uno de
1:42:28cada uno, pero se pueden poner los
1:42:30cuatro puntos. Ahora le voy a explicar
1:42:31cómo funciona.
1:42:33Para entender la técnica, tengo que
1:42:36recordar que cada vez que yo hago una
1:42:37reacción vitro, no pongo una molécula de
1:42:41ADN secuencial, pongo millones.
1:42:44Pongo un tubo con una concentración
1:42:47determinada de la ADN secuencial, que
1:42:50serán miles y miles de moléculas que
1:42:53quiero secuenciar. y pongo miles y miles
1:42:55de primers.
1:42:57Todos los primers se van a pegar a sus
1:43:00secuencias que encuentren de acuerdo a
1:43:04las instrucciones de Watson y
1:43:07Okay.
1:43:09Y ahora la polimerasa
1:43:11en alguna secuencia va a empezar a
1:43:14secuenciar y va a usar estos.
1:43:16Como esto lo puse 1%
1:43:19de lo que había acá, uno de cada 100 as
1:43:22va a poner una de oxidar.
1:43:25Sí, cada cuando pone la primera acá va
1:43:27una G, entonces pone una C. Acá hay una
1:43:31T, debería poner una A. Sí, pone una A,
1:43:33pero cada tanto va a poner una A
1:43:34verdadera, pero una vez cada 100 va a
1:43:36poner una b deóxida. Ahí se cortó la car
1:43:41y una hay una probabilidad de que ponga
1:43:43una dioxis G o una dioxis C o una dioxy
1:43:48sí 1% de probabilidad para cada molécula
1:43:52de las miles y miles de moléculas que
1:43:54hay.
1:43:56Cuando puso la molécula correcta y puede
1:43:59seguir polimerizando, va a seguir
1:44:01polimerizando. ¿Hasta qué? Hasta que la
1:44:03siguiente ponga y ponga de vuelta. Puede
1:44:06ser una dexi o una normal.
1:44:10La mayor probabilidad es que ponga una
1:44:11normal, pero para tanto se va va a poner
1:44:14la que no puede seguir, un terminador.
1:44:18¿Correcto? Entonces, al final de la
1:44:20reacción, ¿qué va a pasar cuando todas
1:44:22las cadenas estén terminadas? O bien
1:44:25porque si completó la secuencia, o bien
1:44:27porque puso un check terminator.
1:44:30Sí, voy a tener al resultado eso voy a
1:44:33hacer una familia de tamaños.
1:44:36Voy a tener el tamaño completo, el
1:44:38tamaño que le falta uno porque había un
1:44:39terminador, un le faltan dos, le faltan
1:44:42tres, le faltan cuatro, le faltan todos,
1:44:44es decir, una escalerita de tamaños.
1:44:50Ahora, si los vioxi, aparte de ser
1:44:53videoxid, son fluorescentes y cada
1:44:56videoxi es fluorescente con otro color,
1:44:59¿qué va a pasar? Voy a tener los verdes,
1:45:03por ejemplo, este, ¿qué color es de acá?
1:45:04Rojo.
1:45:08Yo soy medio del
1:45:11verde, rojo, naranja,
1:45:15amarillo,
1:45:15amarillo, azul.
1:45:19Okay. Entonces voy a tener en todos los
1:45:23lugares. Ah, perdón. Entonces, tengo esa
1:45:26familia de moléculas todas de distinto
1:45:30tamaño terminadas en un terminador
1:45:33fluorescente distinto. Todos los que
1:45:35terminan en A son verdes. Todos los que
1:45:38terminan en T son
1:45:42rojos. Los que terminan en G
1:45:46amarillos y los que terminan en C son
1:45:48azules. Okay.
1:45:53Y tienen distintos tamaños.
1:45:56Entonces, les puedo hacer una
1:45:58electroforisis de todos esos. Sí, me
1:46:01tengo que obviamente eh desnaturalizar
1:46:03esto, ¿sí? Para sacarle la la cadena
1:46:07esta y los ha una electroforesis
1:46:11se llama encapilar, no necesito hacer un
1:46:13gel rectangular. Con un tubito de
1:46:16agarosa o de poliaclilamida se usa, me
1:46:19alcanza. Pongo mi muestra acá y le pongo
1:46:22un campo eléctrico. Van a avanzar,
1:46:25¿okay? Van a ir para allá.
1:46:29¿Estamos de acuerdo? ¿Quién va a llegar
1:46:31primero?
1:46:33¿Cuál es el más pequeño?
1:46:35El que puso el que puso acá una C
1:46:39bdeoxi. Una B deoxi C. Ese es el más
1:46:42corto. Es el primer con una base nada
1:46:44más. ¿Y qué color va a tener?
1:46:48Azul. Si yo acá tengo un detector de
1:46:50fluorescencia que puedo desectar los
1:46:52cuatro colores, voy a ver un piquito
1:46:56azul, que es lo primero que aparece.
1:46:59Fluorescencia azul y pasó. La que sigue.
1:47:03¿Cuál es? ¿De qué color la
1:47:04fluorescencia?
1:47:06Roja, ¿no? Una a verde. Aparece la
1:47:09verde. Sí. Entonces van apareciendo los
1:47:12colores de acuerdo a cada que fue el
1:47:16terminador que le tocó pasar ahí del
1:47:18tamaño ese para poder generar el tamaño
1:47:20hasta acá que termina en una G de color
1:47:24amarilla.
1:47:26Amarilla,
1:47:27sí. Tiene que haber puesto un videopi
1:47:29acá.
1:47:31Sí. Entonces voy a ir leyendo las
1:47:34moléculas de distinto tamaño que tienen
1:47:36distintas fluorescencias. Las
1:47:38fluorescencias que van pasando son la
1:47:41base que se puso,
1:47:43que es la complementaria a la que estaba
1:47:45en la cadena que quería secuenciar.
