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Seminario 2A: técnicas utilizadas para el estudio de proteínas- Gabriel Scicolone — Transcript

by Biología Molecular y Genética FMED - UBA · 10,545 words · 1,943 segments · language es · Watch on YouTube

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0:01Buen día. Mi nombre es Gabriel Cicolone,
0:03soy profesor de biología molecular y y
0:06genética de la Facultad de Medicina de
0:09la UVA. Estoy acompañado acá por Sofía
0:12Martín y vamos a hablar sobre el segundo
0:15seminario de biología molecular y
0:18genética referido a las técnicas
0:21de que nos sirven para analizar
0:24proteínas y ácidos nucleicos. Voy a
0:45compartir. Entonces, durante la charla
0:48de hoy vamos a ver la primer parte de
0:51este seminario, es decir, el conjunto de
0:53estudios que nos permiten detectar,
0:55caracterizar, cuantificar, localizar y
0:57estudiar las funciones de las proteínas.
1:00En una segunda parte vamos a hablar
1:03sobre las técnicas que nos permiten
1:05estudiar los ácidos
1:06nucleicos.
1:08Entonces, como un esquema representativo
1:11de la clase, como una forma de poder eh
1:15clasificar estas técnicas de acuerdo a
1:18cómo se obtienen las muestras, recuerden
1:21que siempre nosotros nos ponemos en el
1:23lugar del científico, en el cual
1:25trabajamos con modelos experimentales, y
1:28en el lugar del médico que recibe a un
1:31paciente. En cualquiera de estos dos
1:33casos se pueden requerir muestras para
1:36realizar estudios. En este caso,
1:38estudios para analizar eh proteínas.
1:42Por ejemplo, podemos
1:45obtener muestras como autopsias,
1:49biopsias, elementos formes de la sangre
1:51o células en
1:53cultivo, de las cuales conservamos la
1:58estructura para poder observarlas
2:01microscópicamente luego de haberle
2:02aplicado alguna técnica que nos permita
2:05analizar las proteínas. por ejemplo, las
2:08técnicas de inmunocitoquímica o
2:11inmunoflorescencia, la visualización de
2:13proteínas
2:15fluorescentes. Por otro lado, podemos
2:18obtener esas muestras y si no queremos o
2:22no necesitamos conservar la estructura,
2:24esas muestras como por ejemplo la de
2:26plasma o el tejido
2:29homogeneizado, podemos
2:31utilizarlas para analizar luego de
2:35purificar alguna fracción o purificar
2:37proteínas, podemos utilizarlas para
2:40analizar esas proteínas sin conservar la
2:44estructura a través de estudios
2:46bioquímicos. Por ejemplo, podemos
2:48estudiar proteínas individuales o
2:51podemos estudiar el conjunto total de
2:54proteínas de un sistema biológico, que
2:56puede ser una célula o un tejido. Dentro
2:59de las proteínas de dentro de los
3:02estudios de proteínas individuales,
3:04podemos aplicar el western blot, la
3:07cristología de rayos X y la
3:09espectrometría de resonancia magnética
3:11nuclear. Y dentro de las técnicas que
3:14nos permiten analizar el conjunto de
3:16proteínas de un tejido o de una célula,
3:19se encuentran las técnicas de proteómica
3:21que tienen como elemento central a la
3:23espectrometría de masas.
3:27En la clase de hoy vamos a hacer
3:29hincapié en las técnicas de análisis de
3:33proteínas, específicamente la
3:35inmunoistoquímica y la
3:38inmunofluorescencia, el western
3:41blot, la citometría de flujo que en
3:43realidad no es una técnica de análisis
3:45de proteína, pero puede utilizar el
3:47análisis de proteínas para analizar
3:49características de células. Y por
3:51último, la técnicas de proteómica que
3:55nos permiten analizar el conjunto total
3:57de proteínas de un sistema
4:02biológico. Otra forma de poder
4:05clasificar a las técnicas es considerar
4:08cómo se relacionan
4:10con la expresión génica, aquellas
4:13técnicas que nos permiten analizar ADN,
4:16ARNs y proteínas.
4:19Estas últimas son las que vamos a tratar
4:21hoy, fundamentalmente inmunoistoquímica
4:24y
4:25fluorescencia. Western Blot. Vamos a
4:27mencionar la citometría de flujo que que
4:30puede ser una puede utilizar el
4:32fundamento de la reacción antígeno
4:35anticuerpo, al igual que la
4:37inmunistoquímica y el western. Y por
4:39último vamos a hablar de la
4:44proteónica. Tanto la inmuno
4:48citoquímica como el
4:51inmunoblot utilizan como fundamento la
4:53reacción antígeno anticuerpo para
4:56reconocer una proteína específica.
5:00Para esto entonces debemos saber qué es
5:03un antígeno y qué es un
5:05anticuerpo. Un antígeno que está
5:08representado acá en los gráficos es toda
5:13compuesto, generalmente una
5:14macromolécula o un microorganismo que
5:17introducido en nuestro cuerpo produce
5:19una respuesta inmune. En este caso, el
5:23antígeno está representado por una
5:25bacteria, pero el antígeno también
5:26podría ser una proteína.
5:29Entonces, cuando un antígeno ingresa
5:32nuestro cuerpo, es reconocido por
5:35células llamadas presentadoras de
5:37antígeno y por
5:40linfocitos que tienen como receptores en
5:44su
5:45membrana anticuerpos.
5:48Entonces, ese antígeno es reconocido por
5:50células presentadoras de antígeno como
5:52los macrófagos, que se lo presentan a
5:55linfocitos que son reguladores de la
5:57respuesta
6:00inmune. Los linfocitos B que tienen
6:03anticuerpos en su superficie reconocen a
6:06este antígeno porque tienen anticuerpos
6:09que tienen una porción variable que
6:11reconocen antígenos específicos.
6:14Entonces estos linfocitos B que
6:17reconocen a un
6:19antígeno, por un lado reciben la señal
6:22de ese antígeno y por otro lado la señal
6:25del otro linfocito, el linfocito
6:28ayudador o gelper que
6:30estimula la respuesta de este linfocito
6:34a este antígeno. Como respuesta este
6:38linfocito B que tiene anticuerpos en su
6:41superficie que se han unido en forma
6:44específica al antígeno, proliferan y se
6:47diferencian en dos poblaciones
6:49celulares. Un clon de células B de
6:53memoria que siguen teniendo anticuerpos
6:55en su superficie y que recorren el
6:58cuerpo durante mucho tiempo como para
7:02estar para vigilar si llega a entrar
7:04nuevamente ese antígeno. y otro grupo de
7:06células llamadas
7:08plasmocitos que van a sintetizar y
7:10secretar estos
7:12anticuerpos. Es decir, los linfocitos B
7:15y los linfocitos B memoria tienen en su
7:18superficie anticuerpos que reconocen a
7:22los a un antígeno
7:24específico, mientras que los plasmocitos
7:28tienen una vida más corta y secretan
7:31esos anticuerpos para neutralizar a esos
7:34antígenos.
7:35Esto representa en forma muy general y
7:39básica en qué consiste la respuesta
7:43inmune a través de la producción de
7:45anticuerpos por medio de los plasmocitos
7:47o células plasmáticas.
7:50Nosotros nos vamos a centrar entonces en
7:53este fenómeno, en la respuesta, en la
7:55unión entre el anticuerpo y el antígeno,
7:58que puede ser utilizado para localizar
8:01proteínas en un tejido. Las proteínas
8:04que vamos a querer localizar van a
8:06cumplir el papel de antígenos.
8:11[Música]
8:29la tenemos un esquema de un
8:32anticuerpo. Un anticuerpo es una
8:35glicoproteína formado por cuatro cadenas
8:39poliptídicas, dos cadenas largas y dos
8:42cadenas cortas.
8:45Cada una de estas cuatro
8:47cadenas tienen una porción constante que
8:52está representada en azul y una porción
8:55variable que
8:57está representada en
9:00amarillo. La porción constante de las
9:02cadenas largas son las que se unen a la
9:05membrana plasmática en los linfocitos y
9:07que quedan sueltas cuando son secretadas
9:10por los plasmocitos.
9:13Las porciones
9:15variables son diferentes en cada tipo de
9:20anticuerpo y son las que reconocen al
9:25antígeno. Cada linfocito B tiene en su
9:29superficie un anticuerpo con una porción
9:32variable específica que reconoce
9:34solamente a un determinante antigénico.
