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T15 IBMC 2025 2c IngenieriaGenetica1 Alejandro Colman Lerner (incluye pizarron) — Transcript

by Alejandro Colman-Lerner · 16,197 words · 2,836 segments · language en · Watch on YouTube

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0:00finales de los seminarios que son
0:01problemas que engloban todos los lo que
0:04aprendieron y utilizan estas técnicas.
0:07¿Okay?
0:11Bueno, esta slide es solo para recordar
0:15que vamos a hablar sobre cómo vamos a
0:18trabajar con genomas, o bien de
0:21procariotas o bien de eucariotas.
0:24La principal diferencia que nos interesa
0:26hoy es que los procariotas tienen genes
0:30que no están interrumpidos y que el
0:32tamaño de el gen de la parte transcrpta
0:37es igual al mensajero que se forma sin
0:40procesamiento. Y en el caso de los
0:42eucariotas, como ustedes ya saben, luego
0:44de las clases de Alberto,
0:46el ADN, el gen es mucho más grande que
0:50el mensajero maduro. entre medio hay que
0:52sacarle todas esas secuencias
0:54intervinientes, llamamos sinones por el
0:57mecanismo de splicing, aprendieron del
1:00el splicing alternativo, etcétera. Y acá
1:03tiene el mensajero que se exporta del
1:04núcleo, se traduce a proteína en el
1:09citoplasma. ¿Okay? Y también vieron la
1:11diferencia de los promotores. Promotor
1:13bacteriano funciona en bacterias y es
1:16específico de la especie. Un promotor
1:19procariótico en funciona en ecoli si es
1:24un promotor de ecoli. Si voy a agarrar
1:27el promotor de ecoli, lo voy a poner en
1:29otra bacteria no relacionada, no va a
1:31andar tampoco. Okay. Las bacterias entre
1:34sí son muy diferentes. No alcanza con
1:35que sea procariótico para que funcione
1:39en una determinada bacteria. tiene que
1:40ser de esa bacteria en general. En esta
1:42materia vamos a aceptar que digan
1:44procariótico cuando vamos a transformar,
1:46por ejemplo, bacterias como ecoli. Vamos
1:48a entender que ustedes quieren decir que
1:50es un promotor de ecoli.
1:54En el cambio, en cambio, los promotores
1:55eucariotas son completamente diferentes.
1:57Sí, ya los vieron. tienen la tata box,
2:00tienen la polimerasa que se une, bueno,
2:02etcétera. Bueno, eso ahí vamos a tener
2:04en cuenta cuando hagamos algunas cosas
2:06más bien más que hoy el la clase que
2:09viene. Bueno, entonces,
2:14ADN recombinante. ¿Qué quiere decir? Que
2:17vamos a recombinar ADN.
2:20¿Qué quiere decir que vamos a combinar
2:23ADN que originalmente estaba separado?
2:27Lo vamos a poner en una organización que
2:29no existía en la naturaleza.
2:32Sí, tenemos que poder sacar un ADN de
2:35interés o generar un ADN de interés por
2:37un lado y ponerlo en otro lado y poder
2:40amplificarlo y tenerlo. Ustedes algunas
2:43cosas de esas ya saben, acá lo vamos a
2:45poner todos juntos.
2:47Entonces, lo que vamos a a ver hoy es
2:49cómo hacemos para agarrar un fragmento,
2:52cómo vamos a generar ese fragmento al
2:55que vamos a llamar inserto, porque lo
2:57voy a insertar en un vector.
3:02Ese vector es un plásmido que fue
3:06cortado de alguna manera o generado para
3:10que poder pegarle este acá dentro y
3:13formar una única molécula circular. Sí.
3:18Que va a tener va a ser nuestro plásmido
3:20con un inserto.
3:25¿Está bien?
3:25Sí.
3:29Okay.
3:32Para que el plásmido este antes de
3:35ponerle el inserto o después de ponerle
3:37el inserto sirva para algo, se tiene que
3:40poder replicar en una bacteria
3:43para poder crecerlo, porque si no lo
3:45puedo tener en un tubo y nada más.
3:49Entonces nos lleva al concepto de
3:52replicón.
3:54Un replicón es una molécula que tiene la
3:57capacidad de replicarse sola. Sola
4:00quiere decir que tiene los elementos
4:01necesarios para que la célula que lo
4:04reciba lo pueda replicar.
4:07Puede ser un ADN circular como los
4:09plásmidos o como el cromosoma bacteriano
4:13o puede ser un cromosoma lineal como los
4:15cromosomas
4:17de los eh de las células eucariotas. Sí.
4:23Podrías repetir, es una tira de ADN que
4:26es una molécula de ADN que tiene los
4:28elementos necesarios para replicarse en
4:30un determinado lugar. Para las bacterias
4:33tiene que ser un ADN circular
4:36que tenga un origen de replicación, un
4:39lugar a donde la DNA polimerasa puede
4:42ensamblarse y empezar a replicar para un
4:45lado y para el otro como como lo explicó
4:48Alberto, ¿se acuerdan? la cadena
4:50continua, la los fragmentos de Okasaki.
4:53Okay. Entonces, tiene un ori que es el
4:56origen de replicación. Con eso ya es un
4:59replicón. Ahora, para que nos sirva a
5:01nosotros tenemos que tiene que tener
5:02algo que nos permita
5:06que lo que hagamos que la bacteria lo
5:09tenga que tener y lo tenga que mantener.
5:11¿Qué era eso?
5:14anticilino, o sea, una resistencia o
5:18eso es un antibiótico.
5:20¿Qué tiene que tener el entonces el
5:21plásmido para que yo pueda usar el
5:23antibiótico?
5:23Una cualidad
5:25una cualidad que le dé como algo un
5:28beneficio.
5:29Un beneficio. Si yo le quiero poner
5:30ampicilina, ¿qué tiene que tener el
5:32plásmido?
5:33Tiene que tener un gen que hace que la
5:35ampicilina no sea efectiva. Es un gen
5:38que destruye a la ampicilina. Sí. En el
5:42caso de la ampicilina, el gen se llama
5:43betalactamasa, no nos importa el nombre
5:45del gen, es el gen de resistencia
5:47ampicilina, que muchas veces se escribe
5:49AMP R.
5:52Bien, entonces
5:55como les dije antes, la bacteria tiene
5:56dos tipos de replicones. El ADN
5:58cromosómico, que tiene alrededor de 6
6:00millones de pares de bases en ecoli,
6:03¿okay? Y los plámidos, que pueden ser
6:05chiquitos, puede ser de 10 kbas bases o
6:08incluso más chicos, hasta 100 kbases.
6:10Son
6:12como cromosomitas chiquititos que se
6:14pueden replicar y que la bacteria los
6:16mantiene porque le sirve para algo.
6:21Okay.
6:22Antes de que sigas, ¿puedes repetir
6:23rápidamente la definición de replicón
6:25que
6:26alguien puede decir qué es un replicón
6:28que no sea yo?
6:31puede replicar
6:33una molécula de ADN que se puede
6:35replicar sola,
6:37¿okay? Que tiene un origen de
6:38replicación y aparte agrego yo, le
6:41agregamos un gen de resistencia para
6:43poder en el laboratorio forzar a la
6:46bacterias a mantenerlo.
6:49Bien, acá les muestro tres formas de
6:52agregar, de introducir ADN a células que
6:57tienen tres nombres distintos. Sí. y se
7:00refieren a cosas parecidas pero
7:02distintas. Como saben, parte de lo que
7:05hacemos en IBMC es enseñarles la jerga.
7:07Mucho de lo que tienen que aprender es
7:09qué quieren decir las palabras, ¿okay? O
7:11cómo se llaman las cosas. por ejemplo,
7:13splicing por ahí no sabía lo que era y
7:15ahora saben
7:17esto que dice acá, transfección de ADN
7:21es el procedimiento de agregar ADN a
7:25células eucariotas de organismos
7:27multicelulares,
7:29es decir, células en cultivo nuestras.
7:32Por ejemplo, agarramos fibroblastos, los
7:34cultivamos y si le queremos poner un
7:36plásmido que tenga un gen para alguna
7:39cosa que se nos ocurra, lo que estamos
7:41haciendo es un procedimiento que se
7:43llama transpción,
7:47que hay que agregarle distintas cosas a
7:49las células para que entre en el ADN.
7:52Okay. Normalmente las células eucariotas
7:54esas no están naturalmente no no agarran
7:58ADN, no es como las bacterias que
7:59naturalmente incorporan ADN por año como
8:02parte de su vida.
8:04Pero los investigadores descubrieron
8:07formas de hacer que las células de
8:09incluso de eucariotas eh multicelulares
8:12puedan absorber el ADN extracelular.
8:16Otra forma más directa es la mitocción
8:18de ADN. Lo van a ver en la clase tres de
8:21ingeniería genética la semana que viene
8:22o cuatro con Marcelo Rubinstein que les
8:25va a explicar cómo se hacen animales
8:27transgénicos.
8:31Levantó la mano a alguien.
8:34Bien. Okay. Microinyección de ADN. Vamos
8:38a verlo. Eso entonces para hacer
8:40animales transgénicos.
8:42Otra forma es transferencia nuclear. Eso
8:45es lo que yo les conté a los que fueron
8:46a la clase pública,
8:48cómo se hizo el clonado de la oveja
8:51Doli. Lo que se hizo fue sacar un núcleo
8:53de una célula epitelial de la mama de la
8:56oveja, de una oveja y se reemplazó el
8:59núcleo de un oocito con el núcleo que
9:01venía en la pipeta. Y entonces salió una
9:04oveja que era un clon de la oveja que
9:06donó su núcleo.
9:09Eso se llama transferencia nuclear.
9:13Estas tres
9:15se usan para eucariotas.
9:18Ah, mira cómo se mueve mi mouse.
9:24Okay.
9:26Ahora, para bacterias, como dijimos, la
9:29palabra que se usa es la transformación.
9:33Cuando le agregamos plásmidos a las
9:35bacterias, la palabra técnica es
9:38transformación. ¿Por qué se usan
9:41palabras distintas? ¿Por qué no se usa
9:43transformación para lo que en eucariotas
9:45llamamos transfección?
9:47Bueno, porque la palabra transformación
9:50para células de organismos de mamíferos,
9:53por ejemplo, ya estaba tomada. La
9:55transformación es el proceso por el cual
9:58las células pasan de ser normales a ser
10:00cancerosas.
10:02Eso lo vamos a ver en una de las últimas
10:04clases en la materia con Omomar. ¿Okay?
10:07Entonces, el proceso de transformación
10:08ya estaba, ya se usaba la palabra
10:11transformación para eso, ¿no? Entonces,
10:13usaron para la palabra, para agregar ADN
10:16en células la palabra transcción, pero
10:19conceptualmente es lo mismo. Los
10:21microorganismos eucariotas como las
10:24levaduras cuando se les agrega ADN
10:26también se usa la palabra
10:27transformación. Es decir, las levaduras
10:30hay que transformarlas, no
10:31transfectarlas. es una palabra de en
10:34cómo nos pusimos de acuerdo en cómo
10:35hablarlo, ¿no? Bueno, entonces el
10:38proceso de transformación consiste, ya
10:40lo hicieron en clase en el TP,
10:43bien, le agregamos el plámido a la
10:44bacteria y la bacteria crece porque
10:46tiene la resistencia provista por el
10:48plásmido. Todas las otras bacterias que
10:50fueron eh sufrieron el proceso de
10:53transformación, pero no recibieron el
10:55plásmido, se mueren.
10:59Preguntas hasta acá.
11:02Bien. Okay. Bien. Ahora vamos a ver,
11:07vamos a empezar realmente con lo que es
11:10cómo se hace la ingeniería genética, es
11:13decir, cómo agarr cómo generamos un
11:15inserto y cómo lo metemos en un
11:17plástico.
11:19Y para eso tenemos que introducir a las
11:22enzimas de restricción. ¿Ustedes
11:25conocen, escucharon hablar de las
11:26enzimas de restricción?
11:28¿Qué son? ¿Y
11:34dónde lo vieron?
11:38¿En dónde lo estudiaron? Digo,
11:40en el TP de la materia.
11:43Sí.
11:44Bueno, entonces para muchos entonces
11:46esto va a ser una parte de repaso.
11:48Las mencionaron que cortaban, pero no
11:50mencion.
11:51¿Okay? ¿Qué son las enzimas de
11:52restricción? Son enzimas que las
11:56bacterias
11:57hacen. Sí. para defenderse de virus.
12:05¿Y qué hacen esas enzimas? Son proteínas
12:08diméricas, ¿sí?, que reconocen
12:11secuencias de ADN doble cadena
12:13específicas y las cortan.
12:22Muchas veces esas secuencias muchas
12:24veces son palindrómicas.
12:27¿Qué hace ese mouse ahí moviéndose con
12:31Bueno,
12:34por ejemplo, la enzima eco R1?
12:39Eco quiere decir que viene deia
12:42coli.
12:44Así es como se nombran las enzimas.
12:46Vamos a verlo. Esto
12:49habría que apagarlo el mouse
12:58ahí se quedó
13:01bien. Eco R1 corta la secuencia G A TC
13:08en la cadena de arriba y es la misma
13:12secuencia en la cadena de abajo. G A TC.
13:17Sí, reconoce un exámeno, una secuencia
13:20de seis nucleótidos palindrómica.
13:24Palindrómica quiere decir que se lee de
13:26la cadena de arriba igual igual que de
13:29la cadena de abajo.
13:32¿Okay? Entonces, esto va para allá o
13:33para allá es lo mismo. La doy vuelta es
13:35igual y la encima de CR1 la corta
13:41entre la G y la A de la cadena de arriba
13:43y entre la G y la A de la cadena de
13:45abajo.
13:48¿Okay? Y cuando la corta, ¿qué pasa? Se
13:50separa el ADN.
13:53Se separa y cómo queda queda con una
13:56colita
13:57que sobresale de una cadena y de la
14:00otra. Sí, queda con un CCO prima
14:04que sobresale, cinco prima sobresaliente
14:08o cinco prima protruyente se dice.
14:12Okay. Queda con el fosfato CCO prima ahí
14:16colgado y esta queda con su fosfato.
14:18Estas son, ¿ven que son iguales? A ATT y
14:20acá AATT.
14:23¿Sí?
14:24¿Qué característica tienen estos dos
14:26extremos aparte de ser protuyentes?
14:29que es obvia porque está escrito
14:31que son iguales.
14:32Son iguales. ¿Qué quiere decir eso? Que
14:36se pueden volver a pegar como estaban
14:39antes. Esta a híbrida con esta t, esta a
14:42con esta t, esta t con esta a esta T con
14:44esta A. Es decir, que esto se puede
14:47pegar y despegar. Como está cortada la
14:52unión fosfodiéster, que es lo único que
14:54hizo Eco R1, no se va a quedar unida
14:57porque solo queda unida por cuántos
14:59puentes de hidrógeno?
15:03¿Cuántos puentes de hidrógeno
15:04estabilizan esta TTAA con esta AATT?
15:12Cada A con una T son dos puentes de
15:14hidrógeno, o sea, que hay ocho puentes
15:16de hidrógeno. Eso se pega un cachitito y
15:20se despega. Se pega un poquitito y se
15:21despega. Sí, básicamente están como
15:24sueltitos, pero cada tanto se juntan.
15:29Esa es Eco R1 que deja extremos
15:32pegajosos
15:34protruyentes.
15:36Son pegajosos por lo que acabo de decir
15:37recién, o cohesivos.
15:41Todo quiere decir lo mismo. Si son
15:43cohesivos, quiere decir que son
15:44pegajosos y eso es porque son protentes.
15:49¿Okay?
15:51¿Qué quiere decir que sean pegajos? que
15:53tienen ocho puentes de hidrógeno que los
15:55mantienen como pegoteados cada tanto.
15:59Eso solo
16:01Eco R1 reconoce todas las enzimas que
16:05dejan extremos
16:07sobresalientes, extremos protruyentes.
16:11Por ejemplo, PST1
16:13corta esta secuencia CTC GAG,
16:18que la otra cadena obviamente también es
16:20CTCGAG.