1:47:50Y al final
1:47:52tengo esto de acá para allá el cinco
1:47:54prima tres prima T
1:47:58a g. Okay, ese es el resultado que yo
1:48:02tengo. Si mando a secuenciar a una
1:48:05empresa, a la empresa le doy el ADN que
1:48:07quiero secuenciar, le doy un primer y le
1:48:10digo secuencialo por el método de Swer.
1:48:14Y el resultado es que unos días después
1:48:16me llega un archivo que es así.
1:48:22Entonces se la técnica original era
1:48:25cuantidad de radioactivos.
1:48:28Sí. Y había que hacer una reacción con
1:48:32el radioactivo. Son todos iguales los
1:48:33radioactivos, no puedo definir los
1:48:34colores. Tenía que hacer una reacción
1:48:38con Diddopi A, otra reacción separada
1:48:41con Dxid C, otra reacción con Dxid G y
1:48:44otra reacción con dioxid T y corría un
1:48:47gel uno a lo lado del otro y veía las
1:48:49cadenas terminadas radioactivas de
1:48:51distinto tamaño y iba leyendo así. Ahora
1:48:53les voy a mostrar cómo se veía eso, pero
1:48:56lo principal es que hayan entendido el
1:48:59método.
1:49:03Acá está de vuelta. Agrego exceso de
1:49:07normales de oxinucleótidos
1:49:10AT,
1:49:11o sea, de dexi ATP, dexp y de GTP más de
1:49:16polimeraza y baja. Okay. Y primer dice
1:49:20primer. Primer que agregar. Acá está el
1:49:22primer,
1:49:24¿okay?
1:49:26Y agrego pequeñas cantidades de los
1:49:28dioxinucleótidos
1:49:30fluorescentes. Cuando pongo la letra N,
1:49:32quiere decir que es cualquiera de los
1:49:33cuatro, en realidad quiere decir los
1:49:35cuatro. Pongo dioxi NTPs,
1:49:41los mezclo acá y empieza la reacción.
1:49:44Acá como había que poner una A, en este
1:49:46caso se puso la dixidad, pero ven, acá
1:49:49no se puso dixid, acá tampoco, solo acá.
1:49:52¿Por qué? Porque es probabilístico.
1:49:54¿Cuál es la probabilidad? Depende de la
1:49:56proporción que puse de uno y del otro.
1:50:01Si pongo solo de estos, obviamente la
1:50:04primera que aparezca se va a terminar
1:50:06siempre y no voy a poder secuciar nada.
1:50:11Todo se entiende.
1:50:15Antes los picos están super sentidos.
1:50:20Eso significa que, o sea, no entiendo
1:50:23por qué están hay tantos tipos que están
1:50:26pegados, por así decirlo, si se pone una
1:50:30de cada 10 veces una DDP,
1:50:36uno cada 100,
1:50:38claro,
1:50:38pero van a aparecer todas las moléculas
1:50:40posibles porque hay muchas moléculas,
1:50:43hay muchos moldes de acá,
1:50:45hay más de 100, hay miles de estos. Si
1:50:49hay 10,000 moléculas de molde,
1:50:53uno en 100 son 100. Van a aparecer 100
1:50:56moléculas más o menos un promedio que
1:50:58van a terminar en cada una de las bases.
1:51:03¿Okay?
1:51:06La diferencia de tamaño entre las
1:51:08cadenas
1:51:10muy microscópica para microscópica,
1:51:15mínima, pequeña, de cuánto específico,
1:51:19una base.
1:51:19Una base
1:51:21funciona,
1:51:25eh, no se correnes de poliacrilamida en
1:51:30vez de genesarosa porque tiene mejor
1:51:32resolución. Sí. está todo calibrado para
1:51:35que entre ciertos tamaños puedas
1:51:37distinguir de una base de diferencia.
1:51:40Ahora, si tu fragmento es de 10,000, no
1:51:42va a distinguir 10,000 y 10,00001.
1:51:45Pero si tuo es de 100 y 101, sí.
1:51:53Una consulta, entonces cuando se le
1:51:55agrega a la cadena unóxido nucleó, se
1:51:59corta directamente toda la cadena se
1:52:02no.
1:52:04Acá, ¿qué pasa? Se pone ideopsia, la
1:52:08polimeraza no puede continuar y se
1:52:09despega. Esto queda así como está.
1:52:13Yo tengo que hacer algo para
1:52:15naturalizarlo.
1:52:17Eh, una pregunta, la el primer que
1:52:20ponemos se pega a la secuencia alargada.
1:52:24Acá se pega acá,
1:52:25claro, pero tiene que ver con la
1:52:26secuencia que alargamos
1:52:29con la máxima para para el ADN. tiene
1:52:34que ver con que esto se divida con eso.
1:52:37Claro, pero había mencionado desde que
1:52:38antes tratábamos en la ADN con encima
1:52:41que lo alargaba la primera,
1:52:45pero en los extremos no. O sea, con el
1:52:48primer
1:52:49el primer me dice qué voy a secuenciar.
1:52:51Voy a secuenciar de acá para allá.
1:52:53Pero entonces con el primer perdemos la
1:52:55secuenciación de los primeros.
1:52:58Vas a secuenciar solo de acá para allá.
1:53:00De acá para allá, ¿no?
1:53:02Claro. Entonces, no podemos saber que
1:53:04había en la zona de primer.
1:53:05Con este primer solo puedo saber lo que
1:53:07hay de acá para allá. Evidentemente algo
1:53:10sabía porque el primer se pegó.
1:53:12Okay.