9:38Es
9:39decir, todas las poblaciones de
9:42linfocitos que tenemos linfocitos B en
9:44nuestro
9:45cuerpo, cada clon, cada conjunto de
9:49linfocitos que se originan de uno común
9:51tienen en su superficie un anticuerpo
9:55con una porción variable específica que
9:57reconoce solamente a un determinante
9:59antigénico, es decir, que es específico
10:02de ese determinante antigénico.
10:13Acá tenemos un esquema de un antígeno,
10:16una macromolécula que podría ser una
10:19proteína. Cada proteína en realidad
10:22dijimos que funciona como un antígeno
10:25porque inicia una respuesta inmune
10:27cuando ingresa a un organismo
10:30extraño, a un organismo distinto al que
10:33le dio
10:34origen. Dentro de esa proteína hay
10:37distintas porciones que pueden ser
10:40reconocidas por distintas porciones
10:43variables de distintos anticuerpos.
10:46Cada una de estas porciones que están
10:48representadas en colores distintos se
10:50llaman epitopes o determinantes
10:53antigénicos. Y cada epitopio
10:56determinante antigénico es reconocido
10:58por un anticuerpo específico, por la
11:00porción variable de un anticuerpo
11:02específico. Y cada anticuerpo específico
11:05que reconoce a cada determinante
11:07antigénico se encuentra en la superficie
11:10de un linfocito B específico. ¿Qué
11:13significa esto?
11:18que al ingresar a nuestro cuerpo un
11:22antígeno que puede ser una macromolécula
11:25como una
11:26proteína, puede ser reconocido por
11:28muchas, muchos tipos de linfocitos B que
11:31tienen distintos anticuerpos en su
11:33superficie con distintas porciones
11:36variables en cada uno de ellos.
11:47Disculpen, pero me está
11:48fallando el progreso de
11:51la de las diapositivas.
11:54Estoy un poco más
12:08lento. Volviendo a la imagen
12:14anterior.
12:17Entonces, este esquema representa cómo
12:20se pueden producir anticuerpos.
12:24Nosotros utilizamos en el laboratorio
12:27conejos, por ejemplo, un animal al cual
12:30se le inchenta una solución con un
12:33antígeno, con una una proteína.
12:38El antígeno tiene varios determinantes
12:43antigénicos y es reconocido por
12:47distintos linfocitos B, cada uno de los
12:50cuales tiene un anticuerpo específico
12:53para cada uno de estos determinantes
12:55antigénicos. Como consecuencia de esto,
12:59al ingresar en el cuerpo el
13:01antígeno, el
13:03conejo del conejo es reconocido por
13:08distintos linfocitos
13:10B. Estos linfocitos B se estimulan y
13:13proliferan dando origen a células de
13:16memoria y a
13:18plasmocitos. Entonces, vamos a tener
13:20distintos clones. Un clon es un conjunto
13:23de células que se originan de una célula
13:25original que tienen las mismas
13:28características. Cada clon de linfocitos
13:30B se origina de un linfocito B que
13:33reconoce a un determinante antigénico.
13:35Por lo tanto, como cada antígeno tiene
13:37varios determinantes antigénicos, va a
13:40estimular la proliferación de muchos
13:43clones de linfocitos B. Entonces, como
13:46consecuencia del ingreso del antígeno en
13:48el cuerpo, se producen muchos clones de
13:52linfocitos B, cada uno de los cuales
13:55tiene un anticuerpo que reconoce a uno
13:58de los determinantes antigénicos del
14:00antígeno. Por lo
14:03tanto, los plasmocitos que se produzcan
14:06van a sintetizar anticuerpos
14:08solubles. Como consecuencia de esto,
14:11vamos a tener distintos anticuerpos que
14:14reconocen a distintos determinantes
14:16antigénicos del mismo
14:18antígeno. Es
14:20decir, que se activan y se forman muchos
14:24clones de
14:26plasmocitos que
14:28sintetizan distintos anticuerpos que
14:31reconocen distintos determinantes
14:33antigénicos. Es decir, que se obtiene un
14:37suero con
14:39anticuerpos policlonales, es decir,
14:41anticuerpos que provienen de distintos
14:43clones de plasmocitos.
14:47Uno para obten para obtener en el
14:49laboratorio estos anticuerpos obtiene la
14:52sangre, se precipita la los glóbulos y
14:55se queda con el plasma donde están los
14:57anticuerpos y obtiene anticuerpos
15:01policlonales, es decir, anticuerpos
15:03originados en
15:05distintos clones de linfocitos B y
15:08plasmocitos.
15:10Luego esos
15:11anticuerpos los vamos a utilizar para
15:14detectar la proteína de interés, que
15:17tiene que ser esta proteína, la que
15:20sirvió de antígeno, la vamos a querer
15:24localizar en el tejido o en la célula.
15:27De esta forma uno puede obtener
15:29anticuerpos
15:32policlonales. Ahora
15:35bien, otra forma, otro tipo de
15:38anticuerpo son los anticuerpos
15:40monoclonales. Los anticuerpos
15:42monoclonales son aquellos que están
15:44dirigidos a un solo determinante
15:46antigénico, el anticuerpo. ¿Cómo se
15:49obtienen?
15:51Se inyecta el antígeno, que tiene varios
15:54determinantes antigénicos, en un animal.
15:57Lo más frecuente para producir
15:59anticuerpos monoclonales es utilizar
16:01ratones. El ratón entonces produce
16:04distintos
16:05clones de plasmocitos, de linfocitos B y
16:10plasmocitos que sintetizan entonces
16:13distintos anticuerpos.
16:16se obtienen
16:19estos estos linfocitos B y
16:22plasmocitos y se los separa. Nos
16:26quedamos con distintos plasmocitos que
16:30provienen de este de la sangre de este
16:33ratón, es decir, con distintos clones. Y
16:36cada uno de esos clones se lo fusiona en
16:40cultivo con una célula tumoral. La
16:42fusión entre dos células de origen
16:44distinto da origen a un
16:47hibridoma. Como consecuencia de esto,
16:50vamos a tener en cultivos
16:53hibridomas. Dentro de cada placa de
16:55cultivo vamos a tener un solo hibridoma
16:58que
17:00sintetiza un solo tipo de anticuerpo.
17:03¿Por qué se producen los hibridomas? Por
17:05dos motivos. Uno, para conservar las
17:09propiedades de la del plasmocito,
17:11desintetizar y secretar
17:15anticuerpos y
17:17dos para obtener un tipo celular
17:20inmortal. ¿Por qué? Porque las células
17:22tumorales son inmortales, pueden
17:24proliferar durante mucho tiempo.
17:25Entonces, yo puedo tener un cultivo
17:27celular en el cual estimulo la
17:31proliferación de estas células, de estos
17:33hibridomas, durante mucho tiempo.
17:36Entonces, estos hibridomas que se
17:38mantienen a lo largo del tiempo, los
17:41puedo congelar y luego volver a
17:44reutilizar, tienen la propiedad de ser
17:47inmortales debido a su origen tumoral.
17:51y tienen la capacidad de sintetizar
17:53anticuerpos debido a su origen a partir
17:56de los linfocitos B. De esa forma, en el
17:59sobrenadante del medio de cultivo
18:02obtengo anticuerpos. Estos anticuerpos
18:04que obtengo son todos iguales. ¿Por qué?
18:07porque provienen del mismo
18:09clon, entonces obtengo anticuerpos
18:14monoclonales. De esta forma en el
18:17laboratorio se pueden obtener
18:19anticuerpos policlonales y anticuerpos
18:22monoclonales. Los anticuerpos
18:24policlonales son anticuerpos
18:28con distintas porciones variables que
18:31reconocen distintos determinantes
18:34antigénicos epitopes del
18:36mismo antígeno, mientras que los
18:39monoclonales son anticuerpos de un solo
18:42tipo con una sola porción
18:45variable que reconocen a un solo
18:48determinante antigénico de ese
18:51antígeno De esta forma
18:55entonces se
18:57obtienen anticuerpos.
19:00Yo voy a utilizar esos anticuerpos para
19:04localizar ese antígeno en el tejido de
19:14estudio. Vamos
19:16entonces a describir la técnica de
19:20inmunoistoquímica o
19:23inmunofluorescencia. ¿En qué consiste la
19:26técnica de inmunoistoquímica?
19:29Es una técnica que me permite localizar
19:32en el tejido la ubicación, la
19:36distribución de un componente, en este
19:39caso una
19:40proteína. ¿Cómo es que localizo a esa
19:44proteína en el tejido?