16:22Pero corta como al revés. Esta corta
16:25dejando un extremo cinco prima
16:28sobresaliente y esta corta del otro lado
16:30y deja un extremo tres primas
16:32sobresaliente.
16:34Corta de un lado o del otro. Cada enzima
16:38es cada enzima.
16:39¿Cómo se llama eso?
16:40PS1.
16:43Hay cientos de enzimas que ahora desde
16:47hace tiempo las las empresas que venden
16:51cosas para los laboratorios las
16:52preparan, las purifican y te las venden.
16:55Cada enzima, como cualquier enzima,
16:59tiene su buffer óptimo y su temperatura
17:02óptima.
17:03Como en la mayoría se sacaron de enzimas
17:05de bacterias que crecen a 37 gr, más o
17:08menos, su temperatura óptima suele ser
17:1137º. Así que en los laboratorios de
17:13biología molecular la gente tiene un
17:16baño de agua a 37º para hacer los cortes
17:19con las enzimas de respición.
17:22Okay.
17:25PC1 deja extremos tres prima
17:29protruyentes que obviamente entre sí son
17:32pegajosos. Lo mismo que se cortó se
17:34puede volver a pegotear. Lo que pasa es
17:37que como la unióner está rota, no se van
17:39a quedar pegados.
17:42Okay.
17:45No entendí cuándo cuándo tipo se puede
17:48pegar
17:50a pegar.
17:54Luego de que una enzima de restricción
17:56corta y deja extremos protentes, se
17:59pueden volver a pegar. Lo mismo que se
18:01cortó, se puede volver a unir. Lo que
18:03pasa es que la unión Fodiéster no se va
18:05a formar sola. Entonces, se quedan un
18:07ratito pegados y se despegan. Se quedan
18:09un segundito pegados y se despegan. Sí,
18:12si uno se los imagina dentro de un tubo,
18:15los fragmentos van a estar la mayor
18:17parte del tiempo sueltos, pero cada
18:19tanto se pueden tocar. Okay,
18:23eso está claro.
18:24Sí.
18:26Bueno, y hay algunas enzimas que cortan
18:29derecho y no dejan ningún extremo
18:31protruyentes. Acá tienen el ejemplo de
18:32la enzima SMA1
18:35SMA 1. Esa reconoce la secuencia CCC GG.
18:41Corta entre medio justo. Entonces no
18:44quedan estemos pegajosos.
18:48La cortó. cortó el puente, el la unión
18:52fofofodiéster de arriba y la unión
18:53fofofodiéter de abajo se separaron. Esas
18:56no se quedan pegaditas un ratito porque
18:59no tienen nada que las junte, no hay
19:00ningún puente de hidrógeno.
19:03Okay.
19:06Entonces, las del extremos romos no se
19:09pueden volver a despegar porque no piden
19:11para enganchar.
19:11Ahora lo vamos a ver. Se puede, pero es
19:14más difícil. Ahora bien, ahora vamos a
19:16ver
19:17cómo es que reconoce a la hebra si está
19:20unida.
19:21Si está unida.
19:22O sea, las hebras no se separan para que
19:25pase.
19:26No, no las reconoce de adentro, las
19:28reconoce de afuera. Agarra la doble
19:30cadena,
19:32se pega y corta.
19:35Okay. Fíjense que corta los dos. Las
19:38bases no están mirando para adentro.
19:40Sí. No, no es las bases no están
19:43ocultas. ¿Cómo lo por qué no me
19:45preguntas lo mismo para que o cómo los
19:47factores de transcripción reconocen la
19:49secuencia de la infancia o cómo la
19:50polimerasa reconoce el promotor esa sin
19:53abrirlo? No, no, no lo abren nunca lo
19:56abren cuando transcribe la RNA
19:58polimeraza, pero si no no lo abren.
20:00Todos los factores de transcripción, la
20:02DNA, la RDNA polimerasa, todo lo que
20:05vimos de las uniones de proteínas al
20:08ADN, leen las desde afuera, no tienen
20:12que abrirlas.
20:12¿Y dónde se paran afuera? afuera
20:16en general en el surco mayor.
20:22Okay. Entonces, las enzimas de
20:24restricción, algunas dejan extremos
20:26protruyentes, algunos cinco prima,
20:28algunos tres prima y otras enzimas
20:30cortan y dirijan extremos romos se dice,
20:35o en inglés blant. blank ends. Okay.
20:47Fíjense que de acá uno podría ya darse
20:50cuenta de que tienen que ser diméricas
20:53las enzimas.
20:55Un monómero reconoce la cadena de arriba
20:57y el otro monómetro dado vuelta reconoce
20:59la de abajo y cada uno corta en un
21:02sitio. El un Eco R1, un monómero corta
21:05acá y el otro monómetro corta abajo del
21:08otro lado.
21:10Sí,
21:20acá está de vuelta lo mismo. Esta slide
21:23la quiero usar para decirles que las
21:25enzimas de restricción tienen una
21:27diferencia fundamental con los factores
21:29de transcripción. Los factores de
21:31transcripción que vieron con Alberto y
21:33que vieron conmigo también en bacterias,
21:35los los represores y las polimeras
21:39reconocen secuencias con senso, ¿se
21:41acuerdan? Las secuencias consenso quiere
21:43decir que reconocen una variedad de
21:46secuencias, algunas con más afinidad y
21:48otras con menos afinidad. Algunas son
21:50más comunes que otras.
21:53Pero pueden unirse a variantes. Las
21:56enzimas de restricción, no. Las enzimas
21:58de restricción reconocen una secuencia y
22:02un cambio ya no la reconocemos.
22:06Okay. No hay lugar para consenso y es
22:09super estrictas.
22:19Ahora yo les conté que las enzimas,
22:23estos extremos tienen la posibilidad de
22:26formar esos ocho puentes de hidrógeno
22:29por un ratito. Si agrego la enzima
22:31ligaza, que la vieron cuando vieron los
22:34nicks, ¿se acuerdan? Sí. de los
22:37fragmentos de
22:40y ATP
22:43en el tubo de ensayo y el buffer de la
22:46ligaza. ¿Qué va a pasar? Se va a volver
22:48a formar la unión fofodiestra
22:51y se va a restaurar el sitio Eco R1.
22:58Eso que entienden o sea, lo puedo cortar
23:01y ligar.
23:03Ahora tengo que sacarla encima de
23:05restricción porque si no la saco ligo y
23:09se corta. Ligo y se corta. Correcto.
23:16¿Cuál? ¿Qué cosa?
23:20Liga y se costa.
23:23Ejo R1 corta y deja un extremo
23:25protuyente.
23:27Esas cuatro bases de acá se pueden
23:30hibridar con esas otras cuatro bases
23:33transitoriamente.
23:35Si justo yo agregué la enzima ligaza, la
23:38enzima ligaza lo va a agarrar en ese
23:40momento transitorio y va a unir formar
23:42la unión fafodirecta.
23:44Y entonces, ¿qué va a pasar? Ya va a
23:46formarse de vuelta esto.
23:49Es decir, esto es reversible.
23:52Pero por otro camino, no, no es que
23:55tengo que usar otra enzima que haga la
23:57reacción para el otro lado y esa enzima
24:00gasta energía. En cambio, esta no gasta
24:02energía.
24:04Corre.
24:07Si yo agarro un genoma
24:11y le lo incubo con Eco R1, ¿qué va a
24:13pasar?
24:16Se va a cortar todo por todos lados.
24:18Cada cada canto van a aparecer esa
24:20secuencia GA TTC se va a
24:24entonces digerir,
24:26no tiene un límite de cuántas veces
24:27cortan donde ve la secuencia la corta
24:29constantemente.
24:30No se cansa,
24:32¿no? Como todas las proteínas se pueden
24:35arruinar, tienen una vida media. Si uno
24:38pone a digerir y por ahí mañana si usas
24:41la enzima ya no te anda más. Por eso se
24:43guardan en el freezer.
24:54Okay. Solo se pueden ligar fragmentos
24:58que sean complementarios.
25:00O sea, solo podés ligar algo que tiene
25:03un extremo AATC TT con algo que tenga
25:06extremo también. AATT.
25:10Okay, no puedo ligar esto con esto
25:13porque esto tiene sobresaliente AATT y
25:16esto tiene sobresaliente A GCT y aparte
25:19estos tres primas, o sea, está
25:21totalmente malo. Esto no sirve para
25:22esto, tiene que ser justo. Solo puedo
25:25ligar los que tengan extremos
25:30y complementarios. Complementarios entre
25:32sí, de acuerdo a las reglas deon y cric.
25:36Okay.
25:39Comentarios.
25:42Bueno, cohesivos quiere decir que van a
25:44poder unirse si encuentran con alguien
25:45complementario y obviamente tienen que
25:47ser complementario si los quiero ligar.
25:50Okay. Algo que corté con una encima, no
25:53lo puedo ligar con algo que corté con
25:55otra encima a menos que las dos enzimas
25:58dejen el mismo extremo.
26:01Existen enzimas que reconocen secuencias
26:04que en los bordes son iguales, eh,
26:06distintas, pero en el medio son iguales
26:08y cuando cortan dejan el mismo extremo.
26:11No nos importa demasiado el detalle
26:12desde ahora. Okay. Lo importante que hay
26:16que saber es que solo puedo ligar cosas
26:19que tengan extremos complementarios.
26:28Okay. Y los extremos, las enzimas que
26:31dejan extremos romos, ¿las puedo ligar?
26:36No tienen extremos complementarios.
26:38Sios se encuentran.
26:40Si justo se encuentran, sí.
26:44Si justos se encuentran y la ligaza los
26:46agarra en el momento en que justo se
26:48tocaron, los liga. Ahora, ¿va a ser más
26:51fácil o más difícil que en el caso
26:52anterior?
26:54Mucho más difícil. Entonces, ¿qué tengo
26:56que hacer? Poner mucho más ADN de para
26:59que se esfuercen esas interacciones.
27:02¿Okay? Y por ahí tengo que dejarlo
27:03incubando más tiempo para que pase
27:05algunas veces. Sí, si pasa eso, se van
27:09a, por ejemplo, si lo estaba lo que
27:11estaba haciendo es agregando un inserto
27:12en un plásmido, se va a sellar el
27:14plásmido y lo voy a poder transformar en
27:16bacterias. Aunque haya muy poquitos
27:19eventos en el que pase esto, solo esos
27:22van a poder conferirle a la bacteria, la
27:25gen de resistencia, al antibiótico y van
27:27a formar una colonia. Entonces, puedo
27:29detectar eventos que son poco frecuentes
27:32también de esta manera.
27:34¿Está bien? ¿Alguna
27:37pregunta?
27:45Okay.
27:48Y otra cosa, los extremos romos solo se
27:51pueden ligar con extremos romos. Acá
27:54seguro que no importa qué encima los
27:56generó, lo único que importa es que sean
27:58romos.
28:00¿Okay? Hay varias enzimas que cortan con
28:02extremos romos. Puedo juntar pedazos de
28:04esas, aunque como dijimos recién, es
28:06algo bastante más difícil de lograr.
28:12Bien,
28:15como dijimos recién, es más difícil de
28:17religar es religar fragmentos romos que
28:20extremos protruyentes.
28:22Una pregunta, entonces los plasmos
28:24siempre se cortan con extremo romo o
28:27en general nunca usas extremo romo
28:29porque es más difícil.
28:31Usas extremos protentes
28:33y que te garantizan aparte la
28:35especificidad.
28:36Claro. Estas enzimas están naturalmente
28:40o se suelen usar más que nada.
28:44Eh, no sé como la pregunta tuya es, ¿las
28:47dos cosas son verdades? Están
28:49naturalmente, son naturales, fueron
28:52extraídas de distintas especies y aparte
28:55las produce una empresa para el uso del
28:57laboratorio. Las que usamos en el
28:58laboratorio se la compramos a la
29:00empresa, no la purificamos nosotros.
29:02¿Y cómo sabes qué corte te va a hacer?
29:04Es dependiendo la enzima. Es que está
29:07encima hace lo que hace. Hay que probar.
29:09Ah, okay. O sea, claro, si te hace un
29:12corte romo o cohesivo es dependiendo de
29:14la enzima.
29:15Todo depende de la enzima, tal cual.
29:18Pero, ¿cómo lo regula? No puede cortar
29:19su propio ADN.
29:21La bacteria
29:22estaba esperando que alguien dijera eso.
29:26¿Cómo hace Ecoli para no ser cortada
29:30todo su genoma por Eco R1?
29:34Porque no hay
29:35no lo dije.
29:37No, pero no reconoce una secuencia.
29:39Reconoce una secuencia G a A TTC que es
29:42superabundante en el genoma de coli.
29:48Eh,
29:48estabaado.
29:49Exacto. Toda enzima que se preci o toda
29:53bacteria que quiera tener una enzma de
29:55restricción está obligada a tener una
29:58enzima modificadora de los sitios de
30:01restricción propios.
30:05La metila le es una enzima que le agrega
30:08un metilo a alguna de las secuencias,
30:13alguna de la secuencia, algo, creo que
30:15no sé si a la C o a la T, alguna de las
30:17bases, la la metilaza reconoce el mismo
30:21sitio que la enzima de restricción, pero
30:23en vez de cortarla le agrega un metilo.
30:26Entonces, la enzima de restricción ya no
30:28la reconoce y no la corta. Así se
30:30protege el propio genoma de las enzimas
30:33de restricción que produce.
30:36Es decir, que con cada enzima de
30:37restricción viene acompañada una otra
30:40enzima que modifica las
30:42Exactamente. Una modificadora. Una
30:45enzima modificadora que nosotros en el
30:46laboratorio las podemos comprar, pero
30:49casi no se usan. Tienen muy pocos usos
30:53porque lo usamos nosotros en el
30:54laboratorio para cortar y pegar cosas en
30:56los pláos. No nos interesa proteger
30:59algunos sitios,
31:00pero si nos interesara están
31:03disponibles.
31:05Cada bacteria entonces hace una enzima
31:06de restricción y una enzima modificadora
31:10del sitio de restricción. Ambas
31:12reconocen al mismo sitio. Una lo corta y
31:15la otra lo modifica para que la otra no
31:17lo pueda cortar.
31:19Así la bacteria que produce la enzima se
31:22protege de de su arma. ¿Okay? ¿Quiénes
31:28entonces no son resistentes a cortar?
31:31Los organismos, los virus que entren de
31:33afuera, que no saben de la enzima ni de
31:37la modificadora, entran lo más campantes
31:39y la cortan y destruyen al virus, ¿okay?
31:43A los bacteriófagos.
31:48Bien, eso está claro.
31:54Algunos sobreviven.
31:56Los que sobreviven son los que son
31:59modificados cuando entran antes de que
32:01encima los corte.
32:03La bacteria por ahí no sabe que está
32:05modificando un sitio de un virus en vez
32:07de un sitio propio.
32:08Ah, aprovechan ese mecanismo.
32:09En algún momento lo modifican y se
32:11protegen. Una vez que se protegen, ya
32:13está, se pueden reflejar.
32:15Pero usando el mecanismo de la bacteria.
32:17De la bacteria.
32:23Okay. Después infectia
32:25y la otra bacteria ya están modificados
32:27ellos y pueden infectarlo más bien a la
32:29otra bacteria porque la bacteria que los
32:31produjo los modificó.
32:36Esto no quiero que se confundan, no es
32:38muy importante. Esta parte tiene un
32:39valor histórico para entender cómo
32:42funcionan en naturaleza. Para las clases
32:44de ingeniería genética lo que nos
32:46importa es que cortan,
32:48¿no? ¿Cómo hacer que no corten?
32:51¿Por qué las pocas frecuentes cortan más
32:53que las muy frecuentes?
32:57Eso lo que voy a explicar ahora. A ver,
32:59pero vamos haciendo la pregunta antes de
33:01que lo explique.
33:04Hay de qué depende que una enzima corte
33:07muchas veces o pocas veces
33:11la secuencia
33:12de la de la secuencia la que reconoce.