1:53:12Pero de acá para allá si no lo conozco,
1:53:14no lo conozco.
1:53:18Pero si quiero secuenciar para allá,
1:53:19¿qué hago?
1:53:21Hola.
1:53:25La compañera me pregunta, "Ah, pero
1:53:26entonces voy a poder secuenciar de acá
1:53:28para allá porque puse el primer y si yo
1:53:31quiero secuenciar para allá, ¿qué harían
1:53:34ustedes?
1:53:38Eh,
1:53:41pongo un primer que vaya para allá. Esto
1:53:43aparece simple cadena, pero en realidad
1:53:45es doble cadena. Yo tengo el doble
1:53:47cadena,
1:53:49entonces puedo poner un primer para allá
1:53:50y después puedo poner un primer para
1:53:51allá.
1:53:53Entonces secuencio una parte para allá y
1:53:55después otra parte para allá.
1:53:58¿Y cómo hicieron para conocer secuencia
1:54:00del primer? ¿Cómo sabían la secuencia
1:54:03del primer este?
1:54:06Porque esto lo estoy secuenciando porque
1:54:09los clon plásmidos que yo conozco.
1:54:15Yo lo cloné. Ah,
1:54:17agarré un pedazo del genoma y hice todo
1:54:19lo que expliqué antes
1:54:21en una bacteria y al final tengo un tubo
1:54:24con un pláido.
1:54:25¿Cómo lo secuencio?
1:54:27El plágido lo conozco. Entonces, pongo
1:54:30un primer en el borde del plido y este
1:54:32es el inserto.
1:54:34Alguna vez lo habré hecho.
1:54:37Entonces, teníamos
1:54:38Sí, hay técnicas, técnicas originales
1:54:40que no requerían, no eran técnica,
1:54:43permitían secuenciar sin saber la
1:54:44secuencia.
1:54:47sin tener que poner un
1:54:55entonces los tremendos
1:54:58imaginar el
1:55:01se corresponde con
1:55:02los más chicos o los más grandes
1:55:04los más pequeños quedan al final más
1:55:07rápido.
1:55:08Estos son los que quedan al principio,
1:55:11los que llegan primero.
1:55:12Claro.
1:55:14eh
1:55:15se corresponde con la base
1:55:17complementaria a la que está en el
1:55:19extremo prima de la
1:55:22Exacto. El el extremo, el más rápido va
1:55:24a ser el que tenga una deopsis C. Sí.
1:55:27Va a ser primer y una deopsi C. C quiere
1:55:30decir que acá hay una G.
1:55:32Claro.
1:55:35Eh, entonces incluso hoy en día si uno
1:55:37manda una muestra secuencial, primero
1:55:39tienen que hacer vector clonado antes de
1:55:41secuenciarla.
1:55:43Ahora no hace falta. Hay técnicas que no
1:55:46requieren pero si querés secuenciar por
1:55:48este método, tenés que tener un primer
1:55:52y no puedes secuenciar.
1:55:56No puedo explicar de vuelta.
1:55:58No entendí la parte de secuenciación del
1:56:00resto.
1:56:02Pero,
1:56:02¿qué parte?
1:56:04Eh, ¿cómo se secuencia?
1:56:07¿Alguien le puede explicar? Vamos a
1:56:08hacer acá.
1:56:11¿Cómo se secuencia? Supongamos que
1:56:14quiero saber esta secuencia.
1:56:16¿Qué tengo que agregar?
1:56:22Primer
1:56:24ADN polimerasa.
1:56:26¿Para qué? Para que polimerice.
1:56:29Para que polimerice, ¿qué necesito? Los
1:56:32deoxinucleótidos.
1:56:34Si pongo solo deoxinucleótidos, se va a
1:56:36sintetizar y no va no va a saber nada.
1:56:39Solamente se va a secuenciar.
1:56:40polimerizar.
1:56:42Si pongo una pequeña cantidad de
1:56:44óxidinucleótidos en cada molécula donde
1:56:47pase esto y está pasando simultáneamente
1:56:50en miles y miles de moléculas en el
1:56:51tubo, en alguna molécula se va a incluir
1:56:55acá una didopsi y la cadena esta se va a
1:56:57interrumpir.
1:56:59En otra cadena en el tubo va a pasar que
1:57:02se va a poner una dexis C va a terminar
1:57:05acá.
1:57:06Es decir, en todas las moléculas, en
1:57:09alguna molécula, va a pasar que se puso
1:57:11el deoxi que corresponde a cada una de
1:57:13las posiciones de lo que quiero
1:57:15secuenciar,
1:57:17¿okay?
1:57:18Y esos fragmentos de distinto tamaño que
1:57:21aparte cada video de tiene un color
1:57:23diferente porque los hice yo
1:57:25químicamente un fluoróforo, los puedo
1:57:30separar por electroforesis y detectar al
1:57:33final del capilar con un detector de
1:57:35fluorescencia que me diga qué color pasó
1:57:37en cada lugar y cada tamaño corresponde
1:57:41a una posición. Profe, con respecto a
1:57:43eso, no estamos haciendo para secuenciar
1:57:45como había dicho, como que mandaba
1:57:47analizar justamente la secuencia de
1:57:48colores que me quedó cono para conseguir
1:57:51la secuencia de nosotros, me tené que
1:57:53mandar lo que sea.
1:57:56Nosotros somos la humanidad
1:58:00lo en el laboratorio. Es un aparato.
1:58:04Yo lo hice en una época de Choice,
1:58:06etcétera, pero tenía un aparato que
1:58:08vendía
1:58:10nosotros o el aparato.