19:48mediante la reacción antígeno,
19:51anticuerpo, yo estoy buscando una
19:54determinada proteína, por ejemplo, la un
19:58receptor de membrana de puede ser el
20:01receptor del factor de crecimiento
20:04epidérmico que se encuentra en la
20:06membrana plasmática de algunos tipos
20:08celulares. Yo quiero saber en el tejido
20:11que voy a estudiar si se encuentra ese
20:14receptor y cómo está distribuido en el
20:17tejido, o sea, cuántas células y qué
20:19células del tejido lo poseen. Y además,
20:23en qué posición, en qué ubicación, en
20:25esa célula se encuentra esa proteína.
20:28¿Cómo lo voy a detectar? Con anticuerpos
20:31cuya porción variable reconozcan algún
20:34epitope de esa proteína. esa proteína va
20:37a tener muchos epitopes. Entonces, si yo
20:40utilizo anticuerpos
20:42policlonales, varios clones de ese
20:46anticuerpo van a
20:50reconocer a distintos determinantes
20:53antigénicos de esa misma
20:55proteína, mientras que si uso
20:58anticuerpos monoclonales van a reconocer
21:01a un solo determinante antigénico de esa
21:03proteína. Pero utilizando anticuerpos
21:06policlonales o
21:10monoclonales, voy a localizar la misma
21:12proteína. ¿Sí? Entonces, la proteína
21:16está en el tejido y yo agrego un
21:19anticuerpo contra esa proteína. Puede
21:22ser el anticuerpo monoclonal o
21:25policlonal, que el pol caso de
21:27policlonal reconoce muchos determinantes
21:31antigénicos de la misma proteína y si es
21:32monoclonal a un solo determinante
21:34antigénico de esa proteína. Entonces,
21:37para yo
21:38poder realizar la técnica de
21:41inmunoistoquímica o
21:42inmunocitoquímica, debo preservar el
21:45material, es decir, debo obtener una
21:47muestra de tejido, conservar la
21:50estructura, para eso la tengo que fijar,
21:52es decir, le tengo que agar una
21:53sustancia que produzca la muerte de las
21:56células en forma rápida y que conserve
21:59la estructura.
22:01Luego de eso, si es un una porción de
22:04tejido obtenido por biopsia o obtenido
22:07por autopsia, debo endurecerlo para
22:10poder cortarlo en fetas finas, en
22:12rodajas finas, para que puedan ser
22:14atravesadas por la luz del
22:17microscopio. Entonces se incluye, se
22:22corta y una vez que he obtenido petas
22:25delgadas del tejido, entonces los puedo
22:28someter al procedimiento de
22:30inmunoistoquímica.
22:32Entonces, en ese corte yo voy a tener el
22:35antígeno que estoy buscando, en este
22:38caso el receptor del factor de
22:40crecimiento
22:41epidérmico. Entonces yo le agrego el
22:43anticuerpo para que reaccione. En este
22:46caso, el anticuerpo está representado en
22:48amarillo y el antígeno, el receptor del
22:52factor de crecimiento epidérmico en
22:54gris. El anticuerpo se va a unir
22:57solamente a esta proteína y no a las
22:59otras proteínas. Entonces, yo voy a
23:02poder ver dónde está el
23:05anticuerpo. Ahora bien, para poder ver
23:08dónde está el anticuerpo, el anticuerpo
23:10tiene que estar marcado con alguna
23:14sustancia que yo pueda ver con el
23:16microscopio óptico. Entonces, ese
23:19anticuerpo puede estar marcado, puede
23:21tener
23:23pegado una sustancia que tenga color.
23:27Entonces, con un microscopio óptico,
23:29viendo con campo claro, yo puedo ver
23:32dónde están ubicados los anticuerpos que
23:34se unieron al antígeno, porque veo zonas
23:37de color.
23:41Otra forma que yo pueda localizar a ese
23:44anticuerpo es si le coloco un
23:46fluorocromo. Un fluorocromo es una
23:48sustancia, una molécula que al ser
23:51excitada por radiaciones
23:54electromagnéticas del menor longitud de
23:57onda que el espectro visible, es decir,
23:59luz
24:01ultravioleta, es excitada con luz
24:04ultravioleta y emite una radiación
24:06electromagnética que está en el campo
24:08visual, es decir, la puedo
24:10ver esa forma. Yo, por ejemplo, excito a
24:14ese fluoccromo con luz ultravioleta y
24:17puede emitir una radiación de color rojo
24:21o de color verde o de color azul. Y yo
24:24lo puedo ver entonces en un microscopio
24:26de epiflorescencia. Un microscopio de
24:28prifforcencia es un microscopio óptico
24:31que tiene anexado una fuente que emite
24:35luz ultravioleta o
24:37luz
24:39azul que excita a ese fluorocromo. Ese
24:43fluocromo emite luz en un determinada
24:45longitud de onda y yo la puedo ver con
24:49el
24:52microscopio.
24:54Entonces, este
24:55esquema, que estoy marcando ahora,
24:58representa al antígeno que está en el
25:01tejido, al factor de crecimiento
25:04epidérmico, al receptor del factor de
25:06crecimiento
25:07epidérmico, a el anticuerpo que se
25:11produjo en el laboratorio y que se
25:14obtiene, uno lo puede comprar.
25:17ese anticuerpo que yo compro puede estar
25:20marcado entonces con un fluorocromo.
25:22Entonces, cuando yo agrego el anticuerpo
25:25al tejido, se va a unir al antígeno y yo
25:28si tiene puesto un fluorocromo y vi esto
25:30un microscopio de epiflorescencia, lo
25:33voy a ver fluorescente la zona donde
25:36está el anticuerpo unido con el
25:40antígeno. y coloco una sustancia que sea
25:44tenga color, lo puedo ver con el
25:45microscopio óptico viendo con campo
25:51claro. Ahora bien, fíjense que esta
25:56reacción se da entre el antígeno y el
25:59anticuerpo y yo debería marcar a todos
26:02los anticuerpos que quiero utilizar para
26:04hacer la inmunoistoquímica.
26:07Esto es bastante eh caro y dificultoso
26:11porque debo marcar a todos los
26:12anticuerpos que puedo que quiero
26:14utilizar. Una forma más económica y que
26:17permite una mayor amplificación de la
26:19señal es utilizar la
26:23inmunoquímica
26:25indirecta. La directa es la que describí
26:27recién. La indirecta
26:30es, utilizo un anticuerpo primario que
26:32está representado en amarillo, que no
26:34está
26:35marcado, pero en el
26:39laboratorio ese anticuerpo primario que
26:42yo compré se utilizó para inyectarlo en
26:45otro animal. Por ejemplo, este
26:47anticuerpo es un anticuerpo
26:49monoclonal producido en ratón. Entonces,
26:52si yo lo inyecto en un conejo, ese
26:54conejo va a reconocer ese
26:56anticuerpo como un antígeno. Entonces,
26:58va a
26:59producir anticuerpos contra
27:03ese
27:04anticuerpo y va a reconocer generalmente
27:07la porción
27:09constante. Entonces, yo obtengo
27:11anticuerpos
27:14secundarios, yo puedo marcar a esos
27:16anticuerpos secundarios de la forma que
27:18había marcado al anticuerpo primario de
27:21la inmunoistoquímica directa y de esa
27:23forma
27:25yo tengo el tejido, le agrego el
27:27anticuerpo primario que compré, que no
27:29está marcado y luego le agrego el
27:32anticuerpo secundario que está marcado,
27:34que también compré, que va a reconocer
27:36solamente a los anticuerpos producidos
27:39en la especie
27:42que cuya cuya el anticuerpo producido en
27:46la primera especie, es decir, en ratón
27:49en este caso, que fue reconocido por los
27:51anticuerpos secundarios que me produjo
27:54el conejo. Entonces este anticuerpo
27:56secundario que está representado en
27:58violeta es un anticuerpo
28:01secundario contra anticuerpo de ratón y
28:05este segundo es el que está marcado.
28:08Entonces, yo voy a reconocer la reacción
28:10antígeno anticuerpo entre el antígeno y
28:13el anticuerpo primario y después la
28:15reacción antígeno anticuerpo entre el
28:17anticuerpo primario y el anticuerpo
28:20secundario a través de la fluorescencia
28:23o del color del anticuerpo secundario
28:27marcado. A la primer metodología se la
28:30llama
28:32inmunoistoquímica directa y a la segunda
28:35inmunoistoquímica indirecta.