33:14¿Cuán frecuente es la secuencia que
33:16reconoce? Y eso depende de cuántas bases
33:19tiene la la secuencia que reconoce. Yo
33:21les mostré enzimas que reconocen seis,
33:24pero hay enzimas que reconocen cuatro.
33:27Hay enzimas que reconocen ocho,
33:30necesitan ocho para poder cortar o
33:32cuatro. Las de cuatro cortan un montón
33:34porque es mucho más probable encontrar
33:36cuatro nucleótidos de una determinada
33:39secuencia que seis. ¿Y cómo lo
33:41calculamos?
33:43Si yo estoy en un determinado lugar del
33:46genoma, ¿qué probabilidad hay de que acá
33:49haya una G?
33:52¿Y qué probabilidad hay de que al lado
33:54haya una A? 1 en cuatro.
33:57Uno en cuatro por uno en cuatro. ¿Qué
33:59probabilidad hay de que acá haya otra a
34:01por en
34:02cu en cu? Acá tiene que haber una t, una
34:05t y una c. Entonces, la probabilidad de
34:08que esta secuencia de seis sea la
34:11secuencia de reconocimiento de Eco R1 es
34:144 a la
34:17a la 6. 4 a la 6 4* 4* 4* 4* 4 se veces
34:22en total.
34:24Sí.
34:26es decir,
34:2840,096.
34:33Es decir, que
34:35en promedio
34:39cada 4096
34:43pares de bases
34:46podría encontrar una secuencia Eco R1,
34:49pero es al azar,
34:52¿sí? No va a haber cada 4,096.
34:57¿Sabes lo que es? Pues sonón
35:03estadísticamente,
35:04¿okay?
35:06Hay una probabilidad de que más o menos
35:08cada 4096 haya, pero ahora si pasaron
35:118000 bases en 8,000 bases es más
35:13probable que haya encontrado uno. Pero
35:16que una haya siguiente al lado, justo al
35:18lado, dos seguidas es más improbable.
35:21Sí. Cuanto más distancia hay, más
35:23probable que haya encontrar un sitio.
35:27Okay. En promedio cada 4,000 96. Si
35:31fuera una encima de las que reconoce
35:33cada cuatro pares de bases, entonces 4 a
35:36la 4 es 256.
35:38Cada 256 pares de bases hay un sitio de
35:40corte. Tremendo. Con esas enzimas
35:43degradamos todo.
35:47Por eso en el laboratorio las más
35:49comunes son las de seis, porque
35:51reconocen cada tanto,
35:54¿sí? Pero no reconocen eh no es
35:56imposible encontrarlas ni es tampoco tan
35:59tan frecuente que no podemos trabajar.
36:04Okay, entendimos lo de la frecuencia.
36:07La y si una una encima reconoce cada
36:09ocho, ¿cuánto es 4 a la 8?
36:14496,
36:15o sea, 4096 * 4 es 16,000*
36:194 65000 más o menos. 64000 un poquito
36:22más. Sí, o sea, cada 65,000 pares de
36:25bases un en promedio un sitio de corte.
36:30Bien, hay de siete,
36:33reconocen tres, tres y dejan y hay uno
36:36en el medio,
36:37que puede ser cualquiera.
36:38No, no, no puede ser cualquiera,
36:42pero son siete.
36:46Bien.
36:52Okay. Bueno,
36:54entonces ahora ya sabemos que el inserto
36:58que vamos a usar para clonar, vamos a
37:01clonar esta la no había usado la palabra
37:04clonar acá, ¿no? Entonces, ¿qué vamos a
37:06hacer? El inserto lo vamos a clonar.
37:09¿Qué quiere decir? Lo vamos a poner en
37:10un plásmido, que lo vamos a sellar con
37:13ligaza y después lo vamos a transformar
37:15en una bacteria y vamos a tener un clon
37:18de la bacteria que tiene el plásmido mío
37:20con mi inserto. Eso quiere decir clonar
37:24plásmidos, insertos, no animales.
37:29Entonces, este fragmento, ¿cómo lo
37:30generé?
37:35Por ejemplo, cortando con una enzima de
37:36restricción un pedaz otro pedazo, otro
37:39ADN. Sí.
37:42Y este, ¿cómo lo generé?
37:45Con una enzima. ¿Y cómo tienen que ser
37:47estos dos estos dos fragmentos?
37:50Tienen que tener extremos
37:52complementarios. Así cuando agrego
37:54ligaza
37:56se ligan. ¿Correcto?
37:59Y acá tenemos un plásmido que tiene,
38:02¿qué características?
38:05El Ori, ya hablamos,
38:08el gen de resistencia ya hablamos y
38:10tiene algo de lo que todavía no
38:11hablamos. ¿Qué es el MCS?
38:17El sitio de clonado múltiple, perdón.
38:22Okay, eso también lo vieron en la
38:25¿Y qué es el MCS?
38:31Es un sitio donde hay
38:35muchas secuencias que puso ¿quién?
38:40La empresa que te vende el plástido, por
38:41ejemplo, y que convenientemente puso
38:44sitios de corte único
38:47para que uno pueda clonar. Todos los
38:50sitios que están acá no tienen que
38:52aparecer acá porque si no no me sirve
38:54para clonar. Si tuviera dos sitios de
38:56corte, por ejemplo, acá hay un sitio de
38:57corre un si acá no hubiera si acá
39:00hubiera otro sitio de corre uno, no
39:02puedo clonar con eso porque ¿qué va a
39:03pasar? Le pongo el encima, corta acá y
39:05acá, me destruyo el plánido. Yo quiero
39:08que el plánido me quede así.
39:10Entonces, todo lo que hay acá tienen que
39:12ser sitios únicos.
39:15Pero ahí lo ahí un plánido que es una
39:18fracción de lo que era antes y si
39:20tuviera dos sitios de corte también.
39:21¿Cuál es la diferencia entre un sitio de
39:23corte y dos?
39:25Si uno está acá y uno está acá, arruiné
39:27el origen de replicación.
39:29Ah.
39:30Si uno está acá y el otro está acá,
39:31arruiné el sitio de encima de
39:33resistencia.
39:35Okay. Ahora, si los dos están acá, no
39:37hay problema, pero no se hace eso. ¿Para
39:40qué lo vas a, o sea, lo hago yo el sitio
39:43declonado a múltiple? ¿Para qué voy a
39:45poner dos
39:46si puedo poner uno?
39:49Y poner varias secuencias distintas por
39:50si quieres usar otra encima.
39:52Claro. ¿Por qué? Porque mis insertos,
39:55qué sé yo, ¿de dónde van a venir? Puedo
39:58venir de distintas lugares y me por ahí
40:00me conviene una encima de restricción y
40:01no otra. Y aparte, y aparte,
40:06perdón que grite, pero me entusiasmo.
40:11¿Qué pasa si yo más adelante te lo
40:14explico ahora? Más adelante te lo
40:15explico
40:17porque ya tengo un slide que algo dice
40:19eso y lo vamos a hacer después. Okay,
40:21por ahora nos quedamos que acá hay un
40:22solo sitio de corte para una enzima de
40:24restricción que es la que voy a usar
40:26para clonar acá.
40:28Una consulta, el vector S, ¿de dónde lo
40:31sacaste?
40:32también lo compré o me lo dio otro
40:34investigador o me lo mandó por correo el
40:36investigador de al lado o lo hice más en
40:40general no lo haces pero podés.
40:42O sea, las dos cosas las compraste.
40:45Compras la enzima, compras el vector, el
40:47inserto que lo generás vos porque es lo
40:49que vos querés poner.
40:51Claro. Y el inserto, vos sabes que el
40:53vector que viene de la fábrica está
40:55cortado con un en
40:56No, el vector que viene de la fábrica no
40:58está cortado.
40:59Ah, viene así. Si no, no lo puedo
41:02replicar en la bacteria.
41:03Claro.
41:04Yo lo corto con la enzima que me
41:06conviene de acuerdo al inserto.
41:08Y el inserto los
41:11vamos a avanzar y lo vamos viendo. Okay.
41:14Estas son las herramientas. Vamos viendo
41:16herramientas y uno puede hacer el límite
41:19de la imaginación.
41:21Okay.
41:26Ahora vamos a ver un video. Vamos a ver
41:28cómo se escucha.
41:30Si se escucha mal, no es muy grave, pero
41:33lo puedo pasar de vuelta.
41:37Este es un videío de YouTube que lo
41:38pueden ir, pueden buscarlo, lo van a
41:40encontrar, pero está bien.
41:58DNA called plasmids found inside
42:01bacterial cells can be engineered to
42:03make such proteins as human insulin by
42:07the gene that codes that protein.
42:12Special enzymes called restriction
42:14enzymes which recogniz to cut specific
42:19enzima restricción.
42:22in preparation insertion of a gen some
42:26restriction enzymes leave the DNA with
42:29uneven ends also known as sticky ends
42:32shown here if the gene we wish to insert
42:35and the plasmid are both cut with the
42:37same enzyme these sticky ends will be
42:40complementar meaning they will readily
42:42bond with one another
42:45in a follow-up reaction gene fragments
42:48cut plasmids and an enzyme that connects
42:51DNA fragments are mixed together.
43:00This so-called liase enzyme attaches the
43:03sticky ends in the solution to produce
43:06circular plasmids that now carry the
43:08gene that codes for the desired protein.
43:12Note that the efficiency of recombinant
43:14techniques is not 100% and may lead to
43:18plasmids with no inserts or multiple
43:21inserts.
43:25Ok. ¿Se entendió?
43:28Ahí dijo algo interesante que no
43:31habíamos dicho todavía. Podría ocurrir
43:34que yo tenga mi plmido
43:38que tiene mi sitio cortado acá,
43:47¿okay? Y le pongo el fragmento. Esto lo
43:50que yo quiero es que el fragmento se una
43:53acá, así.
43:55Pero este sitio de acá es igual al de
43:57acá
43:59y este es igual al de este. Entonces,
44:01podría pasar de que un fragmento
44:08se una a otro fragmento
44:11y eso se una al plásmido o tres o que el
44:16plásmido se vuelva a cerrar. ¿Qué me va
44:18a cómo hago para forzar que esto se meta
44:21en el plásmido? No puedo. Lo único que
44:23puedo hacer es
44:26jugar con la cantidad de uno y del otro
44:29que pongo para hacer que sea más
44:30probable una cosa que la otra. Entonces
44:33voy a poner por cada plásmido que pongo,
44:37pongo cinco veces más de inserto. No
44:40tienen que anotar eso, el número. Okay,
44:43más. Pongo más inserto para favorecer
44:46que ocurra esto. Pero si pongo demasiado
44:49inserto, va a pasar esto.
44:52Okay. Entonces, ¿cómo puedo evitar que
44:56se me generen múltiples insertos?
44:59¿Te afecta mucho que se generen
45:00múltiples?
45:01Depende lo que quieras. yo hacer
45:04por ahí, quiero eso, pero digo, si no
45:06quiero porque quiero uno solo por
45:09plásmido,
45:10¿cómo lo puedo evitar?
45:11De otro modo velocidad que dijiste
45:15de otro modo,
45:16alguna enzima te reconozca ese extremo y
45:21se lo bloquee de algún modo,
45:22pero yo tengo que poder ligar
45:24finalmente.
45:25Sí,
45:26uso un truco, cuando se lo diga, van a
45:29decir, "¿Cómo no se me ocurrió?"
45:31Corto con dos enzimas distintas al
45:33pláido.
45:35Okay. Acá corté con la enzima Eco R1
45:39y acá corté con la enzima BAM H1.
45:45Otra enzima que deja extremos
45:46protruyentes, pero distintos.
45:49Okay. La secuencia de acá no es la misma
45:51que la de acá. Entonces, al plásmido lo
45:54tengo que cortar con las dos enzimas
45:57estas y entonces ya el plásmido no se
45:59puede ligar. consigo mismo.
46:02Por eso el sitio múltiple declonado,
46:05supongamos que este es nuestro sitio
46:06múltiple declonado. No me digas que me
46:08dieron marcadores que no se borran.
46:18Si este es mi plásmido
46:21acá.
46:31Acá en el MCS.
46:35Tremendo.
46:43Desastre. Borramos. No podemos volver a
46:45escribir. Alejandro, no estás para esta
46:48tecnología.
46:50Acá tengo el sitio de corre
46:54y acá tengo el sitio BAM H1 en el
46:57plásmido.
46:59Entonces, al plásmido lo corto con dos
47:02enzimas distintas.
47:04Este pedacito se va, lo puedo purificar
47:07en un gel de agarosa, ¿se acuerdan los
47:09gel de agaroa?
47:10Lo corro en un gel y esto es muchísimo
47:13más grande que esto y después corto el
47:15pedacito de agarroosa que tiene la banda
47:17esta y me lo purifico. Okay.
47:20Entonces, tengo ahora un plásmido que
47:22tiene este extremo de acá que está
47:25mojado,
47:26está remojado. Okay. Bueno, si lo
47:30imaginan son distintas secuencias. Sí
47:33que se pueden entonces no se pueden
47:35ligar y la única forma de sellarlo es
47:38que mi inserto también esté cortado con
47:41eco y Bam y eso tiene una segunda
47:45ventaja que si no esto podría entrar si
47:49fuera eco solo puede ser así o así.
47:53Supóngase que yo puse lo puse en estamos
47:55adelantándonos.
47:57Suponga que acá había un promotor
47:59para que esto se expresen bacterias. y
48:02esto sea el gen, un gen de bacterias o
48:04un gen de insulina o lo que quieran. Si
48:06lo puse al revés, no sirve, ¿correcto?
48:09Porque se tiene que transcribir la hebra
48:11correcta.
48:13Entonces, la direccionalidad de la
48:15inserción es muy importante y una forma
48:17de lograrlo es cambiando, pulsando
48:20encima de restricción distintas. Si no,
48:22la mitad va a quedar de un lado y la
48:24mitad va a quedar del otro. ¿No es
48:25terrible? Me puedo fijar
48:28para repetir esa parte. Entonces si el
48:31fragmento que tengo que insertar, si
48:33inserta al revés, va a quedar escrito
48:34algo completamente diferente porque va a
48:36ser la secuencia
48:37y la cadena de arriba va a ser la la
48:40complementaria de la otra.
48:42Entonces, si yo quisiera expresarlo, si
48:44no quiero expresarlo, por ahí me da lo
48:46mismo, pero si quiero expresarlo y le
48:48puse un promotor al plmido acá, entonces
48:51yo quiero que no quede de cualquier
48:53manera, que quede de una de manera
48:55porque la hebra molde es la molde y la
48:57otra la hebra codificante. Por
48:58los extremos, no se te
49:02por los extremos del corte, ¿no tendrías
49:04como un pseudo extremo cinco prima y
49:07otro tres prima? Si son iguales se puede
49:09invertir y lo mismo.
49:13Si son distintos ya queda de una
49:14determinada manera. Eso no es muy
49:16importante para la clase de hoy. Okay.
49:18Solo estamos hablando de eso. Sí.
49:20El promotor ya está en el plásmido.
49:23Si quiero que sea un plásmido del cual
49:26pueda expresar algo, tengo que ponerlo
49:29en el plásmido también. Pero ahora
49:30tendrías que saber dónde contacto.
49:34Tengo que saber todo tal cual
49:35antes de mandarlo a hacer.
49:37Sí.
49:40Okay, se pagó esto. ¿Qué pasó?
49:43Ah, terminó el video. Bien. ¿Podrías
49:45poner 2 segundos la dif anterior?
49:48¿Anterior a qué?
49:49Ah, ahí está Diapo.
49:50El video es ese
49:51anterior al video. Una dif.
49:58Esta. Sí,
49:59pero te las voy a dar hoy a la tarde.
50:04Te prometo que hoy a la noche no vas a
50:06que estar sin las slide que me duermo.
50:10Por eso te lo digo.
50:13Bueno, características básicas de los
50:15vectores de clonado.
50:18Los vectores de clonado tienen como
50:20mínimo esto.
50:24con moléculas de ADN capaces de ser
50:26introducidas en las células vivas y de
50:28replicarse independientemente del genoma
50:31de la célula. Eso lo garantizamos con el
50:34ori,
50:35¿correcto?