1:58:13Nosotros el aparato, la empresa con el
1:58:15aparato es lo mismo. Este es el método
1:58:19que se industrializó para secuenciar. Lo
1:58:22puedes hacer casero en tu laboratorio y
1:58:24te tenés que comprar los didoxy
1:58:27fluorescentes y tener el equipo para
1:58:30poder hacer la electronesis y la
1:58:32lectura.
1:58:37es cómo esos fluorescentes
1:58:41se hacen fluorescentes químicamente en
1:58:44el laboratorio.
1:58:48Le agregan un fluoróforo, no sé en
1:58:51dónde, en algún lado de la base se le
1:58:55agrega un florósforo que no afecta a la
1:58:57coleraza.
1:59:02¿Okay?
1:59:10Okay, entonces entendimos el método de
1:59:13sangar.
1:59:16Eso sí
1:59:20es difícil diferenciar
1:59:25ahí me lo preguntó el compañero.
1:59:27Diferencias microscópicas dijo. Sí, pero
1:59:31la electroforesis es muy buena.
1:59:33y separa que tiene una base de
1:59:36diferencia lo distingue.
1:59:38Okay.
1:59:40Fíjense, acá tienen un plásmido. Acá eh
1:59:44estábamos explicando antes un plásmido
1:59:47donde habíamos clonado, chicos,
1:59:49silencio.
1:59:51Acá clonamos un inserto, ¿sí?
1:59:54para
1:59:56y expresarlo. Por ejemplo, acá tiene un
1:59:58promotor bacteriano, pero queremos saber
2:00:01qué es esto. Para saber qué es esto, lo
2:00:03mando a secuenciar. Como todo este
2:00:05plásmido lo conozco, puedo poner un
2:00:07primer acá y secuenciar esto de acá. Y
2:00:10voy a obtener, por ejemplo, esta
2:00:12secuencia de acá. Y acá están las bases
2:00:14de la secuenciación, los picos de
2:00:16fluorescencia.
2:00:19¿Ven que aparecen acá un ruido acá
2:00:22abajo? Sí. que a veces hay errores en la
2:00:25secuenciación o la polimeraza puso por
2:00:28error alguna otra cosa y aparecen unos
2:00:30piquitos en la posición correcta del
2:00:33verde. Acá aparece un piquito ahí creo
2:00:35que es negro.
2:00:37Okay. Quiere decir que en la mayoría de
2:00:40los tamaños esos había una una a, pero
2:00:43en alguna posición, algunos cada tanto
2:00:45había una posición equivocada.
2:00:48o es una polimerización equivocada o
2:00:50tengo algo de contaminación o algo
2:00:53suciedad o algo pasó.
2:00:56Okay, entonces ahí leo directamente la
2:01:00secuencia que estaba acá, un pedacito
2:01:02nada más acá.
2:01:04Y acá a la izquierda les muestro lo que
2:01:07les contaba antes, la técnica original
2:01:09utilizaba en vez dexid fluorescentes
2:01:11usaba didóxid radioactivos y entonces
2:01:14generaba, se corría un carril distinto
2:01:17para cada letra. En este carril hice la
2:01:21reacción con ideia, C, G o T
2:01:26y corrí allá arriba, puse la muestra y
2:01:29la corrí. El primero que llegó fue,
2:01:31¿cuál? De todas estas cuatro calles,
2:01:33¿cuál fue el primero que llegó?
2:01:34La C.
2:01:35La C. El segundo,
2:01:39la G. El tercero.
2:01:41Entonces, la secuencia, ¿cuál es? C G A
2:01:45C A A A A A C A T G. Esa es la
2:01:51secuencia. y voy para arriba hasta que
2:01:53se apilotonen tanto ya no las puedo
2:01:55distinguir.
2:01:58Okay. Así se secuenciaba al principio,
2:02:02así como lo inventó eh
2:02:06la técnica.
2:02:08El sangre para entender bien parte de si
2:02:13es así. Sen que lo hizo de gen, no es
2:02:16que no se pueda hacer tod
2:02:20vos secuencias una parte, lo que podés
2:02:23hasta que se te apilotonen todos. Una
2:02:26vez que sabes esto, te haces un primer
2:02:28que pegue acá y avanzas.
2:02:30Haces un primer que pega acá y avanzas.
2:02:33Okay.
2:02:34Si no sabías nada de la secuencia,
2:02:36también puedes poner un primer acá y un
2:02:37primer del otro lado. Entonces, comenzas
2:02:39así hasta que se encuentren las
2:02:41secuencias.
2:02:44Okay.
2:02:46Ahora mandas a secuenciar y a los dos
2:02:48días te mandan la secuencia de todo el
2:02:49plasmo.
2:02:51Usan otras técnicas aparte de esta.
2:02:52Claro, pero es imposible hacerlo una
2:02:54cadena de ADN.
2:02:57una cadena de aduno
2:02:59de este de goo.
2:03:04Pero ahora puedes secuenciar de a miles
2:03:06y miles,
2:03:08¿okay?
2:03:10No todo.
2:03:16¿Qué hora es? Perfecto. Esto quedó
2:03:19claro. Secuenciación. Entonces, ya saben
2:03:21secuenciación.
2:03:27Las nuevas técnicas de secuenciación son
2:03:30nuevas nuevas generaciones. Sí, hay una
2:03:33técnica que lo que hace es no usa nada
2:03:37de todo eso. Esto se sigue usando y está
2:03:40bueno para entender la historia y está
2:03:43bueno porque está bueno como se
2:03:44supuesto. Pero ahora hay unas técnicas
2:03:46que utilizan unas superficies que tienen
2:03:48poroseritos
2:03:50por donde se hace pasar el ADN del otro
2:03:52lado para arriba y en la superficie
2:03:54donde va pasando el ADN como si
2:03:57estuviera siendo tirado, ¿no?