28:38Sí, yo esto lo puedo hacer en
28:41corte, también fijar células en
28:45cultivo para conservar la estructura.
28:47Como son células finitas, las puedo
28:50observar directamente en microscopio y
28:51no necesito cortarlas. Entonces, le
28:53puedo agregar directamente el anticuerpo
28:55marcado y hacer un
28:58inmunoistoquímica directa. O puedo
29:00agregar el primario y el secundario
29:02marcado y hacer una inmunoistoquímica
29:04secundaria.
29:08La
29:09inmunocitoquímica entonces o la
29:13inmunoioquímica es una metodología que
29:15me permite
29:16reconocer proteínas u otras
29:19macromoléculas relacionadas como
29:22glicoproteínas en un tejido o en una
29:26célula a través de la reacción antígeno
29:28anticuerpo. La reacción antígeno
29:30anticuerpo es la que me da la
29:32especificidad para saber que yo lo que
29:34estoy viendo es esa proteína y no otra
29:36proteína, porque ese anticuerpo que yo
29:38compré, que se obtuvo en un
29:42animal, va a reconocer solamente a esta
29:45proteína y no a
29:46otras. Entonces, me va a permitir
29:48identificar en el tejido o en la célula
29:51a esa proteína.
29:56se llama desde el punto de vista
29:57estricto, uno habla de
29:59inmunoistoquímica, si está detectando la
30:02ubicación, la distribución del antígeno,
30:05o sea, de la proteína o glicoproteína
30:07que quiero
30:08estudiar en el contexto de un
30:10tejido. Por eso es inmuno, porque se
30:13basa en la reacción antígeno,
30:14anticuerpo,
30:16Histoquímica, porque lo observo dentro
30:19del
30:22tejido. Se llama
30:26inmunocitoquímica cuando yo lo que
30:28quiero ver es la ubicación dentro de una
30:30célula, por ejemplo, en células en
30:34cultivo. Pero habitualmente uno utiliza
30:37en forma indistinta la terminología
30:40inmunocitoquímica,
30:42inmunoistoquímica.
30:44¿Sí? Y cuando hablo de
30:48inmunoflorescencia, la
30:49inmunofluorescencia es un tipo de
30:52inmunoistoquímica o inmunocitoquímica en
30:54la cual el elemento que me sirve para
30:58identificarlo es un fluorocromo, por lo
31:00tanto lo tengo que ver con un
31:01microscopio de fluorescencia.
31:04Entonces,
31:06inmunoistoquímica es la metodología que
31:09me permite reconocer en un tejido o en
31:12una célula ubicación de un antígeno, de
31:15una proteína específica a través de la
31:18reacción antígeno anticuerpo. ¿De qué
31:21forma lo detecto? mediante el color de
31:23una sustancia que esté acoplada al
31:25anticuerpo, primario o
31:28secundario. En ese caso hablamos de
31:31inmunoistoquímica o
31:33inmunocitoquímica. O lo puedo reconocer
31:35a través de un fluorocromo que está
31:37unido al anticuerpo primario o
31:39secundario y entonces hablamos de
31:41inmunoflorescencia.
31:43La inmunoistoquímica o inmunocitoquímica
31:46en forma global o la inmunofluorescencia
31:48en forma específica pueden ser directas
31:52si el anticuerpo primario es el que está
31:54marcado o indirectas si el anticuerpo
31:58secundario es el que está
32:02marcado. Fíjense acá tenemos un ejemplo,
32:07varios ejemplos de inmunofluorescencia.
32:10Acá tenemos células en
32:13cultivo y observamos
32:16fluorescencia. Utilizamos un anticuerpo
32:20secundario marcado con un fluorocromo
32:23verde. Entonces vemos que la mayor
32:27cantidad de la fluorescencia está en la
32:28periferia de la
32:31célula. Está ubicado en la membrana
32:33plasmática. Estamos viendo entonces una
32:36inmunofluorescencia en cultivos
32:38celulares donde veo que la molécula se
32:42localiza, la molécula en estudio, que
32:45podría ser el receptor del factor de
32:47crecimiento epidérmico, se localiza en
32:49la membrana plasmática.
32:51En este segundo caso, yo utilizo un
32:54anticuerpo para detectar una proteína
32:55que se encuentra en las mitocondrias y
32:58entonces ubico dentro de las
33:00células esa proteína en las
33:03mitocondrias. En este caso, en el tercer
33:05caso, tenemos
33:07proteínas nucleares. Utilizo anticuerpo
33:10específico para esa proteína nuclear.
33:12Podría ser un factor de de un factor de
33:14transcripción. Y entonces me marca su
33:17ubicación en el núcleo celular.
33:20Acá tenemos otra que se encuentra en el
33:22citoplasma alrededor de la envoltura
33:24nuclear. Acá tenemos otra que se
33:27encuentra distribuida en el
33:29citosol y acá otra proteína en el
33:32retículo
33:34endoplasmático. Estamos utilizando
33:35microscopía óptica observada con
33:39fluorescencia. Fíjense que cuando yo
33:41observo la inmunofluorescencia, el fondo
33:44es negro y solamente
33:46veo
33:48fluorescente donde está la reacción
33:51antígeno
33:52anticuerpo. Un detalle que yo no les
33:54dije de la técnica es que luego de de
33:56agregar el
33:58anticuerpo, el anticuerpo se únese
34:01específicamente al antígeno y luego se
34:04hacen lavados para sacar todo el
34:06anticuerpo que quedó unido en forma
34:08específica. Entonces, yo voy a ver
34:11después ese
34:14anticuerpo unido específicamente al
34:17antígeno que quiero
34:19detectar. Fíjense que en esta con esta
34:23microscopial de
34:24epiflorescencia yo observo todas las
34:27todo el grosor de la célula. Entonces,
34:29me dificulta un poco ver la ubicación
34:32específica
34:35de el antígeno o la proteína.
34:40Para solucionar este problema se
34:42utilizan algunos microscopios llamados
34:44confocales que permiten hacer foco en un
34:46solo plano y entonces eliminar la imagen
34:50que está por arriba y por
35:01debajo.
35:02Fíjense, esta es una foto de
35:05microscopía obtenida con un microscopio
35:07confocal, en el cual se observa la
35:11fluorescencia emitida por el fluoccromo,
35:14pero se eliminan los planos que están
35:15por arriba y por debajo. Y en este caso
35:19se han utilizado un anticuerpo
35:23contractina cuyo anti hecho en ratón y
35:26un anticuerpo contra una enzima, la Cox
35:284 que está hecho en conejo. Entonces, yo
35:31puedo utilizar dos anticuerpos
35:33secundarios distintos, uno contra
35:35anticuerpos de ratón y otro anticuerpos
35:37de conejo. Uno marcado con un
35:39fluorocromo rojo y otro marcado con un
35:41fluorocromo
35:43verde. Entonces, en la imagen vemos la
35:47actina en los filamentos de actina en
35:49rojo y esta enzima distribuida alrededor
35:53del núcleo en color verde. en color azul
35:57veo el ADN que lo detecto mediante un
36:00fluorocromo que introduzco en el tejido
36:04y que se une al ADN. Entonces podemos
36:07ver con la microscopía confocal
36:09solamente la imagen en un plano.
36:12Eliminamos las imágenes que están por
36:13arriba y por debajo y podemos ver en
36:16azul dónde está el ADN, en verde donde
36:20está la proteína cox 4 y en rojo donde
36:24está la alfa actina que forma parte de
36:28los filamentos de actina.
36:31Acá tenemos un
36:33esquema que nos muestra la
36:36proteína, el
36:41anticuerpo, en este caso marcado con un
36:44fluorocromo que emite la señal que yo
36:46estoy observando aquí. Este caso es una
36:49inmunofluorescencia directa porque el
36:51anticuerpo primario es el que está
36:53marcado.
37:24Acá tenemos otro
37:27ejemplo. Sí, en azul está marcado con
37:30dapi, el ADN. En rojo
37:34marcamos la proteína que es 67, que está
37:37marcando las células que están en
37:38proliferación y en verde la
37:43tubulina. Esto es otra
37:45inmunofluorescencia observado con un
37:47microscopio con focal.
37:50Y acá
37:53tenemos utilizado el mismo anticuerpo
37:56primario, pero que en este caso está
37:58reconocido por un anticuerpo
38:00secundario que tiene una
38:02enzima. Esta enzima es la peroxidasa de
38:06rábano. Entonces, ¿cómo es que yo
38:08identifico a este anticuerpo secundario?