50:39Llevan uno o más orígenes de replicación
50:42más. ¿Qué quiere decir? Pueden tener,
50:44aparte de uno bacteriano, uno eucariota.
50:48Por ejemplo, en mi laboratorio que
50:51trabajamos con levaduras, usamos
50:53plásmidos que tienen un origen
50:55bacteriano para poder amplificarlo
50:58clonar y todo lo que te estoy contando
50:59ahora y tienen un origen también de
51:03levaduras para que se yo pueda
51:05transformar la levadura y y el plásmido
51:06quedarse en la levadura,
51:09¿okay? Replicarse junto con las
51:11levaduras.
51:12También se puede poner un origen de
51:13replicación de células de mamífero.
51:16Okay. Me miras con cara de que no
51:18entendiste.
51:19Sí.
51:21Como mínimo, el plásmido tiene que tener
51:23un origen de replicación para la
51:25bacteria. Eso ya lo cubrimos. Ahora, ¿en
51:28dónde lo voy a usar el plá? ¿Para qué lo
51:30voy a usar? Depende. Si solo me interesa
51:33expresarlo en la bacteria, listo,
51:35transformarlo en la bacteria, que es con
51:37lo que vamos a ver hoy, con eso me
51:39alcanza. Ahora, si yo después lo quiero
51:40usar lo que clone en la bacteria para
51:43otra cosa en otras células
51:46otro organismo, me conviene que el
51:49plásmido ya esté listo para poder
51:51también replicarse en otro organismo.
51:54Replico qué listo
51:55que tenga un origen de replicación que
51:58sea funcional en otro organismo. Le
52:01agrego dos orígenes de replicación,
52:03el ori de bacterias y como te decía, un
52:07ori de levaduras, un centrómero de
52:10levaduras. Las levaduras son eucariotas,
52:12tienen centró,
52:14son cromosomas. Entonces, le pongo un
52:17centrómero que funcione en la levadura.
52:19la levadura lo va a poder y un origen de
52:20replicación del ADN de levaduras, por
52:23ejemplo, o le pongo un origen de
52:25replicación para células animales
52:27también. Okay, eso depende de lo que voy
52:30a usarlo. Si le ponéis un se pon que
52:33tenga un plátido y lo quiero meter en el
52:35cro animal porque quiero que se le pongo
52:37un ori, ya tiene un ya tiene un oli
52:40procariótico y le pongo un ori que
52:42funcione células ecualitas animales. El
52:44olivaismo no se va a activar a esto, o
52:46sea, no es que
52:47para las células animales esa es una
52:49secuencia que no sirve para no tiene
52:51sentido.
52:51Okay.
52:52Lo mismo viceversa. La bacteria veo un
52:55origen de eucarias, no sabe lo que es
52:56eso.
52:57Okay. Entonces, no va no se dios al
52:59mismo tiempo,
52:59como dos idiomas distintos, eh,
53:01no se me va a activar los dos al mismo
53:03tiempo,
53:04¿no? Porque las maquinaria son
53:05completamente distintas.
53:07Está bien, perfecto.
53:08Es otro mundo. Miles de millones de años
53:11no separan.
53:14Ni la traducción va a funcionar.
53:17O sea, el las bacterias tienen RBS, los
53:21eucariotas no tienen RBS, los eucariotas
53:23tienen el cap, o sea,
53:27hay diferencias. Okay. Lo que es lo
53:29mismo es el código genético,
53:32pero el sistema del se código genético
53:34es completamente distinto. La maquinaria
53:38tiene diferencias, digamos, ¿no? Los
53:39ribosomas son muy parecidos. Claro, eso
53:43usan RNA parecido, no es idéntico.
53:47Pero profe, lo que yo no entiendo es
53:49cuando vos a la bacteria el plástmido.
53:53Cuando veas a la bacteria del plástmido
53:55y supiste que veas un gen de una
53:57eucariota, una procariota, ¿viste toda
54:00la maquinaria del factor de transición y
54:02de cáncer o no lo necesitamos? El para
54:05que se exprese,
54:06¿sí?
54:07No, para que se exprese, esto nos
54:08estamos adelantando, pero vamos ya
54:10entrenándonos. Para que una ungen
54:14de cualquier origen se exprese, se
54:17transcriba en bacterias, tiene que tener
54:19un promotor de la célula, de la bacteria
54:22que lo tiene.
54:24No sirve para nada la tata box, la tata
54:27en los sitios de data binding protein y
54:29los enhancers eucariotas en bacterias no
54:32sirven para nada. Y al revés lo mismo,
54:34un promotor del operón lac no sirve en
54:38células eucariotas
54:40porque no está la polimerasa con el
54:41factor sigma nada.
54:47Moléculas. Entonces, orígenes de
54:48replicación, uno procariótico y quizás
54:51alguno eucariótico y ahora ya lo ya lo
54:53entendimos, pero seguro el procariótico.
54:56Tienen que tener una
54:59gen de resistencia a un antibiótico.
55:05Eso es lo super ultra más común. ¿Habría
55:08alguna otra manera de garantizar que la
55:10bacteria se lo quiera quedar? Puede ser,
55:13por ejemplo, si hay un que codifique el
55:16gen, codifique para una enzima para
55:18sintetizar un aminoácido que la bacteria
55:20no lo sepa hacer.
55:21Espera, esperaa. Entonces, el gén
55:24resistencia antibiótico sirve para que
55:26la célula acepte la
55:28no. ¿Para qué sirve el de resistencia
55:30antibiótico?
55:32Antibióticos.
55:33Si te sirve para hacer de presión de
55:35selección y quedarte solo con las que
55:37tengan.
55:38Esto es clave. Eh, presión de selección.
55:41La bacteria no sabe qué ADN está
55:43recibiendo hasta que no se expresa,
55:47no sabe si sirve para Nunca sabe,
55:49obviamente. Okay. El gen de resistencia
55:52sirve para matar a todas las que no
55:54recibieron el plástico
55:55y por eso en el agua las cultivamos con
55:58la
55:59Exacto. Las placas las placas de ágar
56:02tienen el antibiótico.
56:05Okay. Okay. Entonces, tiene que tener
56:08origen de replicación, tiene que tener
56:10gen de resistencia, tiene que tener una
56:12región que acá se llama polylinker.
56:15Polyinker es lo mismo que m sitio de
56:18clonado múltiple, multicloning site.
56:21Polyinker, linker es unidor y esos son
56:24los sitios de corte.
56:31Bien,
56:34en alguno de los sitios del polilíker se
56:36liga el segmento foráneo, que es lo que
56:39estamos vamos a meter, que es el
56:41inserto. ¿Okay? Es lo que dijimos antes.
56:44¿Okay?
56:47Entonces, si ustedes dibujan un plásmido
56:50con un inserto,
56:54el resultado de ligar esto sí es que
56:56esto queda con el inserto acá y esto es
57:00está dentro del polilinker.
57:03Si ustedes usaron las enzimas de los
57:04bordes del Polyinker, no queda ninguna
57:07encima porque usaron la de los bordes,
57:09¿no? Habíamos dicho que el Polyinker por
57:11ahí tiene muchos sitios de corte.
57:15Si usamos dos enzimas, una de cada borde
57:19para poner el inserto, el polilíncar
57:21desapareció luego de que lo cloné, mi
57:24inserto. Ahora si usé las dos de acá, me
57:27queda mi inserto y el resto de las
57:29sitios de corte quedan al costado sin
57:31usar
57:33para la próxima si los quiero usar
57:35después.
57:42Acá tienen un ejemplo de sitio de corte,
57:47de sitio de multicloning site.
57:50Este sitio de clonado tienen Eco R1 en
57:52un costado, SAC 1, KPN1, SMA 1, BAM1,
57:56todos estos sitios
57:59puestos ahí para que el investigador los
58:02pueda usar.
58:05Salteamos sin querer la diapositiva que
58:08tenía, cómo se nombran las enzimas de
58:10restricción. Sí. La primera letra, las
58:13primeras tres letras, o sea, el nombre,
58:15excepto, por ejemplo, BAM, es la el
58:18nombre de la de la bacteria de donde
58:20salió. Sí, eco es ecoli. Cada una viene
58:24de un nombre distinto.
58:26Eso ya se los había dicho. Bueno,
58:27entonces tienen montones, montones. Y
58:29están las tres porque debe haber 1, 2, 3
58:33por ahí cu. Okay.
58:36Bien. Y acá tienen la resistencia
58:38ampicilina, pero no es la única la
58:39picilina. Hay otros antibióticos,
58:41¿verdad? Clorangenicol,
58:44canamicina,
58:47estctomicina, cada uno de ellos uno
58:49puede tener el gen de resistencia.
58:53Bien.
58:55Las bacterias antirresistentes de los
58:56hospitales tienen plásmidos que tienen
58:59muchos genes de resistencia e por eso es
59:02difícil de matarlas en el hospital.
59:04Okay.
59:10Bueno,
59:15ahora entendemos un poco mejor que
59:17agarramos el inserto y el vector
59:20cortados con enzimas de restricción
59:21compatibles. Puede ser una sola o dos.
59:27Se liga, se transforma en la bacteria.
59:31Ahora, ¿qué pasa? hasta que no lo tengo
59:33en una bacteria, no lo logré clonar
59:35todavía, solo tengo un tubo en el
59:37laboratorio.
59:41Entonces,
59:44esta slide la vamos a repetir varias
59:45veces en distintas situaciones el día de
59:48hoy. Entonces tiene algunos agregados
59:50que no que no importan ahora, pero
59:52bueno, tenemos lo que les mostré antes,
59:53el plásmido entrando a la bacteria y
59:56eso. Entonces se hace el procedimiento
59:57de transformación que vieron en la en el
59:59TP. Algunas bacterias reciben el los
1:00:03plásmidos y esas son las que que están
1:00:06acá en colores. Estas tres son las que
1:00:08recibieron plásmido. Las que están
1:00:10vacías son las que no recibieron
1:00:11plásmido. Como la placa tiene
1:00:13antibiótico, se mueren las que no
1:00:15recibieron plásmido y solo crecen al día
1:00:18siguiente.
1:00:20Se ven tres montañitas de bacterias
1:00:25que son las que tienen el pláido que les
1:00:27permitió sobrevivir al antibiótico.
1:00:30Okay. Después vamos a ver a qué se
1:00:32refiere esta. O sea, acá son todas
1:00:33iguales.
1:00:38Ah, creo que tení la anterior.
1:00:44¿Qué?
1:00:46A la parte de
1:00:51no la parte cómo es este proceso
1:00:55transformación. Fuiste al TP.
1:00:58En el TP hicieron esto,
1:01:01trajo práctico de transformación. No sé
1:01:03si hiciste, te pregunto.
1:01:04Ah, sí.
1:01:05Bueno, ahí hacen esto, mezclan el
1:01:07plásmido con las bacterias y los
1:01:09plaquean. A las bacterias hay que
1:01:11hacerlas competentes. Estas bacterias no
1:01:14son cualquier bacteria, son las
1:01:15bacterias que sufrieron un procedimiento
1:01:17que les permite estar listas para
1:01:19recibir pláido.
1:01:22Entonces, las bacterias competentes se
1:01:23mezclan con el plásmido y se plaquean en
1:01:25una placa que tiene antibiótico. Solo
1:01:28las que recibieron el plásmido son las
1:01:30que van a poder resistir al antibiótico
1:01:31y formar una colonia.
1:01:36Acá se ve lo mismo, solo que estamos con
1:01:38el sitio de corte y acá agregamos un
1:01:41detalle que ya lo hablamos un poquito.
1:01:43Acá tenemos un plásmido, un inserto,
1:01:45¿sí? cortado.
1:01:53Todo bien. Yo también de alumno hablo
1:01:56mucho, pero yo de docente no me gusto.
1:02:03Tenés un inserto cortado con eco R1 que
1:02:06deja los extremos esos que habíamos
1:02:07dicho. Sí. Y ahora tengo el plásmido
1:02:12cortado también con EcoR1. AATT. AATT.
1:02:15esperando a este. Esto está como
1:02:18desfasado un poco, me parece que quedó
1:02:20desfasado. Okay. Entonces, cuando los
1:02:23mezcle, ¿qué va a pasar?
1:02:26Se van a poder ligar,
1:02:28como dijimos. Okay, ya sabemos que se
1:02:30puede ligar así o al revés, no lo
1:02:33podemos controlar. En este caso, la
1:02:34mitad va a estar de un lado, la mitad va
1:02:36a estar del otro. Y ahora el plásmido
1:02:38resultante, ¿cuántos sitios se corre uno
1:02:40tiene?
1:02:42Dos.
1:02:43Dos. ¿Y el plido inicial, ¿cuántos
1:02:44tenía? Uno,
1:02:46uno. Okay. Entonces, si yo hago una mini
1:02:49prepieron ustedes en el en el TP y la
1:02:53trato con encima de restricción y hay
1:02:54varias colonias de una ligación,
1:02:58los corro en un gel cortado con eco R1.
1:03:01Sí.
1:03:02Si no anduvo la ligación y lo único que
1:03:04creció es el plásmido original, ¿cuántas
1:03:06bandas voy a ver?
1:03:07Dos.
1:03:08Una, porque había un solo sitio. Y si
1:03:11anduvo la ligación,
1:03:12dos. dos porque se va a separar el
1:03:14vector del inserto. ¿Okay? Entonces, así
1:03:18es como sabemos si anduo nuestro clonado
1:03:21en el laboratorio. Una de las maneras.
1:03:24¿Eso entendieron?
1:03:31¿Qué diferencia hay entre este plásmido?
1:03:33Supongamos que lo ligamos con eco R1
1:03:35para hacerlo más fácil y con un marcador
1:03:38que ande
1:03:42y el plásmido parental
1:03:45que tiene el un solo sitio. ER1,
1:03:49que este tiene dos sitios y este tiene
1:03:51uno.
1:03:52Si yo corro un gel
1:03:55de agarosa,
1:03:57sí,
1:03:59en una calle corro el plásmido sin
1:04:02inserto, ¿cuántas bandas va a haber?
1:04:06Una.
1:04:06Una. ¿De qué tamaño?
1:04:09Tamaño del pláido.
1:04:10Tamaño del plásmido. Supongamos que el
1:04:12plásmido tiene 4,5.
1:04:15Entonces va a quedar entre la el marker
1:04:16de cuatro y el marker de CCO.
1:04:21Para allá corre, ¿no? Porque acá está el
1:04:22polo positivo y acá corre un plásmido
1:04:26que quiero saber si tuvo el inserto, si
1:04:29recibió, si anduvo la alegación. Okay.
1:04:32Va a ser más grande.
1:04:33Si anduvo, pero lo corté con R1,
1:04:37no va a ser más grande.
1:04:40Va a quedar este pedazo que va a ser
1:04:42igual a este
1:04:45y va a tener el inserto que pongamos que
1:04:46tenga un una kilo base. El inserto. Va a
1:04:49haber una banda acá de uno.
1:04:54El que tiene la el que está la banda de
1:04:57uno es al que se le incluyó. Exacto. Lo
1:05:00que corría acá es el plásmido
1:05:02recombinante,
1:05:04el plásmido donde me anduvo el clonado.
1:05:07Y vas a tener la banda donde no te
1:05:09anduvo y donde te anduvo.
1:05:11No, la banda no como que no me anduvo.
1:05:13El carril donde me anduvo va a ser el
1:05:14plásmido y el inserto.
1:05:16Y pero, ¿por qué no te queda todo punto?
1:05:18Porque lo corté con la encima de
1:05:19restricción
1:05:22antes de antes de correr el gel. Lo
1:05:23corté.
1:05:24Okay,
1:05:25hice la mini prep, lo corto con encima
1:05:28restricción y después lo siembro en el
1:05:30gel.
1:05:32Okay, esto entendieron
1:05:34alguno, ¿no?
1:05:39Éxito.
1:05:43Esto lo van a ver en los seminarios de
1:05:44vuelta. Sí.