2:03:59Hay un lector que lee directamente la
2:04:03base que tiene distintas estructuras.
2:04:05Obviamente una A, una C, una C y una T
2:04:07no son iguales. Yo puedo ahora detectar
2:04:10directamente si está pasando una A, una
2:04:12C o una G
2:04:14o una T. directamente va subiendo, eh,
2:04:18la veo. Es como si estuviera mirando. Si
2:04:21yo las pie las puedo secuenciar, ¿no?
2:04:23Con los ojos si fuera suficientemente
2:04:25grande. Bueno, tenés detectores, se
2:04:27pueden detectar la distinta estructura
2:04:28química directamente. Son cuatro
2:04:31posibles igual tampoco tienen que usar
2:04:34cientos de miles de variantes. Sí.
2:04:36Entonces, vas girando y vas saliendo la
2:04:38secuencia. Vas leyendo, no haces nada,
2:04:41sale la cadena y la vas leyendo a medida
2:04:43que va pasando.
2:04:44Hay que desnaturalizarlo antes, ¿no?
2:04:45Para que se acabe siempre y no con el
2:04:47riesgo de que se rompa mientras que vas
2:04:49girando.
2:04:50No tengo idea de los detalles de la
2:04:55otra cosa que sabéis a quién le puedes
2:04:56preguntar.
2:04:58Bien,
2:05:04Sanger, este es el que les conté recién
2:05:06que le dirían el Premio Nobel. por la
2:05:09secuenciación, por la técnica de
2:05:11secuenciación de sangre.
2:05:14Casualidad que se llama igual la
2:05:15técnica, ¿no? Bueno, esto fue en 1980.
2:05:19Solo quería mencionar que esta persona
2:05:23es la misma.
2:05:25Sanger joven, Sanger viejo.
2:05:281980, 1958.
2:05:31Le dieron el premio Nobel en 1958.
2:05:34También
2:05:35hay pocos casos como este. Sí, por eso
2:05:38lo menciono. En 1958 le dieron el Premio
2:05:42Nobel porque fue el que descubrió, el
2:05:45que secuenció por primera vez la
2:05:48insulina, la proteína. La primera
2:05:49proteína secuenciada.
2:05:52Sí,
2:05:54es la mismo, ¿no?
2:06:19Bueno,
2:06:21tenemos un rato más. Les voy a contar
2:06:23algo que va a servir para la clase de
2:06:25mañana.
2:06:27Okay.
2:06:29¿Escucharon hablar de Crisper?
2:06:32Bueno, ahora le voy a explicar un poco
2:06:34cómo funciona.
2:06:36Así ya están preparados para la clase de
2:06:39mañana donde lo van a volver a ver. Ahí
2:06:41van a ver la historia de Crisper y van a
2:06:43ver el uso de Crisper directo en
2:06:45ratones. Pero yo les voy a dar una
2:06:47especie de introducción que les va a
2:06:49servir para no estar perdidos en la
2:06:51clase de mañana de Marcelo. Okay.
2:06:59Knockout. ¿Sabemos lo que es?
2:07:02¿Qué quiere decir hacer un knockout?
2:07:08¿Cómo?
2:07:11¿Cómo lo hago?
2:07:13Tengo que sacar al gen o destruir al gen
2:07:16o interrumpir el gen
2:07:21tengo que arruinar el ADN de alguna
2:07:23manera que no se pueda expresar.
2:07:26¿Okay?
2:07:30Clásicamente la técnica para hacer eso
2:07:33es producir una inserción de un ADN mío
2:07:38en el lugar del gen que quiero arruinar.
2:07:42¿Okay?
2:07:43Si no quiero que se exprese el gen,
2:07:45tiene que ser un gen que no se muera.
2:07:48No, no, si tengo [carraspeo] que
2:07:51destruir el gen X, lo que hago es
2:07:53insertar en el gen X un marcador de
2:07:56selección con un antibiótico para
2:07:58células eucariotas si estoy deletando en
2:08:01eucariota
2:08:03o si es en una bacteria un márcer de
2:08:05resistencia para un antibiótico
2:08:08de bacteria.
2:08:09Okay. Y la inserción la tengo que hacer
2:08:12de alguna manera. Tengo que estimular a
2:08:14que la célula
2:08:16cambie el ADN está ahí por el que yo
2:08:19quiero.
2:08:20Okay.
2:08:22Eso se hace por recombinación
2:08:27homóloga como la que hay en
2:08:31el los óvulos o los espermatozoides
2:08:33cuando hacen deliosis. Sí, ustedes salen
2:08:36del prossimo
2:08:38que se combina y vienen los genes de un
2:08:41cromosoma y se cruzan y siguen en el
2:08:43otro cromosoma. Eso es una mecanismo de
2:08:46recombinación homóloga natural. Las
2:08:48células vienen equipadas con la
2:08:50maquinaria de recombinación homólfa
2:08:54que la usan, por ejemplo, en la
2:08:55ameriosis. También tienen una maquinaria
2:08:58de reparación del ADN que es no
2:09:01homóloga. Si por alguna razón llega un
2:09:04rayo cósmico y destruye el ADN, que pasa
2:09:07todo el tiempo,
2:09:10hay una maquinaria en todas las células
2:09:12que repara el ADN dañado, porque es
2:09:15preferible repararlo aunque cometa un
2:09:17error a que quede roto y no me pueda
2:09:19dividir más. Si un cromosoma se parte en
2:09:22dos, la célula no se puede hacer dosis y
2:09:24se muere. Entonces, a veces es mejor
2:09:27repararlo, aunque se cometa un error en
2:09:30la reparación.