38:10En este caso, el anticuerpo secundario
38:12no tiene un nido, una sustancia que
38:14tenga el color en forma directa, tiene
38:16una enzima. Entonces, ¿cómo yo voy a
38:19localizar esta reacción antígeno
38:22anticuerpo? Le agrego un sustrato de
38:26aminobencilina que por la acción de la
38:29enzima que está unida al anticuerpo
38:30secundario me da un producto que es
38:32insoluble, que tiene un color marrón.
38:36Entonces, donde yo veo ese color marrón
38:39en el tejido, es donde se produjo la
38:42reacción antígeno anticuerpo primario y
38:45anticuerpo primario antígeno anticuerpo
38:48secundario. Le agrego a continuación el
38:51sustrato, la enzima actual sobre el
38:54sustrato me da el producto y el producto
38:55precipita en las células donde se
38:57encuentra esta proteína. Entonces, yo
39:00veo en este tejido las células que
39:03expresan la proteína
39:05X67. En la imagen anterior yo veía la
39:08proteína X67 observada con una
39:11inmunofluorescencia y acá la estoy
39:12viendo con una
39:15inmunoquímica. En ambos casos obtengo el
39:18mismo resultado, obtengo la distribución
39:21y la ubicación de esa molécula. En el
39:24primer caso estaba viendo células
39:25individuales, entonces podía hablar de
39:27inmunofluorescencia a nivel celular y
39:30acá lo estoy viendo a menor aumento y a
39:34nivel del tejido. Entonces puedo hablar
39:35de una
39:36inmuno istoquímica.
39:41De esa forma terminamos de hablar de la
39:44inmunoistoquímica y de su versión con
39:46fluorescencia, que es la
39:48inmunofluorescencia, que me permite
39:51determinar la ubicación y la
39:52distribución de una molécula en un
39:55tejido o en una célula.
39:58Y este método se basa, es específico por
40:01una determinada proteína y se basa en la
40:04reacción antigeno,
40:07anticuerpo. Vamos a pasar ahora a una
40:09segunda metodología que también nos
40:12permite identificar proteínas basados en
40:15la reacción antígeno anticuerpo. Es
40:18decir, la reacción antígeno anticuerpos
40:21me permite localizar en el
40:23tejido mediante la inmunocitoquímica o
40:26la
40:26inmunoitoquímica, una proteína
40:28específica. Ahora vamos a ver cómo
40:31mediante el inmun el westerb o
40:34inmunoblot puedo detectar la presencia
40:38en un tejido o en una
40:41célula de una de una proteína específica
40:44y tener una idea sobre la cantidad
40:46relativa del mismo. Pero mediante esta
40:48técnica, yo no tengo información sobre
40:52la
40:53localización de y la distribución de
40:57esta proteína, ya que parto de un tejido
41:02que ha sido fraccionado, homogeneizado.
41:05¿Se acuerdan de la clase anterior que
41:07dijimos que yo puedo obtener un tejido y
41:10homogeneizarlo, destruirlo, ¿sí? y luego
41:14trabajar sobre ese
41:17homogenato. También puedo obtener
41:19plasma, que es tejido líquido, y
41:22utilizar ese plasma para ver si en ese
41:24plasma está la proteína de interés a
41:26través de esta técnica de western blood
41:29o inmunoblot.
41:31Esta técnica me va a permitir, por un
41:34lado, determinar si está o no está
41:37presente la proteína que estoy buscando,
41:40que la voy a detectar con un anticuerpo
41:42dirigido contra esa proteína. Me va a
41:46permitir saber cuál es el peso molecular
41:50de esa proteína y tener una idea de la
41:53cantidad relativa de la misma.
41:56Entonces, vamos a ver
41:58ahora los pasos de la técnica de western
42:02blot o inmunoblot.
42:05Entonces, el primer paso es obtener la
42:07muestra, que puede ser plasma o puede
42:10ser un tejido que
42:11yo
42:14homogeneizo. En ese tejido voy a voy a
42:17tener proteínas y posiblemente la
42:19proteína que yo quiera saber si está o
42:21no
42:24está. En un primer
42:27paso voy a utilizar una técnica que se
42:30llama electroforesis en gel, que está
42:33representado acá.
42:35que me va a permitir separar por tamaño
42:39las proteínas en un
42:42gel. ¿Qué es un gel? Un gel es como si
42:44fuese
42:48unrejado, es una membrana conformado por
42:52que tiene orificios de un determinado
42:55tamaño. El tamaño de esos
42:59orificios son los que me van a regular
43:02el pasaje de las proteínas por los
43:03mismos. De forma tal que las proteínas
43:06más grandes van a tardar más tiempo en
43:08pasar por ese filtro, por ese
43:11enrejado por esa enrejado de la de la
43:14membrana, mientras que las más chicas
43:16van a pasar más rápidamente. Entonces,
43:20tenemos un
43:23gel que está formado por una malla que
43:27tiene
43:28orificios. Ese gel lo voy a colocar en
43:33una solución
43:34acuosa que va a estar
43:37sometido al pasaje de electricidad.
43:41Vamos a tener en la parte
43:42superior el
43:45cátodo con la carga negativa y en la
43:48parte inferior el ánodo con la parte
43:51positiva, con la carga positiva.
43:54Colocamos el gel en un medio
43:58acuoso. ¿Ven? Acá tenemos el gel en la
44:01parte central, la cubeta donde tenemos
44:04el
44:05líquido y esto se
44:08conecta a una fuente de poder que
44:12produce la emisión de electricidad.
44:14Entonces, las cargas eléctricas van a
44:16los electrones van a ir del cátodo al
44:24ánodo. Ahora
44:27bien, en este gel voy a colocar las
44:34proteínas y estas proteínas van a migrar
44:38a través del
44:41gelido a la carga eléctrica. Esta
44:46migración va a depender de dos cosas, de
44:50dos aspectos. Por un lado, del tamaño de
44:52la proteína y por otro lado, de la carga
44:54eléctrica de la proteína.
44:57Como a mí me
44:59interesa separar a las proteínas en este
45:02gel por su tamaño, en un paso previo a
45:07sembrar las proteínas en el gel, someto
45:11a las proteínas a un medio en el
45:15cual tengo un
45:21detergente con cargas negativas.
45:27Las proteínas van a quedar rodeadas por
45:29este
45:31detergente llamado SDS, donde el
45:35sulfato. Entonces, el agregado del
45:38detergente va a permitir que las
45:40proteínas estén rodeadas por cargas
45:42negativas. Todas van a estar rodeadas
45:45por cargas negativas.
45:48En esta solución también se puede
45:50agregar alguna sustancia que favorezca
45:53la desnaturalización de las proteínas,
45:55es decir, que las proteínas pierdan su
45:57estructura tridimensional y se estiren.
46:00Uno de los mecanismos por los cuales las
46:02proteínas pierden su estructura
46:04tridimensional es perdiendo, rompiendo
46:07las uniones de
46:09insulfuro. Y eso te puede hacer también
46:11ante el agregado de determinadas
46:13moléculas como el mercto etanol.
46:17Entonces,
46:20obtengo la muestra de tejido líquido si
46:24es plasma o sometido a la
46:30degradación en un homogenanto.
46:34Esa ese esa muestra la coloco en una
46:38solución de corrida que va a tener las
46:42características que permitan que las
46:45proteínas pierdan esa
46:47estructura terciaria y
46:50cuaternaria y se carguen en forma
46:54negativa.
46:56Entonces, con esa solución o
47:00buffer de
47:03corrida,
47:04obtengo disueltas las proteínas con
47:07carga
47:08negativa y a las cual les puedo sacar
47:12esa estructura
47:15tridimensional. Siembro en el gel, el
47:19gel que se utiliza es un gel con una
47:21sustancia llamada poliacrilamida.
47:23Dependiendo de la concentración de la
47:25poliacrinamina va a ser el tamaño de los
47:28poros de ese gel. Entonces siembro en la
47:31parte superior la
47:34proteína acá esto tiene varias calles.
47:37En una calle siembro una muestra que
47:40está formada por proteínas que yo
47:43conozco, que no son de la muestra
47:45analizar, sino proteínas que yo conozco
47:47y que tienen pesos moleculares que yo
47:49conozco y que tienen una coloración. De
47:51forma tal que cuando las proteínas
47:53corran, las voy a poder identificar por
47:55su color. Y en las otras calles siembro
48:00la muestra que quiero analizar.