1:05:51Okay. Bueno, entonces vimos encima de
1:05:53restricción,
1:05:55como era de esperar el descubrimiento de
1:05:58las enzimas de restricción, recibió un
1:06:00premio Nobel.
1:06:03Okay. En el año 78 le dieron el Premio
1:06:06Nobel a estas tres personas por sus
1:06:09trabajos con las enzimas de restricción
1:06:11que se descubrieron entre los años 50 y
1:06:1360. Se descubrieron que las bacterias
1:06:15tenían algún sistema para digerir virus
1:06:19para los cuales ellas eran resistentes.
1:06:23Sí. Y hasta que las lograron purificar,
1:06:25etcétera. Bueno, ahí está. A Har le
1:06:29dieron el Premio Nobel porque es el que
1:06:32descubrió las enzimas de restricción y
1:06:35sus enzimas modificadoras, las dos, los
1:06:38pares, encima de restricción y encima
1:06:40modificadora.
1:06:45Esto es lo que ya lo hablamos. Esto lo
1:06:47dejé acá por si no me si no me hubieran
1:06:49preguntado por qué no cortan a la
1:06:50bacteria que los produce.
1:06:53Okay. Que tienen encima modificadora.
1:06:56A Smith le dieron el premio porque es el
1:07:00que purificó a la primera enima, el que
1:07:02logró purificar a la primera enzima,
1:07:04estamos hablando del año 1970,
1:07:06¿okay?
1:07:08Que fue Hin de TR, ¿no? Es la primera
1:07:10enzima que se descubrió. sino la primera
1:07:13que se logró purificar, ¿okay? Porque se
1:07:16arruinaba, no la podían purificar.
1:07:17Bueno, no importa. Lograron purificar la
1:07:19de Gin 3 que corta. Entonces, ahí la
1:07:22puedes purificar y en vitro puedes
1:07:23probar todas las bases que quieras, las
1:07:25secuencias y ver a ver dónde corta,
1:07:27etcétera, sin interferencia de nada de
1:07:29la célula.
1:07:32Entonces, básicamente acá comienza la
1:07:34biología molecular,
1:07:36la ingeniería genética, digamos, la
1:07:38biología molecular en la mesada donde
1:07:40podemos modificar el ADN, cortar pedazos
1:07:42y pegarlos.
1:07:44Lo que les estaba contando recién para
1:07:48estar
1:07:53necesita, ¿qué necesita un encima para
1:07:55andar? Según las clases de Alejandra
1:07:59Guberman, pH,
1:08:01un pH,
1:08:02una temperatura,
1:08:04un sustrato y unas sales. Por ahí
1:08:07necesita algunos sales, más sodio, menos
1:08:09sodio.
1:08:09Necesita algunos cofactores que no se
1:08:11suprato,
1:08:12algunas como la ligaza que necesitan.
1:08:15Era magnesio,
1:08:16ATP y magnesio también. Todo lo que
1:08:19necesita TP necesita magnesio. El ATP
1:08:21viene con el magnesio.
1:08:22Ah, está
1:08:24funciona con el Hay que agregarle el
1:08:25magnesio.
1:08:27Okay. Entonces, si vos lo que tenés que
1:08:29hacer es extraerlo de la bacteria y
1:08:32después fijarte en qué buffer anda. Lo
1:08:35primero que probas es algo parecido al
1:08:36citoplasma de la bacteria, ¿no? Porque
1:08:39ahí es donde anda
1:08:41bien. No necesariamente es el óptimo.
1:08:45Es, pero ahí debería andar.
1:08:47Una consulta.
1:08:49Volviendo un poco atrás, polilés
1:08:51sintético, o sea, vos lo comprás y se lo
1:08:55agregas.
1:08:59Vos comprás el plásmido que ya le
1:09:03pusieron el polilín,
1:09:06¿okay?
1:09:07Y en base a eso le compras un las
1:09:10enzimas de recepción que necesitas,
1:09:12etcétera. Obviamente ahora podés
1:09:14sintetizar el ADN fácilmente barato y te
1:09:17podés hacer un polilinker que a vos te
1:09:18guste distinto si querés,
1:09:20pero naturalmente no existe.
1:09:21Naturalmente los polyinkers no sé, están
1:09:24ordenaditos, perfectos para clonado.
1:09:27Dios hizo bastante, pero Polyinkers no.
1:09:34Bien.
1:09:35Y Nathans, ¿qué hizo? Nathan dijo, "Ah,
1:09:40esto es buenísimo, esto de la enzima de
1:09:42restricción.
1:09:44Vamos a hacerlo para hacer mapas
1:09:46genéticos de organismos basados en dónde
1:09:52cortan las enzimas de restricción. ¿Qué
1:09:55quiere decir eso?
1:09:58Por ejemplo, el virus de CB40, que es el
1:10:01donde hizo el mapa, es un es un virus de
1:10:05mamíferos que tiene 5,000 pares de bases
1:10:07circular.
1:10:10Lo puse, lo puse.
1:10:13Ahí está. Esa es la secuencia del virus
1:10:16de C40 que no la sabían en el momento.
1:10:19En ese momento sabían que era un
1:10:20plácmido, como un plácido, 5,000 bases.
1:10:23Okay.
1:10:25Y cómo distingo a este plásmido de 5,000
1:10:28pares de bases de otro de 5,000 pares de
1:10:30bases? Bueno, su secuencia es distinta,
1:10:33pero su secuencia no la conozco, pero
1:10:35puedo conocer qué sitios de corte tiene.
1:10:39Entonces, me agarro unos unas enzimas de
1:10:41restricción y me incubo a mi DNA con
1:10:45esas enzimas de restricción de acuerdo
1:10:47al número de sitios de corte.
1:10:50Voy a ver las bandas.
1:10:51Voy a ver las bandas. Entonces,
1:10:54el virus de CB40 tiene un patrón de
1:10:57bandas característico de su secuencia.
1:11:01Ese es el mapa.
1:11:03¿Okay? Y me puedo dar cuenta combinando
1:11:07enzimas que enzima está cerca de la
1:11:09otra.
1:11:11¿Okay?
1:11:13Por ejemplo, si yo agarrara este
1:11:16plásmido,
1:11:18¿no? Una suposición
1:11:22que tiene un sitio de corte acá para gin
1:11:24de tres
1:11:26y no hay ningún sitio de corte, es gin
1:11:28de tres acá.
1:11:31Y acá corto, le agrego una calle que
1:11:35tiene esta tiene eco, esta tiene eco más
1:11:38hind.
1:11:40¿Cómo va a dar el patrón de bandas? ¿Se
1:11:43ve o no se ve nada? Esto
1:11:46cortó acá la parte del backbone, el
1:11:50vector, el esqueleto del vector va a ser
1:11:54diferente,
1:11:55¿no?
1:11:55No, porque no se corta con gin de tres.
1:11:57Va a dar esta banda de acá. ¿Qué es lo
1:11:59que va a ser diferente?
1:12:02El inserto. ¿Qué le pasó al inserto?
1:12:06Se cortó. Supongamos que la distancia de
1:12:08acá es 0,4 kbases y acá 0,6.
1:12:15¿Qué me va a dar acá?
1:12:16Dos bandas.
1:12:17Una banda de ¿qué? Una de 0,4 y una de
1:12:190,6.
1:12:22Okay. Y entonces así me voy armando el
1:12:25mapa. Si tengo este resultado, digo, ah,
1:12:28supongamos que este sea mi virus entre
1:12:30medio de los dos sitios eco, ahí está el
1:12:33sitio hin de tres. Los sitios eco
1:12:36estaban separados una kil base y entre
1:12:38medio estaba el sitio hin de 3. y me voy
1:12:40armando el mapa
1:12:43acá, que puse,
1:12:47¿qué pasó con mi puntero
1:12:52al lado del
1:12:55acá están marcados los sitios hind 3,
1:12:58BAM, PCT y Eco que tiene el virus.
1:13:03Entonces, con esto uno puede armar un
1:13:05mapa rudimentario del virus. Por eso le
1:13:08dieron el Premio Nobel a esta persona. Y
1:13:10ahí comenzó la era de los mapas de
1:13:14enzima de restricción. Los mapas de
1:13:16restricción.
1:13:18Okay.
1:13:23¿Qué hora es? Son las 3:15.
1:13:27Un poquito más.
1:13:29Bien. Okay. Ahora empezamos otro tema.
1:13:32Avanzo un poquito y paramos.
1:13:34Hacemos un intervalo o quieren hacer
1:13:36ahora intervalo y después seguimos hasta
1:13:37el final.
1:13:39Ahora está bien.
1:13:41Bueno, paramos ahora entonces.
1:13:4510 minutos.
1:13:54[Música]
1:14:05No es una orquesta.
1:14:08Hola, seguimos, seguimos adelante.
1:14:13Sigo.
1:14:14Ahora, bueno, ¿les quedó alguna
1:14:16pregunta?
1:14:18Mapa de restricción.
1:14:21El mapa de restricción es el patrón de
1:14:23corte que tiene un determinado
1:14:27una determinada secuencia. Puede ser un
1:14:29plásmido o puede ser lineal. Sí, que
1:14:33dice dónde están los sitios de corte y
1:14:34las enzimas de restricciones.
1:14:37Antes de la que se pudiera secuenciar
1:14:40así tan fácilmente las secuencias de
1:14:42ADN, lo que se tenía era los sitios de
1:14:45corte. Entonces sabías que tal región
1:14:47estaba cerca de tal sitio y tal otro y
1:14:49más o menos te ubicabas en el genoma y
1:14:51aparte te permitía caracterizar
1:14:55una molécula y distinguirla de otra. Un
1:14:58patrón de corte indica una identidad.
1:15:01Sí. Si vos tenés un patrón de corte de
1:15:03una parte de tu genoma distinto el de
1:15:05ella porque tienen modificaciones en la
1:15:07secuencia ADN uno respecto del otro. Eso
1:15:09lo podemos detectar con un patrón de
1:15:12restricción distinto, sin tener que
1:15:14secuenciarlo.
1:15:17Okay. Bien, ahora vamos a ver cómo vamos
1:15:21a hacer,
1:15:23chicos. Ya, ya me estoy agotando, estoy
1:15:25hablando demasiado fuerte y si encima,
1:15:28pero es culpa mía eso. Si ustedes hablan
1:15:31me van a forzar más y no los fin de
1:15:33semana. Bien, entonces ahora lo que
1:15:37vamos a ver es cómo generar una
1:15:39biblioteca,
1:15:41¿okay? Que se dice en inglés library.
1:15:45En castellano también se puede decir
1:15:47banco, un banco de plásmidos con todos
1:15:51los genes humanos,
1:15:53¿okay?
1:15:55O sea, completa todo el genoma humano de
1:15:57ejemplo.
1:16:01Y después vamos a ver cómo hacemos con
1:16:03esa library para encontrar un gen
1:16:06particular que nos interesa si no
1:16:08tuviéramos la secuencia. O sea, esto se
1:16:10puede aplicar a un genoma que no esté
1:16:12secuenciado.
1:16:17Recordemos entonces que los genes en los
1:16:20humanos y en los otros organismos
1:16:23ocariotas multicelulares son muy
1:16:26grandes. Sí. Acá tenemos, por ejemplo,
1:16:28un cromosoma humano de 1,5 por 10 a la 8
1:16:33bases, es decir, 150 millones de bases,
1:16:36un cromosoma. Y acá tenemos un pedacito
1:16:39del cromosoma que está hecho suma acá,
1:16:41¿sí? 0,5%
1:16:43del cromosoma que tiene por en este caso
1:16:4515 genes. Cada gen está marcado en rojo,
1:16:48separados por secuencias intergénicas
1:16:51que no tienen genes. No quiere decir que
1:16:53no sirvan para nada, sino que no tienen
1:16:55genes. Por ahí alguna no sirve para
1:16:57nada. ¿Está bien eso?
1:16:59Sí.
1:17:00Y si hacemos sumen uno de los genes,
1:17:02¿qué vemos? Este es el gen, ¿okay? tiene
1:17:05su secuencia promotora y tiene sus
1:17:07secuencias exónicas separadas por
1:17:10secuencias sin intrónicas. Es decir, que
1:17:12estamos hablando de una secuencia
1:17:13bastante grande, ¿sí? El mensajero
1:17:16transcripto primario, mensajero maduro.
1:17:18Eso solo para recordar qué es lo que
1:17:20vamos ahora a clonar en los plátos. todo
1:17:23el genoma humano,
1:17:28no hay muchos plásticos, incluyendo los
1:17:30intrones que no se
1:17:35quédate con esa pregunta que la vas a
1:17:36contestar solo,
1:17:37¿okay?
1:17:39Y si no, la preguntas.
1:17:42Okay. Supongamos que queremos clonar.
1:17:47Clonar, ¿qué quiere decir? encontrar un
1:17:49plásmido que tenga el gen de la insulina
1:17:52y lo tengo en un una bacteria y lo puedo
1:17:54crecer y tener la cantidad que quiera.
1:17:56Eso es lo que quiere decir clonarlo,
1:17:58sacarlo del genoma humano, transportarlo
1:18:00a un plásmido y después tener un montón
1:18:02en un tubo. ¿Okay? Supongamos que
1:18:06queremos clonar el gen de la insulina
1:18:07humana,
1:18:09el gen humano de insulina. ¿Sí?
1:18:12Entonces, lo que vamos a hacer en este
1:18:14en este método es hacer una biblioteca.
1:18:17Para eso lo vamos a hacer si no tenemos
1:18:19el la secuencia. Si tenemos la secuencia
1:18:21lo hacemos de otra manera. Hacemos una
1:18:23PCR, por ejemplo.
1:18:25Okay.
1:18:28Bueno, entonces, ¿qué hacemos? Esto lo
1:18:30vamos a ver de vuelta. sacamos sangre de
1:18:32alguien, sacamos las células, los
1:18:34linfocitos
1:18:36y de ahí extraemos el ADN con un
1:18:38procedimiento
1:18:40similar, pero distinto al tus usaron
1:18:42para purificar plasmadas.
1:18:45Ese es ADN cromosómico.
1:18:46Cromosómico. Cromosómico, tal cual.
1:18:50Cromosómico. Y lo que vamos a hacer es
1:18:52una, lo vamos a ver de vuelta, una
1:18:54digestión parcial. Hasta ahora, cuando
1:18:57hablamos de enzima de restricción,
1:18:59pensamos que cada vez que agregamos la
1:19:01enzima corta todos los lugares que
1:19:02encuentra. Eso va a pasar si pongo
1:19:06suficiente enzima por suficiente
1:19:07cantidad de tiempo en las condiciones
1:19:09enzimáticas de la enzima adecuadas. Si
1:19:12lo pongo menos tiempo o pongo menos
1:19:14encima o pongo un buffer más o menos
1:19:16malo, va a cortar algunas veces y otras
1:19:19no. Eso se llama digestión parcial.
1:19:23Supongamos que queremos usar Ecoli, eh
1:19:25Eco R1. Eco R1 habíamos dicho que
1:19:28reconoce seis pares de bases y por lo
1:19:30tanto 4 a la 6 es 40,96. reconoce en
1:19:33promedio un sitio cada 4,096 pares de
1:19:36bases en el genoma humano. Si cortáramos
1:19:40a complexión, es decir, todo lo posible,
1:19:43tenemos potencialmente 732,000 sitios de
1:19:47corte,
1:19:48cada uno de 4000 pares de bases
1:19:50aproximadamente. Eso no me va a servir.
1:19:52Que la Eco R1 solamente funcionaba.
1:19:57La ECO R1 solo funciona eh, dicen acá,
1:20:00adentro.
1:20:02¿Qué contestamos?
1:20:05Es una enzima. Si yo la saco de coli y
1:20:07la pongo en un buffer, la encima no sabe
1:20:10dónde está.
1:20:11Lo único que sabe es que está en
1:20:13condiciones de plegarse correctamente y
1:20:15si le pongo el sustrato, lo digiero.
1:20:18Todo esto que estuvimos hablando antes
1:20:19de cortar era en el en un tubo de
1:20:22ensayos fuera de col.
1:20:24Naturalmente viene de col.