2:09:32Sí, que morirse. Entonces, hay dos
2:09:35caminos que la célula tiene. La
2:09:37recombinación homóloga que se usa para
2:09:40reparar daño al ADN utilizando una
2:09:42secuencia parecida que haya en el genoma
2:09:45y la reparo. Como es parecida, va a
2:09:47quedar igual como estaba antes. ¿Sí? o
2:09:51uso la maquinaria de reparación no
2:09:54homóloga, que no importa lo que es, lo
2:09:57arreglo como puedo, polimerizo un
2:09:58poquito ahí y lo jo. Esa es la
2:10:02maquinaria no homó. Las dos maquinarias
2:10:05están involucradas en las técnicas de
2:10:07hacer no.
2:10:11Vamos a ver entonces directamente cómo
2:10:14se hace ahora los noos
2:10:18utilizando crisp. ¿Alguna
2:10:24pregunta de lo que dije recién? Este
2:10:25tipo de introducción teórica.
2:10:28Bueno,
2:10:32supongamos que tenemos el gen este
2:10:34eucariota. ¿Cómo sé que es eucariota?
2:10:36Porque tiene
2:10:38porque tiene introni, sí, que lo
2:10:41queremos noquear.
2:10:43Lo queremos noquear para noquearlo en el
2:10:46método tradicional que no les estoy
2:10:48explicando ahora. Sí, necesito que haya
2:10:52recombinación homóloga en esta región de
2:10:54acá con mi cassette de el antibiótico.
2:10:59Le tengo que dar zonas de homología
2:11:03para que la maquinaria de reparación por
2:11:05recombinación homóloga en alguna célula
2:11:08agarre mi marcador y mi cassette de
2:11:10selección, mi marcador de selección y lo
2:11:13inserte ahí porque tenía regiones
2:11:15homólogas a un lado y al otro.
2:11:18Esa técnica era muy trabajosa y ahora
2:11:20queda reemplazada en células
2:11:24eucariotas, especialmente por la técnica
2:11:26de Cristo.
2:11:28Esto lo vamos a ver ahora en detalle.
2:11:31Lo que va a pasar es que la enzima
2:11:34Crisper
2:11:36es guiada por un ARN
2:11:40que funciona, por eso llama guía, a un
2:11:42determinado lugar del ADN que tiene
2:11:46homología.
2:11:47Sí, este ARN guía, ARN crisper va
2:11:52adentro de esta enzima y esta enzima va
2:11:54recorriendo el ADN por todos lados hasta
2:11:57que encuentra que este ARN tiene
2:11:59homología con esta región en el ADN.
2:12:05El ARN guía, lo vamos a ver bien ahora.
2:12:07El AR guía entonces tiene una región acá
2:12:11que la puedo poner yo, la que quiero yo,
2:12:14¿sí? Que tiene homología, por ejemplo,
2:12:16con este exón.
2:12:19¿Y qué hace Crisper? Una vez que se
2:12:22hibrida el ARN interno de esta
2:12:24ribonucleoproteína
2:12:27con el ADN blanco,
2:12:30produce un corte doble cadena del ADN
2:12:34donde
2:12:35se unió.
2:12:38Como se produzco un corte de doble
2:12:40cadena, la célula dice alerta, acá se
2:12:44fargió el ADN, tengo que arreglarlo
2:12:47de alguna manera lo tengo que arreglar,
2:12:49no me puedo quedar así como estoy. ¿Sí?
2:12:53Entonces, las ADN ligazas de la célula
2:12:58lo juntan, lo arreglan como pueden.
2:13:02Muchas veces generan inserciones o
2:13:05delesiones en ese ADN, lo cual produce
2:13:08cambios en el marco de lectura.
2:13:12Entonces, las células que sufrieron este
2:13:15proceso tienen muchas de ellas
2:13:18arruinados, en este caso, el exón dos.
2:13:22Si queda arruinado el exón 2, la
2:13:24proteína queda trunca, queda aruminada.
2:13:27Sí. Este proceso es un proceso que
2:13:30produce errores al azar. No estoy
2:13:33dirigiendo exacto la mutación que quiero
2:13:36poner,
2:13:38pero es muy efectivo.
2:13:40Ustedes le meten a una célula
2:13:43un
2:13:44plasma que codifica para la enzima CAS9,
2:13:50que es la enzima del método de Crisper,
2:13:52quiere decir cluster regulatory
2:13:55interspace short palindromic
2:13:59que lo van a ver mañana en detalle con
2:14:02Marcelo. Si la enzima K9 con la guía se
2:14:07dirigen al lugar que dice la vía corta
2:14:10doble cadena y la célula lo repara. La
2:14:13célula lo repara como puede, genera
2:14:16errores y entonces produzco la no saqué
2:14:22al gen, pero lo arruiné.
2:14:25tampoco garantiza completamente
2:14:28eh
2:14:32porque podría haber alternativo después
2:14:34de
2:14:36mañana.
2:14:37Acá la compañía dice, "Bueno, pero usted
2:14:39arruinó eh Alejandro elexón 2, pero la
2:14:42célula por ahí es viva y hace que esto
2:14:45este por ahí este exon alternativo y
2:14:48entonces no pasa nada y solo arruinó la
2:14:50versión que lleva la lexón s. ¿Correcto?
2:14:54Yo tengo que diseñar la guía para lo que
2:14:57quiero. Si considero que arruinando el
2:14:59dos arruino la proteína, bien. Y si no,
2:15:03tendría que ir al exón uno o tendría que
2:15:05ir a donde a mí me parezca. ¿Dónde voy?
2:15:08Donde quiero. ¿Por qué? Porque lo elijo
2:15:10casi donde quiero. Con la secuencia que
2:15:13ponga acá en la guía. Me armo la guía yo
2:15:16con la secuencia que quiero. CAS 9
2:15:19reconoce esta parte de acá y acá me deja
2:15:21poner lo que a mí me gustó.