48:04Entonces,
48:06siembro el control de peso
48:09molecular, siembro la muestra analizar
48:12en el gel que está en un medio
48:15acuoso, en esta estructura donde tenemos
48:20el líquido y lo sometemos a la acción de
48:23electricidad y entonces las proteínas
48:26van a correr del cátodo al ánodo a lo
48:30largo del gel.
48:32pasando por los poros de ese gel.
48:35Entonces, las proteínas más grandes van
48:38a tardar más en pasar, van a quedar más
48:40arriba. Las proteínas más chicas van a
48:43correr más rápidamente y todas van a
48:45correr hacia el polo positivo porque van
48:48a estar cargadas en forma negativa. Las
48:51proteínas en su estado natural tienen
48:54pueden tener más o menos cargas
48:55positivas o negativas, pero como yo las
48:59rodeé de un detergente con cargas
49:01negativas, todas van a tener cargas
49:02negativas. Entonces, la corrida
49:06electroforética en
49:08gel se utiliza para
49:11separar moléculas. En este caso,
49:16utilizando el gel de poliacrigamida, me
49:18permite separar proteínas por su peso
49:22molecular. Acá
49:24tenemos la corrida donde tenemos los los
49:29distintas proteínas con distintos pesos
49:30moleculares separadas por peso
49:32molecular.
49:34Acá voy a tener la muestra en la cual
49:37voy a tener esparcidas a lo largo de
49:39toda la extensión todas las proteínas.
49:42Acá solamente está marcado una proteína,
49:44pero todavía no llegamos a ese
49:46punto. Lo que voy a lograr con la
49:49corrida electroforética entonces es
49:51separar por peso molecular todas las
49:54proteínas de la muestra. Mediante una
49:57tinsión yo puedo identificar todas las
50:00bandas en esta corrida. En este gráfico,
50:04este paso no se
50:06muestra. Entonces, en el gel separo las
50:10proteínas por peso molecular. Y sé el
50:13peso molecular porque al lado
50:16tengo una mezcla de proteínas de las
50:19cuales sé el peso molecular. Por
50:20ejemplo, acá tengo miina que tiene
50:23200 kilalton o 200,000 dalton de peso
50:27molecular.
50:29Acá tengo un inhibidor de tripsina que
50:33tiene un peso molecular de 21,500
50:36dalton. De esa forma veo que las más
50:40pesadas quedan arriba y a medida que son
50:42más livianas, más pequeñas, corren más.
50:47Entonces, mediante el primer
50:50paso, yo pude separar las proteínas de
50:54mi muestra según el tamaño de las
50:56mismas, según el peso molecular.
50:59Ahora bien, yo quiero identificar de
51:02todas estas proteínas que que hice
51:04correr y que separé
51:07solamente una, la de, supóng que
51:10seguimos trabajando con el receptor del
51:13factor de crecimiento epidérmico.
51:14Entonces, yo quiero saber si en esa
51:16muestra está ese esa proteína. ¿Cómo sé
51:20si entre todas las proteínas que tengo
51:24acá voy a tener esa proteína?
51:28lo voy a lograr
51:31utilizando un
51:33anticuerpo que reconozca esa proteína.
51:36Entonces, ese anticuerpo se va a unir
51:38solamente a la banda donde esté esa
51:41proteína.
51:44Yo le agrego un anticuerpo primario y
51:46luego un anticuerpo secundario que esté
51:49marcado. Generalmente se pone un
51:51anticuerpo secundario que tenga una
51:54enzima a la cual le agrego el sustrato y
51:57me da un producto con color. De esa
51:59forma, luego de la corrida
52:01electrofolítica, yo
52:03podría localizar la
52:06banda de la proteína que estoy
52:09buscando. Ahora bien, esto tiene un
52:12problema más.
52:13No se puede realizar y conservar la
52:16ubicación de la reacción antígeno o
52:18anticuerpo en un gel.
52:21Necesito hacer esa reacción en una
52:24superficie sólida para que el producto
52:26de la reacción quede en un lugar y no se
52:29disperse. Si yo hago la reacción
52:31antígeno, anticuerpo sobre el gel, se va
52:35se puede desplazar el
52:38anticuerpo, eh el antígeno, pero
52:41fundamentalmente el producto de la
52:43reacción enzimática y entonces no voy a
52:45poder detectar la ubicación. ¿Qué puedo
52:48hacer para
52:51mantener el producto de la el producto
52:54de la enzima que me está localizando la
52:56reacción antígeno anticuerpo solamente
52:58en la región de la banda? tengo que
53:02transferir eh estas proteínas a una
53:05superficie
53:07sólida que puede ser un papel de
53:14nitrocelulosa. A ese paso por el cual
53:18paso las proteínas a una superficie
53:21sólida como puede ser la
53:24nitrocelulosa, se lo llama transferencia
53:27o en inglés
53:29bloting y se hace a través
53:33de transferencia eléctrica también, es
53:36decir, las proteínas que tienen carga
53:41negativa van a ser transferidas de la
53:44membrana
53:49a la del gel a la membrana de
53:55nitrocelulosa. Este es el segundo paso
53:57de la técnica, el paso de transferencia
54:00o blot. Acá a la izquierda
54:03tenemos el gel donde corrieron las
54:07proteínas y acá tenemos la membrana de
54:10nitrocelulosa a donde queremos que sea
54:13transferida estas proteínas.
54:15Entonces, pongo el gel junto con la
54:19nitrocelulosa, los pongo también en un
54:22medio acuoso y hago correr electricidad,
54:25pero en este caso desde la zona del gel
54:30a la zona de la membrana, de forma tal
54:32que las proteínas que tienen carga
54:34negativa van a pasar del gel a la
54:38nitrocelulosa. Luego de hacer la
54:40transferencia o blot, separo la membrana
54:45de celulosa de la membrana. En la
54:48membrana de
54:50nitrocelulosa tengo las proteínas
54:53transferidas. Como esto es una
54:55superficie sólida, acá sí puedo agregar
54:57el anticuerpo. El anticuerpo se va a
55:01unir a la banda donde está la proteína
55:03de interés. Le agrego el anticuerpo
55:06secundario marcado que puede tener la
55:10enzima. A esa a ese anticuerpo
55:13secundario le agrego un sustrato que me
55:14da como consecuencia de la acción de la
55:16enzima un producto que va a precipitar
55:18en la zona de la banda. Entonces yo voy
55:21a detectar solamente la banda donde se
55:24encuentra la proteína que quiero
55:27estudiar.
55:34Entonces, mediante esta técnica, yo voy
55:37a detectar la
55:40banda. Si está la banda, quiere decir
55:43que está la proteína que estoy buscando.
55:45Si no está la banda, quiere decir que la
55:47proteína no está.
55:52Y además sé el peso
55:55molecular de esta proteína porque lo
55:58comparo con las
56:01proteínas que de las que sirven de
56:04control de peso
56:09molecular. Entonces, C si está o no está
56:13la proteína en cuestión. C el peso
56:17molecular de la proteína. porque lo
56:20comparo con las proteínas de peso
56:22molecular.
56:26Y dependiendo de la intensidad de la
56:29marca de la banda y del grosor de la
56:33banda, voy a
56:35poder tener una idea de la cantidad
56:39relativa que tiene esa proteína en ese
56:43tejido que estoy analizando.
56:59Entonces, el western
57:03blot o inmunoblot se llama de esta forma
57:07por lo siguiente.
57:17inmuno porque se basa en la reacción
57:19antígeno
57:20anticuerpo. Entonces, a través de la
57:22reacción antígeno anticuerpo, puedo
57:26detectar la proteína.
57:29Blood es
57:31transferencia porque utiliza la
57:33transferencia del gel a la membrana de
57:38nitrocelulosa. Se llama Westermlot
57:40porque fue el nombre original que se le
57:42dio en Estados Unidos. Westerblot
57:44significa del oeste y para diferenciar
57:47de una técnica similar que permite
57:51identificar ADN y se llama Southern
57:54Blood y otra que me permite identificar
57:56ARN que se llama Northern Blood. El
57:58Sounder Blood se para en una corrida
58:02electroforética ADN y lo reconoce por
58:05hibridación, por la unión de un
58:09oligonucleótido al ADN. Ese se llama
58:12southern blood. El nord
58:15blot localiza AR con el mismo fundamento
58:19que el soutermot y el western blot
58:22localiza o detecta proteínas a través de
58:26la reacción antígeno
58:28anticuerpo. Como podemos observar acá
58:30abajo, me permite ver, por ejemplo, acá
58:33tenemos la calle
58:37con los estándares de peso molecular.