1:20:29Es lo que estoy explicando ahora. No lo
1:20:31dice todavía. Entonces, si dejara que
1:20:34corte en todos los sitios, tendría
1:20:36fragmentos de 4,000 pares de bases y
1:20:38730,000
1:20:40más o menos. ¿Entiendes por qué es
1:20:42730,000?
1:20:44Es 3 * 10 a la 9 el tamaño de un genoma
1:20:48humano aploide
1:20:51dividido 4,096.
1:20:53Si hago esa cuenta, me da 732,000.
1:20:57Es una estimación, es aproximado. Sí. No
1:21:00tengo idea cuántos sitos se corre uno
1:21:02hay en el genoma humano, pero se podría
1:21:04saber porque está secuenciado.
1:21:06Okay.
1:21:08Ahora, eso es demasiado.
1:21:11El gen de la insulina va a ser más
1:21:13grande aparte. Entonces, yo lo que
1:21:14quiero es hacer fragmentos
1:21:18que pueda usar en poner en el plásmido,
1:21:20que no sean demasiado grandes ni
1:21:22demasiado chicos, porque si no voy a
1:21:24tener que encontrar uno en muchísimos.
1:21:28¿Okay? me conviene hacer fragmentos de
1:21:3130 k par de 30,000 pares de bases.
1:21:36Para eso voy a hacer una digestión
1:21:38parcial. Voy a no dejar que la enzima de
1:21:42Corre1 trabaje hasta terminar todos los
1:21:44cortes. Lo voy a tener que regular. Voy
1:21:46a tener que hacer una apuesta. Punto.
1:21:49¿Cómo hago eso? En el laboratorio corto
1:21:52con la enzima distintos tiempos a
1:21:54distintas temperaturas y corro un gel y
1:21:56veo el ADN. Lo que voy a querer es ver
1:21:59que aparezca una banda en la zona de 30
1:22:02kalton.
1:22:04Si lo dejo cortar al máximo, va a
1:22:06aparecer una banda abajo de todo de 4000
1:22:09dependiendo del gel que haga, ¿no?
1:22:11¿Cuánta garosa ponga? Yo voy a hacer de
1:22:14tal manera que la zona de mayor
1:22:16concentración sea de 30 k y voy a cortar
1:22:19esa zona del gel de agarosa y me lo voy
1:22:21a quedar para clonar.
1:22:24¿Entendimos eso? Hago una digestión
1:22:26parcial. y me quedo con los fragmentos
1:22:29de alrededor de 30 kg de alto. Va a
1:22:32haber fragmentos más cortos y fragmentos
1:22:34más largos, pero como corro un gel y lo
1:22:36purifico, no me importa. Y como esto
1:22:39viene de miles y miles de células, van a
1:22:42estar todos los fragmentos de 30 kto
1:22:45posibles representados
1:22:47a un determinado genoma, por ejemplo, el
1:22:49de un linfocito solo que me proveyó
1:22:51ella, lo va a cortar de una determinada
1:22:54manera. Pero el otro linfocito va a ser
1:22:58cortado su ADN de otra manera, al azar,
1:23:02generando todos los fragmentos de 30 kg
1:23:05de alt posibles.
1:23:08Es decir, tengo millones de moléculas,
1:23:11tengo millones de cromosomas acá,
1:23:14los trato con la enzima Eco R1 en una
1:23:17digestión parcial. Va a cortar
1:23:20parcial en todos lados. Se van a formar
1:23:23fragmentos de acá, acá, acá, de 30
1:23:24kalton, de 30 kpes de bases en todos
1:23:27lados. Sí, cada cromosoma lo va a cortar
1:23:30en una forma diferente. Y yo me voy a
1:23:32quedar con la banda de 30 kg de alta, de
1:23:3430 kg, de 30,000 pares de bases nada
1:23:36más, ¿okay? Todos los fragmentos de
1:23:3930,000 pares de bases posibles van a
1:23:42estar representados en mi purificación,
1:23:47¿okay? Y hay muchísimas combinaciones.
1:23:50¿Por qué? Porque por cada corte va a
1:23:53haber uno a 30,000 más o menos va a
1:23:55haber un sitio de corte y después 4,000
1:23:57más para acá. Por ahí había otro corte
1:23:59que no se había usado en ese cromosoma,
1:24:01pero se usa en el siguiente que corta y
1:24:04a 30,000 habrá otro. Entonces me van a
1:24:06aparecer solapados todos los fragmentos
1:24:09de 30,000 pares de bases posibles. ¿Eso
1:24:13entendieron?
1:24:16No quiero borrar porque no lo voy a
1:24:17poder escribir.
1:24:19Supongamos que tenemos un cromosoma, un
1:24:22pedazo de cromosoma así,
1:24:24¿sí?
1:24:24Que tiene sitios de corte,
1:24:29pero vos se los limitás esos sitios de
1:24:31corte.
1:24:32Estos son los que hay de verdad.
1:24:34Y yo voy a hacerlo cortarlo de tal
1:24:36manera que corte cada 30.000 nada más.
1:24:39Por ejemplo, corta acá, corta acá.
1:24:45Se me va a acabar el pizarrón y que
1:24:47corte acá.
1:24:49Okay. Acá de todos estos sitios posibles
1:24:53cortó en estos tres nada más
1:24:55por la limitación que le pusiste,
1:24:56porque la limitación de tiempo no tuvo
1:24:58tiempo de cortar. Este es el cromosoma
1:25:03humano, por ejemplo, pero va a haber
1:25:05como son muchísimas células, va a haber
1:25:06muchos cromosomas ochos, ¿correcto? Y
1:25:09aparte es diploide.
1:25:14Acá está otro cromosoma 8o.
1:25:17A este cromosoma 8o tiene los mismos
1:25:19sitios de cortes porque es la misma
1:25:20secuencia.
1:25:22¿Correcto?
1:25:23Sí.
1:25:25Pero en este no cortó acá, cortó acá,
1:25:29cortó también acá.
1:25:31Cortó acá y cortó acá.
1:25:36Okay.
1:25:39Es decir, se forma este fragmento, no es
1:25:41de 30.
1:25:43Lo voy a perder, no me interesa. Este es
1:25:45de 30. Me voy a quedar con este y me voy
1:25:47a quedar con este y me voy a quedar con
1:25:50este y con este. ¿Ven que están
1:25:54parcialmente solapados?
1:25:55Sí.
1:25:56Cuando venga el siguiente cromosoma 8 va
1:25:57a estar cortado en otro lado. Es decir,
1:25:59que voy a tener solapados todos los
1:26:01fragmentos de 30 posibles que existen en
1:26:04el genoma humano.
1:26:05Porque hay muchos cromosom
1:26:06porque hay muchos cromosomas ocho,
1:26:08millones.
1:26:10Okay.
1:26:10Sí,
1:26:11mucho ADN tengo.
1:26:13Perdón por la palabra, pero ni en pedo
1:26:15los tenés en orden ni nada similar. Los
1:26:17tenés todos los tenés todos flotando,
1:26:19mezclados,
1:26:20ni en pedo.
1:26:22Okay, están ordenados, están todos
1:26:24flotando, todos cortados con eco R1.
1:26:27Okay. Todos los posibles. Todos los
1:26:31posibles son más de un millón. Depende
1:26:33de mi banda cuánto tolere.
1:26:37Si yo voy a purificar de mi gel,
1:26:40habíamos dicho, pónganse que estos son
1:26:4330,000.
1:26:47Okay. Voy a agarrar esta banda de acá
1:26:50que va desde 35,000 a 25,000, por
1:26:52ejemplo, más o menos. Entonces va a
1:26:55haber algunos un poco más largos, un
1:26:56poco más chicos, no me molesta.
1:26:58Dependiendo de mi tolerancia, ¿cuántos
1:27:00fragmentos hay posibles hay? Cuanto más
1:27:03tolerancia hay más fragmentos posibles.
1:27:05Supongamos que hay un millón de
1:27:07fragmentos posibles, ¿okay? Que es más o
1:27:09menos razonable.
1:27:13¿Qué es lo que dice? En algún lado lo va
1:27:15a decir bien.
1:27:17Muchísimos fragmentos, aproximadamente 1
1:27:19millón entre 25 y 35 kp pares de bases.
1:27:22Profe, entonces si us la electromprecis
1:27:25para asegurarte que tengan 30, o sea,
1:27:28para para tenerlo separado.
1:27:29Sí.
1:27:31para no tener más chiquititos que no me
1:27:34interesan, ¿okay? Porque si no ahora vas
1:27:37a ver.
1:27:38Okay, eso entendimos para ahora. Vamos,
1:27:41hago un corte parcial, me aislo la zona
1:27:43de 30 kilopes de bases y ahí hay un
1:27:46montón y están todos solapados.
1:27:49Okay. Supónganse que mi gen que quiero
1:27:52clonar
1:27:53estaba acá. Supónganse que estaba acá.
1:27:57Justo. No tengo idea en qué cromosoma
1:28:00está el gen de la insulina. Okay.
1:28:02Entonces, va a haber un fragmento que lo
1:28:03va a tener entero.
1:28:05Va a haber un fragmento que lo va a
1:28:06tener también entero. Va a haber un
1:28:08fragmento, por ejemplo, que tenga un
1:28:09pedacito de este lado y y haya quedado
1:28:11el otro costado. Okay. Pero mi frag mi
1:28:15gen va a estar en muchos fragmentos
1:28:17distintos entre sí.
1:28:19Claro.
1:28:19Okay. Lo va a contener, pero es como que
1:28:22yo agarro este fragmento la contiene
1:28:24ella, pero este fragmento también la
1:28:25contiene ella. Okay. Este ya no.
1:28:28Entonces van a estar solapados.
1:28:30Okay, mi gen va a aparecer en muchos
1:28:33fragmentos de 30 kil Dalton. Sí.
1:28:37Y también voy a tener fragmento sin
1:28:40y la mayoría no van a tener el mío. La
1:28:42mayoría no van a tener mi gen. Okay. La
1:28:45gracia, la idea es ver cómo encuentro el
1:28:47que quiero yo.
1:28:50Okay. Ahora ahí sí,
1:28:53¿cuántos cada cuántos fragmentos está el
1:28:56mío?
1:28:59Dijimos que hay un millón distintos,
1:29:01pero no es uno en un millón el que tengo
1:29:02que encontrar porque está solapado, está
1:29:05repetido
1:29:06en los cortes mi gen. Bueno, si hacen la
1:29:09cuenta, les va a dar que uno cada
1:29:12100,000
1:29:13de esos fragmentos tienen mi genio.
1:29:17Okay.
1:29:19¿Qué cuenta?
1:29:20La cuenta es
1:29:233 * 10 a la 9 dividido 30,000. Ah, okay.
1:29:27Si haces 3 * 10 a la 9 dividido 30,000,
1:29:30que es el tamaño de mi fragmento, te da
1:29:32100,000.
1:29:34100,000 es quiere decir que uno de cada
1:29:37100,000 tiene mi gente.
1:29:40El mismo, no, distintos porque están
1:29:42solapados, pero uno de cada 100,000 es
1:29:44probable que encuentre. ¿Es seguro? No,
1:29:47ahí no. Depende cómo salió el corte.
1:29:49Aproximadamente 10 fragmentos.
1:29:51Entonces, uno de cada 10, uno de cada
1:29:53100,000 es el 1000. Entonces, yo tengo
1:29:55que buscar
1:29:57uno de cada 100,000. ¿Cómo hago para
1:29:59encontrar uno de cada 100,000? Okay,
1:30:03está todo escrito ahí. Si no entendieron
1:30:05la lógica, lo explicamos de vuelta. No
1:30:07es fundamental que lo entiendan. Lo
1:30:10importante es que ahora les resulte que
1:30:12lo entendieron, aunque después se lo
1:30:14olviden.
1:30:15¿Okay? Así me creyeron y saben que
1:30:18alguna vez lo entendieron y lo van a
1:30:20poder entender de vuelta porque ya una
1:30:22vez lo entendieron. ¿Okay? Sí,
1:30:24no hace falta. A nadie les va a pedir
1:30:25que sepan esto.
1:30:28Profe, no entiendo por qué, por ejemplo,
1:30:3130
1:30:34para tener que para tener que buscar uno
1:30:36en 100,000. Si busco si fuera de 40 kg
1:30:38de altón también puede ser. Voy a tener
1:30:40que buscar menos uno en 80,000.
1:30:43Sí, pero si lo hago muy chance de que
1:30:46porque mi trabajo, ¿cuánto tengo que
1:30:48trabajar después? Depende de eso. Y hay
1:30:50otra cosa, el plásmido no puede tener
1:30:53tamaño muy grande porque la bacteria no
1:30:55lo recibe.
1:30:57Tengo un límite de cuán grandes son los
1:30:59insertos que puedo tener para que la
1:31:02bacteria se pueda transformar bien. Si
1:31:04pongo mucho más grande de 30,000 ya no
1:31:06sirve, no se transforma.
1:31:09Okay. Yo tengo que transformar a la
1:31:11bacteria con todos los plásmidos que
1:31:13vamos a hacer ahora.
1:31:18Okay. En el ejercicio anterior, lo que
1:31:20vimos en la primera parte de la clase,
1:31:21estaba clonando un inserto solo en un
1:31:25pláneo
1:31:27solo.
1:31:28Ahora necesito
1:31:30cientos de miles. Okay, más o menos
1:31:33400.000 1000 porque 100,000 estoy muy
1:31:37jugado. Si tengo solamente 100,000
1:31:39fragmentos por ahí, justo el mío está
1:31:41por en cambio si tengo 400,000 entonces
1:31:45ya tengo más probabilidades de que uno
1:31:47esté cuatro veces con
1:31:49capaz que no esté igual.
1:31:51Capaz que no esté igual
1:31:53porque el azar es así.
1:31:56Azaroso.
1:31:57Capaz que tengas más.
1:31:59Capaz que tengas más.
1:32:02Okay. Acá tenemos el brazo del donante,
1:32:05su sangre, sus linfocitos, su ADN
1:32:08cromosómico con el gen que quiero
1:32:09encontrar.
1:32:12Acá tenemos de vuelta los cortes cada
1:32:1530.000. ¿Ven que acá no están cada
1:32:1830,000? Estos están más separados que
1:32:19estos. Sí. ¿Por qué? Porque es al azar.
1:32:22Va a haber fragmentos chicos, fragmentos
1:32:23grandes, más o menos cada 30,000. Listo.
1:32:26Los voy a clonar.
1:32:29Esto ya lo dijimos.
1:32:31Bien, y ahora, ¿qué vamos a hacer?
1:32:34Agarramos toda mi digestión, la junto
1:32:37con el plásmido, como explicamos antes
1:32:39del intervalo, y agregamos
1:32:43ligaz.
1:32:45Agregamos ligaza, se liga. Y acá tenemos
1:32:48un tubo. ¿Qué tiene adentro del tubo?
1:32:53agua, plásmido, vector tiene vector
1:32:56cortado, vector inserto,
1:32:58inserto y vector con inserto ligado.
1:33:02Toda esa mezcla tiene.
1:33:03Le puse ligaza y ligué, pero bueno, va a
1:33:06quedar alguna parte sin ligar, alguna
1:33:07parte del vector se va a cerrar sin
1:33:09inserto, todo eso va a pasar. Y ahora
1:33:12entonces esto va a haber todos montones
1:33:16y montones, cientos de miles de
1:33:17vectores, todos iguales, excepto en su
1:33:21inserto
1:33:22inserto,
1:33:24aunque algunos van a tener el mismo
1:33:25inserto repetido, ¿no? También puede
1:33:28pasar eso.
1:33:32Bien. Y quiero encontrar uno de cada
1:33:35100.000 de estos,
1:33:38pero primero le tengo que poner la
1:33:39bacteria,
1:33:39¿sí? porque ahí están en un tubo nada
1:33:41más.
1:33:44Entonces, vamos a hacer una
1:33:46transformación como habíamos hablado eh
1:33:49hace un ratito.
1:33:52Hacemos la transformación de vuelta,
1:33:55transformamos la biblioteca, plaqueamos.