2:15:27Una pregunta, CAS9 se produce en la
2:15:30célula.
2:15:32CAS9 es una enzima que viene de
2:15:34bacterias.
2:15:34Que viene de bacterias,
2:15:36sí. La encontraron en bacterias cuando
2:15:38entendieron lo que estaba haciendo. Fue
2:15:40una revolución en la biología.
2:15:42Hay que
2:15:45un plácido que lo
2:15:46hay que Claro, las células animales no
2:15:47tienen CAS. para que expresen cada uno y
2:15:50la tengo que poner en el plástmido de
2:15:52expresión de la célula.
2:15:54Y por otro lado,
2:15:56también para
2:15:57también tengo que darle un plásmido que
2:15:59exprese el ARN de la vida que lo expres
2:16:03una RN que no se traduce este ARN es ARN
2:16:07nada más. Okay. Que sirve en conjunto
2:16:11con K9 para ir y arruinar el ADN ahí.
2:16:16¿Entendieron?
2:16:19¿Entienden la gracia tecnológica
2:16:24de esto?
2:16:26A tiene como dos partes, una que se une
2:16:28a la encima y otra que
2:16:32el ARN se une al encima y juntos van y
2:16:35se unen al ADN y una vez que encuentran
2:16:37el blanco a Cristper el gas nu corta.
2:16:41¿Por qué las ADN de gazas corrigen mal o
2:16:48es el mecanismo de corrección que
2:16:50produce? Es así. Ah,
2:16:53porque no tiene molde. ¿Cómo no sabe
2:16:55cuál es la acción correcta?
2:16:57Está cortado y agarse lo que puede.
2:17:01Eso eso pasa incluso en caso de natural.
2:17:04Claro. Okay.
2:17:08AN.
2:17:09Esperamos. Voy a contar esto de vuelta.
2:17:10Si te queda la duda, me lo preguntas de
2:17:11vuelta. Aguanta. Te veo aguantando. Te
2:17:16estoy viendo. Aguantando.
2:17:20A ver,
2:17:22tenemos el ADN blanco al que queremos
2:17:25atacar.
2:17:27Lo acá lo dibujé desenrollado porque me
2:17:29conviene, no viene desenrollado.
2:17:40Viene CAS 9 con la guía. Se arman en la
2:17:45célula, tienen que ir al núcleo. Esto es
2:17:47una proteína
2:17:49bacteriana. Hay que agregarle una
2:17:51epiteca que lo vamos a ver en unas
2:17:52clases mías luego del parcial para que
2:17:55entre al núcleo de la célula.
2:18:00se arma en la célula,
2:18:06encuentra el blanco porque la guía tiene
2:18:08esta secuencia acá de 20 nucleótidos
2:18:12específicas
2:18:15contra una parte del genoma
2:18:18que yo elegí. Para eso tengo que conocer
2:18:20la secuencia blanco. No puedo arruinar
2:18:23un gen del cual no conozco la secuencia
2:18:25porque no puedo hacer la ira.
2:18:31Cuando KN9 se une, corta doble cadena,
2:18:34corta acá y corta acá,
2:18:37se despega
2:18:40y después hay dos opciones,
2:18:44¿okay? O bien las DNA ligazas de la
2:18:46célula ligan extremos cortados, pero
2:18:48cometen errores, inserciones o
2:18:50desesiones de unas bases. Podría ocurrir
2:18:53que no se cambie el marco de lectura.
2:18:55Entonces, por ahí se repare queda bien
2:18:56igual.
2:18:58y no produce ningún efecto en esa
2:18:59célula.
2:19:01Después tengo que fijarme qué pasó, ¿no?
2:19:09Y entonces me queda el gen mutado.
2:19:14Okay.
2:19:16Esta es la opción uno, que es la que
2:19:17venimos hablando hasta ahora,
2:19:21y me puede generar distintas clases de
2:19:23problemas dependiendo dónde lo hice,
2:19:26cuán inteligente fue fui en elegir el
2:19:28lugar a donde corta y qué sé yo. pueden
2:19:31pasar una variedad de cosas, pero si
2:19:33hice bien las cosas, estoy arruinando la
2:19:35proteína en la al principio de la
2:19:38proteína como para aruminarla bien.
2:19:43O o puede ser que yo le agregue le
2:19:49agregue ADN
2:19:52que yo le estoy dando, que tiene a los
2:19:57la misma secuencia idéntica a un lado y
2:20:00al otro sitio de corte.
2:20:04Sí, CAS9 reconoce acá, CAS 9 reconoce
2:20:07acá y yo le puse un ADN doble cadena que
2:20:10se lo transpóo a las células.
2:20:13Sí,
2:20:15directamente lineal que tiene secuencia
2:20:19esta idéntica a esta, secuencia esta
2:20:21idéntica a esta. Y acá tiene algo extra
2:20:24que yo le quiero agregar.
2:20:28Por ejemplo, una proteína verde
2:20:29fluorescente
2:20:31en marco de lectura con el exón que
2:20:33estaba cortando,
2:20:35bien hecho para que me quede la proteína
2:20:36fluorescente ahí metida
2:20:39o un gen de selección y un antibiótico
2:20:43en un inserto un cassette con un gen
2:20:46entero que tiene resistencia a un
2:20:47antibiótico. Entonces ahí completamente
2:20:49arruino todo lo que yo quiera, pero acá
2:20:53lo que se produce es recombinación
2:20:55homóloga. Acá la maquinaria que opera es
2:20:58la otra maquinaria, la maquinaria
2:21:00parecida a la de las mediosis,
2:21:05donde la cava dice, "Acá tengo con qué
2:21:06reparar. Esto es igual a esto, lo junto.