58:41Acá tenemos tres muestras. En la muestra
58:44uno se observa banda, en la muestra dos
58:47no se observa banda y en la muestra tres
58:49se observa banda. Esto, ¿qué significa?
58:52que tanto en la calle uno como en la
58:55tres estaba la proteína que quiero
58:58analizar y que la reconozco por la
59:00reacción antígeno anticuermo, mientras
59:01que en la banda dos no estaba la
59:03proteína que y por lo
59:06tanto no se unió el anticuerpo y no lo
59:08estoy
59:09detectando. Entonces, el Western Blood
59:12me da información de si está o no está
59:15la proteína de interés, qué peso
59:17molecular tiene y también puedo tener
59:20una idea sobre la cantidad relativa.
59:22Fíjense, esta banda tiene menor
59:24intensidad que esta, quiere decir que
59:26acá hay más proteína que acá. ¿Sí?
59:29Ahora bien, si yo hago un homogenato del
59:32tejido, yo voy a saber si está o no está
59:35la proteína y en qué cantidad relativa,
59:37pero no voy a conocer la ubicación
59:40dentro de las células y dentro del
59:42tejido de ese
59:43homogenato. Si yo quiero
59:47saber la ubicación de la
59:50proteína dentro de ese
59:53homogenato, al homogenato antes de
59:56analizarlo por
59:58Western, lo tengo
1:00:00que someter a un fraccionamiento
1:00:03subcelular.
1:00:04Por ejemplo, obtenemos tejido bárico,
1:00:07hacemos un homogenato, lo sometemos a
1:00:10ultras
1:00:11centrifugaciones diferenciales sucesivas
1:00:13y voy separando distintas fracciones
1:00:16celulares, núcleos, mitocondrias,
1:00:18lisosomas, hiperoxisomas, microsomas,
1:00:20citosol. Después cada uno de esas
1:00:23fracciones, cada una de esas fracciones
1:00:26la puedo hacer correr como una muestra
1:00:28distinta en el blot, en el en la corrida
1:00:32electronética.
1:00:33Luego se transfiere y luego se lo somete
1:00:35a la reacción antígeno anticuerpo.
1:00:37Entonces, fíjense, acá en la primer
1:00:39calle corrimos el homogenato, en la
1:00:42segunda calle el citosol y en la tercer
1:00:46calle los microsomas. Fíjense, la calle
1:00:49del homogenato tiene
1:00:51proteína, la calle dos del citosol no y
1:00:55la calle tres de los microsomas, ¿sí?
1:00:57¿Qué quiere decir? que esta proteína que
1:01:01es la aromatasa se encuentra en los
1:01:03microsomas y no se encuentra en el
1:01:05citosol. Y como tanto los microsomas
1:01:08como en citosol, como todas las
1:01:09porciones se encuentran en el
1:01:11homogenato, también la voy a detectar en
1:01:13el
1:01:13homogenato. Ahora bien, si en el
1:01:15homogenato está toda la
1:01:17proteína y en los microsomas también,
1:01:20¿por qué veo más
1:01:21cantidad en los microsomas que en el
1:01:24homogenato?
1:01:26Porque en los microsomas yo concentré la
1:01:28muestra. Entonces, la proporción de esta
1:01:32proteína en relación con los microsomas
1:01:34va a ser mayor que en proporción al
1:01:37homogenato. Entonces,
1:01:39mediante la aplicación de la técnica de
1:01:41fraccionamiento
1:01:46subcelular previo al Western, yo puedo
1:01:49saber en
1:01:51qué fracción subcelular se encuentra
1:01:55esta proteína. Si yo no hago
1:01:58fraccionamiento subcelular, que es lo
1:02:00más frecuente, cuando yo tengo una
1:02:03muestra de homogenato, la someto a la
1:02:05corrida electrética, luego hago la
1:02:08transferencia y luego la reacción
1:02:09antígeno anticuerpo, voy a detectar la
1:02:11presencia o no de la banda, pero no voy
1:02:14a poder saber en qué componente de ese
1:02:18homogenato se encuentra la proteína en
1:02:22estudio.
1:02:23Entonces, la técnica de Western Blot me
1:02:28permite detectar si está o no está la
1:02:30proteína, en qué proporción relativa
1:02:34está, pero no la distribución en el
1:02:37tejido o en las células que estoy
1:02:39analizando. Acá tenemos otro ejemplo,
1:02:41fíjense, acá tenemos un western block
1:02:43para detectar ecaderina de tres muestras
1:02:46distintas, de tres homogenatos, de tres
1:02:49tumores de mama.
1:02:51Fíjense, en los tres primeros hay
1:02:54ecaderina, mientras que en el último no
1:02:56se expresa
1:02:57ecaderina. Entonces, me permite comparar
1:03:00las cuatro muestras. En estas tres hay
1:03:03ecaderina y en estas no hay ecaderina.
1:03:08A su vez nos permite ver que en esta
1:03:11primera hay más cantidad que en esta
1:03:14segunda. Para yo poder hacer un cálculo
1:03:16respecto a la
1:03:18cantidad relativa, debo comparar esta
1:03:22banda con una banda de control, con una
1:03:25molécula que mantenga la concentración
1:03:27en todas las muestras. Por ejemplo, la
1:03:29actina, que me puede servir de control.
1:03:31Entonces, si yo tengo la banda de actina
1:03:33acá que no está marcada, puedo comparar
1:03:36la intensidad de esta marca de la
1:03:38muestra con la actina, hacer un cociente
1:03:41y entonces me permite tener una idea de
1:03:44la relación entre la caderina y la
1:03:48actina, lo mismo con las otras muestras.
1:03:51Y entonces haciendo esa división voy a
1:03:53saber la proporción relativa que tiene
1:03:57esa molécula en las distintas muestras.
1:04:03Entonces vimos inmunoistoquímica o
1:04:07inmunofluorescencia y western blot.
1:04:10Ambas se basan en la reacción antígeno
1:04:13anticuerpo. Ahora bien, no siempre es
1:04:16fácil conseguir anticuerpos específicos
1:04:18contra una determinada proteína y puede
1:04:21ser que en algunos casos cuando hagamos
1:04:23el western blot nos marque muchas
1:04:25bandas. Esto nos está diciendo que no
1:04:28hay una reacción específica entre el
1:04:30anticuerpo y el antígeno que estamos
1:04:32buscando. Esto es una de las
1:04:33limitaciones que puede
1:04:36tener el empleo de las inmunistoquímicas
1:04:40o de los western blot para detectar
1:04:42proteínas. En esos casos yo puedo
1:04:44utilizar una técnica por la cual marco o
1:04:49produzco proteínas fluorescentes y
1:04:52estudio esas proteínas fluorescentes.
1:04:55Estudio la distribución de esas
1:04:57proteínas fluorescentes, el empleo de
1:04:59proteínas fluorescentes para ubicar una
1:05:01determinada proteína en un tejido. Lo
1:05:04vamos a ver en la segunda parte de este
1:05:06seminario cuando veamos las técnicas de
1:05:09estudio de ADN.
1:05:11Entonces, hasta acá, ¿qué vimos? Vimos
1:05:15que yo
1:05:16puedo utilizar la
1:05:19inmunoistoquímica para detectar la
1:05:22ubicación de proteínas dentro de un
1:05:25tejido o dentro de una célula. Puedo
1:05:28también tener una idea relativa de la
1:05:31cantidad de esa proteína en ese tejido o
1:05:35en una determinada célula.
1:05:38Y luego vimos el western blot o
1:05:40inmunoblot que me
1:05:41permite detectar la presencia de una
1:05:45determinada proteína en una
1:05:48muestra, pero no me permite ver la
1:05:52ubicación dentro de los componentes de
1:05:54la muestra del
1:05:56homogenato. Me permite también tener una
1:05:58idea cuantitativa relativa de la misma.
1:06:01Y para poder yo saber la
1:06:04ubicación dentro de los componentes de
1:06:06ese tejido, debo realizar previamente
1:06:09una un fraccionamiento subcelular. Si no
1:06:13realizo fraccionamiento subcelular, que
1:06:14es lo más frecuente, no puedo conocer la
1:06:18distribución de esas proteínas en el
1:06:21tejido que analicé. Entonces, hasta
1:06:23ahora vimos inmunocitoquímica o
1:06:26inmunofluorescencia y western blood o
1:06:28inmunoblot.