1:33:59Ahora plaqueamos muchas placas porque
1:34:02las colonias, ¿cuántas colonias entran
1:34:03en una placa?
1:34:05Tienen que estar separadas las colonias,
1:34:07no puede ser un cesped. Yo tengo que
1:34:10poder ver separadas las colonias,
1:34:121000, por ahí 2000 chiquititas o puedo
1:34:16usar placas más grandes que entren
1:34:18algunas más, pero necesariamente voy a
1:34:20tener que usar muchas placas. Hay unas
1:34:22placas queotas cuadradas que también se
1:34:24pueden usar. En este ejemplo vamos a
1:34:26usar placas redondas, las típicas placas
1:34:28de PT, ¿okay? Si entran más o menos
1:34:311000, 2000 colonias por placa.
1:34:35Sí, necesito un montón de placas,
1:34:39como 200 placas.
1:34:41Okay.
1:34:43Cada placa con agas y antibiótico. Sí.
1:34:46Y la transformación no es 100%
1:34:48eficiente. Mezclo bacterias con
1:34:52bacterias con ADN, con plmido. Algunas
1:34:55reciben y otras no reciben. Como está
1:34:57ejemplificado acá. En este ejemplo, la
1:34:59eficiencia, ¿cuánto es?
1:35:02¿Cuántas reciben el plásmido en ese
1:35:05ejemplo que está dibujado ahí?
1:35:06Tres
1:35:07de cuántas,
1:35:10de nu
1:35:10tres de nueve. Es decir, que con qué
1:35:12eficiencia toma
1:35:14uno de cada tres. Es decir, el 33% de
1:35:17las bacterias es una eficiencia
1:35:19altísima.
1:35:20No es solamente ilustrativa para este
1:35:22dibujo. Okay. Pero ahí hay dos tercios
1:35:25que no están recibiendo,
1:35:27que no
1:35:28reciben. Entonces vamos a hacer esa
1:35:31transformación y obtener un montones de
1:35:33placas con miles de colonias
1:35:36y las que no tienen el plasmido con la
1:35:38se mueren.
1:35:38Se mueren
1:35:40ni crecen, no las veo.
1:35:43Okay. Bien. Entonces eso ya sabemos acá.
1:35:46Acá ya está en amarillito. Era el del
1:35:49gen de la insulina, el que tiene el
1:35:51inserto del gen de la insulina que no
1:35:53sabemos cuál es. A ese es el que
1:35:54queremos detectar.
1:35:55Todavía no sab que es ese.
1:35:57No sé que es ese,
1:35:59pero digo, bueno, uno de esos lo marqué,
1:36:02lo arrastamos en amarillo para que lo
1:36:04tengan.
1:36:08Okay, lo mismo. Y después, ¿qué voy a
1:36:10hacer? Crecer el cultivo de ese que
1:36:13tengo que detectar.
1:36:15Sí. Y ya voy a tener mi tubo con mi
1:36:17plásmido, con mi genarlo que
1:36:20Pero profe, todo esto para llegar a
1:36:22obtener el gen de la insulina.
1:36:23Tremendo, ¿no?
1:36:25Pero no entiendo cómo es más fácil igual
1:36:28de atrás para adelante,
1:36:30atrás
1:36:31de atrás para adelante, obtener la
1:36:33proteína, cifrar el código de
1:36:35aminoácido, la insulina y
1:36:38¿Qué problema tiene eso? Eso está muy
1:36:40bien la pregunta. Si yo puedo secuenciar
1:36:42la proteína,
1:36:44okay,
1:36:45me va a dar la secuencia de aminoácidos.
1:36:50Igual para
1:36:54Vamos, vamos, vamos a ver
1:36:59no va
1:37:01sugiere ella es que si lugar de sacar el
1:37:03código genético directamente se puede
1:37:05una proteína o sacar una secuencia.
1:37:06Eso lo podemos hacer.
1:37:08En ese momento era difícil cuando
1:37:10originalmente es difícil secuenciar la
1:37:11proteína, pero ponerle que secuenciamos
1:37:12la proteína. Te digo entonces la
1:37:13secuencia de aminoácidos de la proteína.
1:37:15Pero el tema es que no existen varias
1:37:16secuencias genéticas para el mismo
1:37:18aminoácido. No existen varios podones.
1:37:20Es una pregunta o una afirmación.
1:37:23Un poquito de las arroz. Este,
1:37:26no podrías determinar.
1:37:27No me quiero jugar. Quiere decir eso.
1:37:29Claro, claro.
1:37:30Donde había metionina hay un solo codón.
1:37:33Estoy seguro. Ahí hab hay otros
1:37:35aminoácidos que tienen más codones que
1:37:38sirven para representar la
1:37:39hasta seis codones.
1:37:41Hasta seis. Entonces,
1:37:42algunos aminoos están codificados por
1:37:43seis codones distintos.
1:37:46Puedo hacer una secuencia de ADN
1:37:48posible, pero no sé si es la correcta.
1:37:51Ah, okay. A ver,
1:37:53aparte, por ejemplo, ¿tienen drones el
1:37:55gen de la insulina con la proteína? No
1:37:57lo sé.
1:37:59Correcto.
1:38:01¿Cómo es su promotor? No lo sé.
1:38:04O sea, necesito el código
1:38:05y el 5 prima UTR y el 3 prima UTR no
1:38:07están en la proteína, pero
1:38:10la idea de tener la secuencia de la
1:38:12proteína te dice, bueno, más o menos la
1:38:14secuencia tiene que ser algo así.
1:38:16Acá en Serina por ahí hay cuatro
1:38:18distintas codones, seis codones
1:38:19diferentes, pero bueno, algo de esto
1:38:21tienes que tener. Esto no alcanza, no te
1:38:24sirve suficiente, pero la idea está
1:38:26bien. ¿Entienden?
1:38:27Sí. Claro,
1:38:28yo no entiendo ahí cómo la separás.
1:38:31La diferencia.
1:38:32No, no te lo expliqué.
1:38:33Ah, listo.
1:38:34Todavía no expliqué cómo hacerlo.
1:38:36Como tenías los últimos dos pasos que
1:38:39no. Al final cuando lo logres
1:38:41identificar vas a hacer esto. Pero no lo
1:38:43identificamos todavía.
1:38:46¿Por qué? Porque el gen de la insulina
1:38:48no habla.
1:38:49Si hablara le diría, "Acá estoy,
1:38:51amarillo,
1:38:52acá estoy." Y tampoco viene pintado de
1:38:53amarillo. Si fuera el gen de la GFP,
1:38:56ahí
1:38:58sí que
1:39:02se vería verde,
1:39:06si yo le pongo luz azul, ¿se vería
1:39:08verde? O sea, si no se expresa,
1:39:10si no se expresa, no se va a expresar,
1:39:13¿no? Porque
1:39:13si este fuera el genoma de la agua viva
1:39:16Acuari Victoria, acuérdate que de donde
1:39:18viene la GFPo,
1:39:22pero el promotor en Cori no va a andar,
1:39:25entonces no se va a ver, solo se va a
1:39:27ver si se expresa. Vamos a ver más
1:39:31adelante de que se puede hacer si se
1:39:33expresa. Y este plásmido tenía un
1:39:35promotor. Si acá estuviera usando un
1:39:37plásmido con un promotor de bacterias,
1:39:40todo lo que clone ahí se va a expresar.
1:39:45Seguimos adelante.
1:39:50Bien, tengo todas mis placas acá, ¿okay?
1:39:53Con miles y miles de colonias, 200
1:39:56placas con 1000 a 2000 colonias por
1:39:58placa.
1:40:00Sí, lo que voy a hacer ahora es el paso
1:40:02de la transferencia. ¿Se acuerdan?
1:40:04¿Vieron Western Blood?
1:40:06¿Cómo era?
1:40:10Se transfiere el de luego de correr las
1:40:12proteínas a una membrana de
1:40:15nitrocelulosa o de nylon.
1:40:17Sí.
1:40:18¿Okay? Y se quedan pegadas ahí.
1:40:20Okay,
1:40:22acá hacemos lo mismo. Ponemos un disco
1:40:24de nitrocelulosa acá arriba sobre las
1:40:28colonias directo.
1:40:32Lo apoyo
1:40:34y con una pinza con cuidado lo levanto.
1:40:38Perdón. ¿Qué hace la nitrocelulosa?
1:40:40La nitrocelulosa es un papel al cual se
1:40:44queda pegada cosas.
1:40:46Un papamoscas.
1:40:48Okay. Se quedan pegados en este caso a
1:40:50las bacterias,
1:40:52parte de las bacterias. Una parte quedan
1:40:54acá. ¿Ven como quedó dibujado acá? Una
1:40:57especie de cráter porque yo toco con la
1:41:00colonia.
1:41:04Tengo que borrar antes de querer
1:41:05escribir.
1:41:07Borrar para
1:41:08Borro para el futuro.
1:41:23Explicar.
1:41:28Entonces tenemos la placa con las
1:41:30colonias.
1:41:33Okay,
1:41:35se ve acá pongo la membrana
1:41:38y esta parte de acá se queda pegada, la
1:41:41del medio de la colonia. La de acá no se
1:41:44queda pegada porque no toca la colonia.
1:41:47Okay.
1:41:51Entonces quedan como unos cráteres
1:41:55donde estaba la colonia. Se fue la
1:41:56colonia
1:41:58con la nitrocelulosa, pero una parte
1:42:00quedó. Es muy importante porque esto lo
1:42:03voy a destrozar para detectar dónde está
1:42:07mi genera insulina, pero después voy a
1:42:09necesitar la bacteria viva para poder
1:42:12crecerla. Okay. Entonces, esto lo tengo
1:42:14que guardar.
1:42:15El filtro de nitrocelulosa,
1:42:17las dos cosas tengo que guardar. Las
1:42:19bacterias vivas y la nitrocelulosa la
1:42:21tengo que usar ahora. Vamos a ver cómo
1:42:23por eso. Pero lo que dejas vivo para
1:42:24después agarrar las bacterias de ahí es
1:42:26el
1:42:26la placa. La placa con el ágaro.
1:42:34Okay. Bueno, se cubre con nitrocelulosa,
1:42:38se levanta con la pinza con mucho
1:42:39cuidado
1:42:42y ahora
1:42:44guardo la copia con los cráteres en la
1:42:46heladera.
1:42:48Okay. Y la nitrocelulosa la
1:42:53meto en unos buffers terribles que
1:42:56revientan las bacterias, las lisan con
1:43:00hidróxido de sodio, quedan las bacterias
1:43:03y se lava todo y queda el ADN pegado en
1:43:05la nitrocelulosa.
1:43:08Queda atrapado así, movilizado y pegado
1:43:10en la neoccelulosis. Como lo puse. El
1:43:12hidróxido de sodio aparte se
1:43:14desnaturaliza. ¿Qué quiere decir que se
1:43:16desnaturaliza? Se separ
1:43:18se separan las dos hebras quedan con sus
1:43:20gases ahí flotando,
1:43:23apoyadas, atrapados en la nutrocelulosa.
1:43:25Pobre fíjense. Imagínense el ADN.
1:43:28Okay. Bien. Y ahora después lo
1:43:31neutralizo, lo pongo de vuelta en un
1:43:33buffer normal.
1:43:35Y entonces acá tengo el ADN
1:43:38desnaturalizado.
1:43:40Una de las colonias que la pintamos de
1:43:42rojo, pero no la cono no sabemos cuál es
1:43:44todavía tiene lo que yo quiero.
1:43:48Okay.
1:43:52De vuelta. Acá quedó pegado todo el ADN,
1:43:55no el de los plásmidos, el cromosómico
1:43:57también,
1:43:59el plásmido, todo. Lo único que
1:44:01distingue a una colonia de la vecina es
1:44:03el inserto.
1:44:10Acá tenemos que recordar
1:44:13el tema de la renaturalización.
1:44:15Ustedes saben que si al ADN lo calientan
1:44:18se desnaturaliza
1:44:20y si lo enfrían de a poco, ¿qué pasa? se
1:44:23se renaturaliza.
1:44:26Okay.
1:44:27Y las condiciones de renaturalización,
1:44:30¿de qué dependen?
1:44:32De la temperatura,
1:44:34la velocidad, la que se
1:44:38la velocidad a la que va cambie la
1:44:39temperatura. Tal cual. La velocidad es
1:44:42muy importante para que se renaturalice
1:44:45bien. Si lo hago muy rápido, no se
1:44:47renaturaliza bien.
1:44:49Las soluciones concentradas de urea,
1:44:52formaldeído o formamida, ¿qué hacen?
1:44:54Que no
1:44:55naturale.
1:44:56Impiden que se renaturalice. Lo hacen
1:44:58más difícil.
1:45:00Hacen que solo las cuando muchas
1:45:03secuencia la secuencia muy muy homóloga
1:45:06se logre mantener unida. Okay.
1:45:10Si bajo mucho las concentraciones de
1:45:12sales, ¿qué estoy haciendo?
1:45:15Favorezco
1:45:17o
1:45:19impido la renaturalización. Impido la
1:45:24¿Por qué? ¿Qué pasa a baja sal? ¿Por qué
1:45:27es malo la baja sal para la hibridación?
1:45:29Porque no pantalla las cargas del ADN.
1:45:32¿Cuáles cargas?
1:45:33Las cargas relativas de
1:45:34¿De quién? Del ADN.
1:45:35De los grupos fatos.
1:45:36De los grupos fatos. Correcto. Okay. Y
1:45:39después está la cantidad de pares AT y
1:45:42CG que van a favorecer la unión o no.
1:45:44Pero eso no lo puedo controlar
1:45:46porque eso es lo que hay.
1:45:47Y si hay altas concentraciones de sales,
1:45:49¿no te afecta también?
1:45:50Claro. Acá, ¿qué se dice eso? Las
1:45:52concentraciones de sales, altas o bajas.
1:45:56Temperatura alta o baja.
1:45:58Con eso juego. Pongo más o menos. Vos
1:46:02estás levantando la mano, ¿no? Para
1:46:03sacar la foto. No más. Bien.
1:46:06Okay. Entonces, esto tenemos que tener
1:46:08en cuenta.
1:46:12Acá lo que va a pasar, ¿qué pasa si uso
1:46:16ADN que no es 100% homólogo?
1:46:20Suponente que no tenemos el genoma
1:46:22humano, pero tenemos la secuencia del
1:46:24gen de insulina de cerdo, no va a ser
1:46:27100% homólogo. Entonces, se va a formar
1:46:31una va a haber una hibridación parcial
1:46:35porque la parte climóloga va a hibridar
1:46:37y la otra parte no. Especialmente si
1:46:39juego con las concentraciones de de
1:46:41sales y la temperatura y todo para que
1:46:44se pueda unir.
1:46:46Sí, pero no sea tan tan restrictivo que
1:46:48no se una nada. porque no es 100%
1:46:50homólogo. ¿Correcto? Entonces, vamos a
1:46:53ir a una hibridación parcial.
1:47:00Ahora,
1:47:02esto lo explicaron, lo vieron ya.
1:47:06Acá está el concepto de sonda.
1:47:10Sonda es con lo como el anticuerpo del
1:47:12western blot.
1:47:14Ahora voy a usar una secuencia de ADN
1:47:17para encontrar otra secuencia de ADN. En
1:47:20el western blood uso un anticuerpo que
1:47:21reconoce la proteína de interés.
1:47:24¿Correcto? ¿Eso lo vieron o no?
1:47:26Acá voy a usar una sonda, en este caso
1:47:29una secuencia de un gen de insulina
1:47:31parecido al que estoy buscando para
1:47:34pescar la colonia que tiene el gen, el
1:47:37inserto del gen de la insulina.
1:47:40Esa sonda tiene que estar radioactiva.
1:47:43¿Qué es una sonda?
1:47:44La sonda es como si fuera el anticuerpo.
1:47:47Es la molécula que va a reconocer a
1:47:50quien yo quiero encontrar que tiene esa
1:47:53molécula alguna propiedad que a mí me
1:47:55permite detectarla. Por ejemplo, ser
1:47:57radioactiva.