2:21:09Y esto es igual a esto, lo junto." Y el
2:21:12resultado, ¿cuál es?
2:21:14que se me insertó lo que yo quiero en
2:21:18donde yo quise.
2:21:22Esto puede ser en la mitad de un fen,
2:21:24puede ser en un incrón, puede ser donde
2:21:26yo quiera.
2:21:31Sí, esto con esto puedo hacer knockouts
2:21:34porque si le inserto acá una proteína
2:21:36con un gen de selección, obviamente la
2:21:39proteína que estaba codificada en estos
2:21:40exones va a quedar completamente
2:21:42arruinada porque se le va a haber metido
2:21:44otra proteína dentro.
2:21:47¿Sí? O puedo poner lo que quiera. Puedo
2:21:49poner un terminador de la transcripción
2:21:51acá, un sitio de corte y po deación
2:21:55o puedo arreglar un gen fallado de una
2:21:58persona o de un animal.
2:22:01Si estaba mutado este gen y la persona
2:22:04tenía una enfermedad porque estaba
2:22:06mutado el gen, al cortar y cambiarlo por
2:22:09esto, puedo reparar [tos]
2:22:12una mutación con la que había nacido la
2:22:14persona.
2:22:21¿Okay? Esto es lo que se llama edición
2:22:24génica.
2:22:28Y esta es la base y la promesa. Ya está
2:22:31cada vez más aparecen eh métodos que
2:22:35utilizan esto con funciones
2:22:37terapéuticas. Vamos a ver qué es lo que
2:22:39explica Marcelo y si no podemos abundar
2:22:41un poco más todavía en la clase del
2:22:43martes.
2:22:45¿Okay?
2:22:47Entonces esto me permite ¿Por qué?
2:22:49Porque estos sitios de de homología de
2:22:51acá no tienen por qué ser justo justo
2:22:54con el borde. Pueden ser un poquito para
2:22:56acá y un poquito para acá. Y si hay
2:22:57algunas mutaciones, puedo corregirla con
2:23:00ADN que sea correcto. Esta región
2:23:02violeta que puse acá, esto violeta azul.
2:23:06azul puede ser la versión normal y
2:23:10reemplaza al la versión mutada que tenía
2:23:13la persona.
2:23:19Que lo reemplaza la maquinaria, la
2:23:21recombinación homóloga de la célula,
2:23:25porque yo le di con qué. Si yo no le doy
2:23:28con qué, la célula repara como puede.
2:23:30Era la opción uno.
2:23:33En la opción uno
2:23:36no le doy nada a la célula. Entonces si
2:23:38corto la célula lo repara como puede.
2:23:43Ahora, si yo a la célula le doy con qué
2:23:45reparar,
2:23:48existe la probabilidad, no 100%, de que
2:23:52utilice lo que yo le di por
2:23:54recombinación homóloga lo inserte.
2:23:57Podría pasar que en este caso ocurran
2:23:59las dos cosas. En algunas células usó lo
2:24:01que yo le di en otras células no usó lo
2:24:03que yo después tengo que fijarme en cuál
2:24:07lo que yo quiero.
2:24:11No es otra maquinaria,
2:24:13son otras proteínas que no estamos
2:24:15viendo.
2:24:16Es una maquinaria de reparación muy
2:24:18sofisticada.
2:24:20Dice cómo es cualquier cosa es muy
2:24:22sofisticada, ¿no? Ya vieron la
2:24:24replicación del ADN que explicó Diego
2:24:25Premman y lo complicado que es.
2:24:28Okay.
2:24:30Eh, para que encima sea también tiene
2:24:33que tener el RN guía, o sea,
2:24:35indispensable el ARN guía. Ah, o sea,
2:24:37por eso
2:24:38sinía nu puede hacer nada,
2:24:42¿no? O sea, por eso una enzima de
2:24:44restricción, ¿no?
2:24:45No es una enzima de restricción.
2:24:47Claro,
2:24:48es parecido en el sentido de que corta
2:24:50doble cadenas.
2:24:52Es una endonucleasa se llaman. Las
2:24:55enzimas que cortan doble cadenas se
2:24:57llaman endonucleasas de ADN.
2:25:01es laicación se hace tejidos
2:25:03específicos.
2:25:06Esta técnica se puede hacer como usted
2:25:09pueda, utilizando la imaginación y la
2:25:13ingeniería genética y e lo que usted
2:25:16pueda lograr hacer. Se va avanzando cada
2:25:19vez más en esa técnica de distintas
2:25:21maneras. Se puede hacer en cultivo, en
2:25:24el laboratorio. Sí. Probablemente
2:25:26Alejandra en su laboratorio con las
2:25:28células madre utiliza Crisper.
2:25:32Sí, yo utilizo Crisper en las levaduras,
2:25:34aunque en las levaduras hay muchas otras
2:25:36técnicas que en general no hace falta
2:25:39usar crisper.
2:25:41Se puede usar crisper directamente con
2:25:43linfocitos obtenidos de un paciente en
2:25:46el laboratorio y después uno levuelve
2:25:48los linfocitos
2:25:50pacientes por su ratón. Sí. tratados,
2:25:53modificados genéticamente con esta
2:25:55técnica, ¿sí? se lo puede infectar o se
2:25:58puede infectar al animal con virus que
2:26:02no producen una enfermedad, pero que sí
2:26:04se desparraman por distintas partes del
2:26:06cuerpo, llevando la enzima CAS9 y una
2:26:10guía en las células en las que entren
2:26:12van a modificar el genom [carraspeo]
2:26:16puede dar miedo y es una promesa también
2:26:18médica terapéutica importante.

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