1:48:00En este ejemplo de acá está así. Por
1:48:02ejemplo, acá tenemos el ADN pegado al al
1:48:04a la nitrocelulosa. Acá hay un
1:48:07rectángulo de nitrocelulosa con cuatro
1:48:09ADN doble cadena.
1:48:11Los desnaturalizo
1:48:14y ahora le agrego la sonda que tiene que
1:48:17también está desnaturalizada
1:48:19radioactiva
1:48:21que tiene el gen de la insulina
1:48:23radioactivo de
1:48:26Okay,
1:48:28me seguís
1:48:30seguro.
1:48:31No entiendo de dónde sacar la sonda que
1:48:34estáando la molécula
1:48:37de algún lado tenés que tener la sonda.
1:48:39Si acá no tenés sonda, no tenés nada.
1:48:43Tenés que conocer algo de lo que vas a
1:48:45buscar para poder encontrarlo. Lo mismo
1:48:48que en un Western Blood. Necesitas el
1:48:50anticuerpo contra la proteína que queres
1:48:52detectar. Acá tienes que tener algo
1:48:54homólogo, parecido al gen que querés
1:48:57detectar. Por ahí es un pedacito solo.
1:48:59Con 20 pares de bases alcanzas.
1:49:02No tiene que ser todo el gente. La sonda
1:49:04puede ser muy cortita. Con un cachito ya
1:49:07está, pero algo tengo que tener. Es una
1:49:09molécula de ADN. La sonda.
1:49:11La sonda es una molécula de ADN o puede
1:49:13ser de ARN también, pero me conviene de
1:49:15ADN.
1:49:20Entonces le agrego la sonda a la a la al
1:49:23tacho este, mezclo y ¿qué va a pasar?
1:49:27donde encuentre un gen, una secuencia
1:49:30homóloga, se va a quedar pegado. Luego
1:49:32lo lavo y ahí sí, depende como lo lavo,
1:49:36a cuántos lugares se puede quedar
1:49:38pegado. Si uso una condición muy muy
1:49:42permisiva, se va a pegar por ahí a
1:49:44varios lugares y si us una condición
1:49:47demasiado restrictiva no se va para
1:49:49ningún lugar como dijimos antes, porque
1:49:51la insulina de cerdo no es igual de
1:49:52humano.
1:49:56Si fuera 100% idéntico, entonces puedo
1:49:59usar la condición más restrictiva
1:50:00posible.
1:50:02Al proceso que estábamos viendo hace un
1:50:05toque,
1:50:07le haces esta hibridación con sondas y
1:50:10la hibridación parcial o una u otra.
1:50:14La hibridación parcial es esto.
1:50:16Ah, okay.
1:50:16Esto es parcial. ¿Por qué? Porque viene
1:50:19de un gen de cerdo a un ano. Entonces,
1:50:21la homología es parcial. Por eso te
1:50:24expliqué antes la hrigación parcial.
1:50:26Y esto está marcado con radioactivad.
1:50:29Puede ser marcado de otra manera
1:50:30también. Ahora hay técnicas para marcar
1:50:33los las sondas que no son radioactivas,
1:50:35¿okay? Pero la más potente es la
1:50:37radioactiva.
1:50:40Okay, estamos bien.
1:50:43Okay, entonces acá se lava, se saca y
1:50:46acá tenemos, bueno, en este ejemplo en
1:50:48particular, con una pincita agarro mi
1:50:51microcelulosa y le acerco un detector de
1:50:54radioactivo. Si está radioactivo quiere
1:50:55decir que se pegó una sonda.
1:50:58No sirve esta slide nada más que para
1:51:00recordar o para explicar el concepto de
1:51:03sonda. ¿Tos lo entendieron? sonda
1:51:07fragmento de ácido nucleico con
1:51:09homología a lo que quiero encontrar que
1:51:12viene marcado de alguna manera que yo
1:51:14pueda detectar usualmente radioactivo.
1:51:17Okay,
1:51:20eso es una sonda.
1:51:24En inglés provee.
1:51:31Acá tenemos todo el proceso.
1:51:34en una sola slide.
1:51:39Placas donde está la colonia que quiero
1:51:41detectar. Nitrocelulosa que se va a
1:51:44pegar. Nitrocelulosa que la levanto con
1:51:47la pinza, la doy vuelta. ¿Ven esta
1:51:50flecha? Es que la sonda la hago así, la
1:51:52doy vuelta y queda queda la
1:51:53nitrocelulosa mirando para arriba.
1:51:58Este ADN lo pongo en un tachito. Este
1:52:01ADN, esta nitrocelulosa la pongo en un
1:52:02tachito. Acá la ve todo. Las bacterias
1:52:04desaparecieron de acá. Acá es donde me
1:52:07tuve que quedar con una copia en
1:52:08heladera. Ojo,
1:52:11si no se perdió todo. Detecté la colonia
1:52:14y no no la tengo.
1:52:18Le agrego la sonda radioactiva. Se va a
1:52:21pegar en algún lado, no sé cuál, por
1:52:24ejemplo, acá. Pero todavía no lo sé.
1:52:28Lavo, lavo, lavo. Se despega de
1:52:30cualquier otro lado y queda pegado solo
1:52:32donde tiene máxima homología acorde a
1:52:35las condiciones de hibridación que yo
1:52:38puse.
1:52:43Ah, e no sé lo que homólogo que se
1:52:48refiere a este contexto,
1:52:50quiere decir que las secuencias son
1:52:51iguales, son homológicas. El gen de
1:52:53insulina del cerdo y el humano tienen un
1:52:55origen común en un antecesor común.
1:52:57Claro.
1:52:58Entonces el gen en un principio era
1:53:00idéntico. Luego de una determinada
1:53:02cantidad de tiempo evolutivo la fueron
1:53:05divirgiendo. La el humano fue mutando y
1:53:09de respecto del deserdo y son un
1:53:10poquitito distintos, pero son muy
1:53:12parecidos. Son homólogos porque tienen
1:53:15origen común y como tienen origen común
1:53:19tienen secuencia muy parecida. Ahora, si
1:53:22usara el gen de insulina de una especie
1:53:24más lejana, entonces cada vez hay más
1:53:27distancia y la secuencia va a ser más
1:53:29diferente.
1:53:34Lavo, lavo, lavo y me queda la placa con
1:53:37marcado radioactivo en dos lugares.
1:53:40¿Cómo lo detecto el radioactivo? Con una
1:53:41placa radiográfica,
1:53:43una placa de fotos.
1:53:46Una película sensible a la luz es
1:53:49sensible al radioactivo.
1:53:51Si vos tomas, como dijiste antes, en
1:53:53lugar de la de cerdo, algo que sea más
1:53:54lejano, eh, no se pegan directamente o
1:53:58va a ser más más grande el error.
1:54:02¿Qué opina acá el alumnado?
1:54:05Si uso una secuencia menos homóloga
1:54:09porque es más divergente, ¿se va a pegar
1:54:12o no se va a pegar?
1:54:13Algunos pedazos se van a pegar, pero vas
1:54:15a tener menor margen de precisión.
1:54:18Entonces,
1:54:20pero puede ser que no se pegue nada.
1:54:23Puede ser. ¿De qué depende?
1:54:28¿Y qué más?
1:54:31¿De cómo lo?
1:54:33¿Soy muy permisivo o no? ¿A qué
1:54:36temperatura hice la hibridación? Porque
1:54:39por ahí si lo hice a muy baja
1:54:40temperatura con muy poca homología
1:54:42alcance.
1:54:43Pero con mutocommología se va a pegar un
1:54:45montón de lugares que no tienen nada que
1:54:46ver con el gen de la insulina.
1:54:48Tengo que tener hay un equilibrio,
1:54:51¿sí?, para encontrar lo que quiero
1:54:53encontrar.
1:54:55Okay.
1:54:56Entonces, tienes que balancer Entonces
1:54:59tienes que balancer permisividad y
1:55:01precisión constantemente.
1:55:03Especificidad.
1:55:05Lo que estoy tratando es lograr la mayor
1:55:08especificidad posible que me permite la
1:55:11sonda, porque si la sonda no es
1:55:13homóloga,
1:55:14Claro.
1:55:14Bueno,
1:55:15el tema es que si son muy específicos,
1:55:16como que no se termina pegando a ningún
1:55:18lado y te sale mal.
1:55:19Ahora lo vamos a ver. Ahora vamos a ver
1:55:21el resultado real de un en un ejemplo,
1:55:24¿okay? De esto. Ahí va. Eh,
1:55:29ese es el resultado.
1:55:33Tremendo, ¿no? Tanto lío para una un
1:55:36plástico azul. Bien, acá lo que estamos
1:55:40viendo son manchas
1:55:43que eran son causadas porque la colonia
1:55:47donde se apoyó la placa, la
1:55:50microcelulosa que viene con todas las
1:55:53colonias pegadas, se le pegó la sonda
1:55:55radioactiva y cuando puse la placa
1:55:57radiográfica la puso negra.
1:56:00Ahí hay una colonia. Ahí hay una
1:56:02colonia. Pero las placas, ¿dónde están?
1:56:06¿Cómo reconozco? ¿Cómo voy a las placas
1:56:08que tengo en la heladera a partir de
1:56:09esto?
1:56:13Ahí estoy marcando
1:56:16un círculo que corresponde al disco.
1:56:18¿Cómo sé que ahí va el disco? Porque
1:56:20cuando apoyé el disco, le apoyé la placa
1:56:22radiográfica, le marqué con un marcador
1:56:25los bordes.
1:56:27Acá hice una marquita, acá hice otra
1:56:30para poder después alinearlo.
1:56:33Okay.
1:56:36Lo mismo con este, con este y con este.
1:56:42¿Qué vemos acá? cuatro discos de una
1:56:46exposición y que acá hay más puntos que
1:56:49acá, que acá y que acá. ¿Por qué?
1:56:56por las condiciones de lavado.
1:56:59Acá la ve con poca rigurosidad y quedó
1:57:02mucho pegado en varios lugares.
1:57:06En el de al lado
1:57:08la ve con más rigurosidad, acá con más
1:57:11rigurosidad y acá con demasiada
1:57:13rigurosidad.
1:57:16Acá no se ve nada.
1:57:19Recordemos las condiciones
1:57:21que uno controla para la hibridación, la
1:57:24temperatura, la sal y lo que acabamos de
1:57:26hablar. Okay. Entonces, en algún acá hay
1:57:31demasiadas colonias, acá hay más y acá
1:57:33hay justo dos por ahí. Son esas dos, no
1:57:37lo sé.
1:57:38Entonces, con uno no ves nada y con el
1:57:40otro ves demasiadas cosas y tu
1:57:41información es de menor calidad. vas a
1:57:44tener que hacer picar muchas colonias,
1:57:46hacer muchas minips y alguna tendrá el
1:57:49gen de la insulina y otras no.
1:57:53En cuestiones de temperatura, por
1:57:55ejemplo, muy riguroso que sería altas
1:57:57temperaturas,
1:57:5865 gr y e altas concentraciones de forma
1:58:04deo, por ejemplo. Y si vos crees que sea
1:58:06menos riguroso, le bajas a 55 gr, le
1:58:10sacas el forma, tanto formal de hacés
1:58:13que sea más fácil híbridar.
1:58:16¿Okay?
1:58:17Hibridar, básicamente que se junten las
1:58:19moléculas.
1:58:20Hibridar quiere decir formar enlaces de
1:58:24acuerdo a Watson y
1:58:27profe, con la baraturalizar
1:58:31lavar, me refiero a que el tachito lo
1:58:33lavas así y tirás, lavas y tirás, lavas
1:58:37y tiras. Le ponés las soluciones de
1:58:40lavado hasta que sacas todo lo que te
1:58:43parece que querés sacar y lo que se
1:58:44quedó, se quedó.
1:58:46Después lo secas y le pones la placa
1:58:48radiográfica
1:58:51como la ropa. La lavas, la lavas. Sí.
1:58:53Bueno, listo, ya está. Está blanco. En
1:58:55realidad por ahí quedó un poquito sucio.
1:58:56Bueno, hasta acá está. Okay. Parecido.
1:59:03Bien. Entonces por ahí nos podemos
1:59:06quedar con este.
1:59:10Este es el que tiene dos colonias. Y
1:59:12vamos a ver. Picamos de ahí. Ahora
1:59:15tenemos que ir con estas marcas, tenemos
1:59:18que reconocer la plaja de donde viene de
1:59:21mi la library genómica humana que
1:59:24habíamos hecho antes. Okay. Entonces
1:59:26tengo que ir
1:59:30a la placa que dejé en la heladera
1:59:32ainearla con esto, ver el caráter que
1:59:35corresponde.
1:59:37Esta es ese, esta es el otro y los
1:59:40crezco.
1:59:43¿Qué hago entonces? Pico esta que
1:59:45ponerle que sea esta y habrá otra
1:59:47amarilla que ahora la podemos marcar de
1:59:49amarillo es esta. Crezco un cultivo y al
1:59:52día siguiente
1:59:54hago una mini prepi
1:59:57maxi para hacer mucho, ¿okay? Y lo
2:00:00analizo y ahí tengo probablemente el gen
2:00:03de la insulina.
2:00:05¿Cómo sabemos si tenemos el gen de la
2:00:07insulina?
2:00:09una manera posible
2:00:12lo secuencio y me fijo si los
2:00:14aminoácidos son los de la insulina, ¿no?
2:00:18Si puedo secuenciarlo. Okay,
2:00:24tengo que analizarlo porque tengo que
2:00:25ver si había un el de insulina tiene un
2:00:27intron.
2:00:29Por suerte tiene un intron
2:00:32eh,
2:00:32un solo intr,
2:00:33sí, pero bueno, si lo estoy clonando, no
2:00:36lo sé. Todavía no lo sé, tengo que
2:00:38analizar.
2:00:39O sea, esas dos colonias que te pedieron
2:00:41tienen los fragmentos, el fragmento del
2:00:4330,000 para baseías.
2:00:45No hay. Es
2:00:48lo único error en lo que dijiste es el
2:00:50fragmento. Tienen fragmentos de 30 k
2:00:53bases que tienen lo que quería, pero no
2:00:56son el mismo fragmento.
2:00:58No, no, varios. De hecho, me conviene
2:01:00tener varios que no sean iguales porque
2:01:03los puedo comparar y obviamente la parte
2:01:05que tengan en común es la que yo quiero
2:01:10porque este está este pedazo y este
2:01:11pedazo es acá está lo que quiero.
2:01:14¿Correcto?
2:01:16Eso entiende.
2:01:19Very good. Y ahí lo estudio. Lo estudio
2:01:23para el parcial.
2:01:25Bueno,
2:01:27listo. A menos que tengan preguntas
2:01:31del todo.
2:01:31Después tenemos la clase que viene el
2:01:33martes, después tenemos el jueves y el
2:01:36viernes da clase Marcelo Rubinstein de
2:01:38animales transgénicos.
2:01:42La semana que viene tenemos clase de
2:01:45repaso
2:01:47por el parcial y después vamos a estar,
2:01:50estamos casi seguros que vamos a hacer,
2:01:52escuchen todos, presten atención. 100%
2:01:54de atención.
2:01:57Vamos a tener muy muy probablemente,
2:01:59pero seguro que se lo vamos a avisar por
2:02:01correo electrónico vía la coordinación
2:02:03de la materia el viernes
2:02:06de la otra semana una clase en este
2:02:09horario de teórica de repaso de
2:02:11seminario, porque el repaso de TP de
2:02:14teóricas es el jueves.
2:02:17Si es posible hacemos el día ese una
2:02:20clase extra de repaso de seminarios y el
2:02:22sábado es el parcial. Antes,
2:02:25si querés repasamos después del parcial.
2:02:28La semana que viene, no. La otra
2:02:29la semana que viene, ¿no? La semana que
2:02:31viene clase normal. Si si siguen las
2:02:34cosas normal.
2:02:41Hubo varias cosas que dijiste
2:02:44que no eran muy importante anotarlas y
2:02:46todo. ¿Qué es lo más importante?
2:02:51O sea, entender, puedo entender todo,
2:02:54Pero

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