1:06:30Vamos ahora a mencionar brevemente una
1:06:32tercera técnica que no es específica
1:06:35para detectar proteínas, pero que puede
1:06:38utilizar la reacción antígeno anticuerpo
1:06:41para separar y analizar células. ¿Que es
1:06:44la técnica de citometría de
1:06:47flujo? La técnica de citometría de flujo
1:06:50se utiliza para separar identificar
1:06:54características de células.
1:06:58Por eso se llama
1:06:59citometría, cito de célula y de flujo
1:07:03porque se hacen pasar por un flujo
1:07:06líquido a
1:07:08células que voy a analizar.
1:07:12Yo puedo tener una muestra de tejido en
1:07:15el cual realizo una
1:07:18inmunoistoquímica donde el anticuerpo
1:07:20secundario esté marcado con un
1:07:22fluorocromo. Esa
1:07:25inmunoistoquímica va a permitir que
1:07:27marque determinadas proteínas que se
1:07:28encuentren en algunas células que están
1:07:31marcadas en rojo y que no estén en otras
1:07:33células que están marcadas en negro.
1:07:36Entonces, yo a través de la reacción
1:07:39antígeno, anticuerpo, de una
1:07:42inmunofluorescencia, puedo detectar
1:07:44algunas células y otras amarcar algunas
1:07:47células y otras dejarlas sin marcar
1:07:49porque algunas poseen esa ese proteína y
1:07:52otras no. Entonces, esto me sirve para
1:07:55separar separar células.
1:07:58Entonces yo hago pasar esas células por
1:08:03el aparato de citometría de
1:08:08flujo.
1:08:10Entonces pasan por el flujo estas
1:08:13células que van a atravesar un rayo
1:08:16emitido por una fuente de radiación
1:08:18láser. Ese láser va a impactar con las
1:08:22células y va a producir una desviación y
1:08:25una emisión de luz. de un determinado
1:08:28color si la célula tiene el fluorocromo,
1:08:31si no tiene el fluorocromo, ¿no? Pero a
1:08:34su vez en todas las células tenga o no
1:08:37tenga el
1:08:38fluorocromo, voy a tener una emisión de
1:08:43rayos lumínicos que atraviesen la célula
1:08:46y no emitan
1:08:47fluorescencia. Entonces, yo tengo dos
1:08:50detectores, un detector de fluorescencia
1:08:53y un detector de la luz desviada de las
1:08:56células.
1:08:58Entonces, si la célula tiene el
1:09:01fluorocromo, va a producir
1:09:03fluorescencia. Si la célula no tiene
1:09:05fluoccromo, no va a emitir
1:09:06fluorescencia. Pero todas van a permitir
1:09:10el pasaje de rayos lumínicos que van a
1:09:13ser detectados por este segundo
1:09:18detector. La forma en que las el rayo
1:09:21alumínico atraviese a las distintas
1:09:23células va a ser distinta por las
1:09:25distintas características morfológicas
1:09:27de la célula.
1:09:29Entonces, por un lado, vamos a saber qué
1:09:32células tienen fluorescencia y qué
1:09:34células no tienen fluorescencia. me va a
1:09:36permitir separar a las células
1:09:38fluorescentes de las no fluorescentes.
1:09:40Si
1:09:41yo hago pasar estas, les agrego carga a
1:09:45estas
1:09:46células, las células que se van a cargar
1:09:48las células que tienen el fluorocromo y
1:09:50no las que no tiene el fluorocromo, si
1:09:52yo a estas células que vienen en el
1:09:53flujo las hago pasar por una zona
1:09:56electromagnética, me voy a permitir
1:09:58separar a las células que no tienen
1:10:00carga de las que tienen carga. Entonces,
1:10:01las que no tienen carga son las que no
1:10:03tienen el marcador fluorescente y las
1:10:04que tienen carga sí. Entonces, me
1:10:06permiten separar los dos tipos de
1:10:10células. Por otro lado, el análisis de
1:10:14la
1:10:14emisión de la fuente lumínica que
1:10:17atraviesa a los dos tipos de células, lo
1:10:20puedo
1:10:23analizar y me puede dar información
1:10:26sobre las características de esas
1:10:27células.
1:10:30Acá tenemos otro esquema donde tenemos
1:10:31el flujo de células, las células que son
1:10:34atravesadas por el láser, los
1:10:36analizadores del láser, ¿sí? y los
1:10:39analizadores de la fuente lumínica que
1:10:42atraviesa tanto la célula que tiene
1:10:44fluorescencia como la que no atiende. Y
1:10:46acá tenemos el
1:10:47detector.
1:10:49Entonces, yo puedo en base a la
1:10:52detección de la forma en que se las el
1:10:54rayo alumínico atravesó esas células,
1:10:56ver el nivel de granulosidad de las
1:10:59células, por ejemplo, y el tamaño de la
1:11:01célula. Entonces, voy a tener una serie
1:11:03de puntos que se van a distribuir en ese
1:11:06gráfico según la cantidad de granos y el
1:11:09tamaño. De esa forma yo puedo separar a
1:11:12las células según el tipo morfológico.
1:11:15Por ejemplo, células grandes. Si yo
1:11:18estoy obteniendo células de la sangre,
1:11:20por ejemplo, voy a ver que las células
1:11:23más grandes y con más
1:11:26gránulos se encuentran en este
1:11:29sector. las que tienen que son más
1:11:33chicas, las que son también más grandes,
1:11:35pero tienen menos gránulos en este
1:11:36sector y las más pequeñas y con menos
1:11:39grándulos en este sector. Entonces,
1:11:40puedo deducir según las características
1:11:43morfológicas y separar a los
1:11:45granulocitos, de los monocitos, de los
1:11:47linfocitos.
1:11:49Es decir, la técnica de citometría de
1:11:52flujo es una técnica que permite
1:11:54analizar células y puede
1:11:58utilizar la reacción antígeno anticuerpo
1:12:01de una inmunoistoquímica, de una
1:12:03inmunofluorescencia para separar células
1:12:05que tengan fluorescencia de otras que no
1:12:07tengan fluorescencia. Y además,
1:12:09dependiendo de la forma en que se
1:12:11desvían los rayos luminosos que
1:12:13atraviesan a la célula con fluorescencia
1:12:15y sin fluorescencia, reconocer las
1:12:20características morfológicas de esas
1:12:22células. Entonces, a través de la
1:12:24citometría de flujo, yo tengo
1:12:25información sobre las características
1:12:28morfológicas de esas células y sobre la
1:12:31pesencia o ausencia de un determinado
1:12:34marcador que yo detecto a través de una
1:12:36reacción antígeno anticuerpo mediante
1:12:38una técnica de inmunofluorescencia.
1:12:43Entonces, hasta ahora hemos hablado de
1:12:45la inmunocitoquímica o fluorescencia, el
1:12:49western, una técnica que puede
1:12:52aprovechar del beneficio de la
1:12:54inmunofluorescencia para darnos
1:12:56información sobre las células que es el
1:12:59la citometría de flujo. Y ahora como
1:13:03último paso vamos a analizar las
1:13:06técnicas de proteica.
1:13:10Hasta ahora hemos analizado dos
1:13:12técnicas, inmunofluorescencia o
1:13:15inmunoistoquímica y western blot o
1:13:17inmunoblot que nos permiten analizar una
1:13:21o un número pequeño de proteínas. nos
1:13:24permiten ver la distribución, la
1:13:28cantidad relativa de esa proteína en un
1:13:31tejido mediante la inmunocitoquímica o
1:13:34la presencia o la ausencia y la cantidad
1:13:36relativa de una proteína en un tejido y
1:13:39el peso molecular de la misma mediante
1:13:41el western blot, pero nos permite
1:13:44analizar una cantidad limitada de
1:13:46proteínas que
1:13:48depende de la cantidad que puede
1:13:50utilizar al mismo tiempo de anticuerpos.
1:13:54Hay otro conjunto de técnicas que nos
1:13:57permiten
1:13:58analizar el conjunto total de proteínas
1:14:02de un sistema biológico. Ese sistema
1:14:04biológico puede ser una célula o un
1:14:09tejido o un órgano completo.
1:14:13Esas técnicas que nos permiten tener
1:14:17información
1:14:19sobre el número y la cantidad relativa
1:14:24de proteínas de un sistema biológico, se
1:14:28lo llama proteica. Proteómica. Entonces,
1:14:30el conjunto de técnicas que nos
1:14:33permiten
1:14:36analizar la
1:14:39cantidad relativa de proteínas que se
1:14:43expresan en un determinado sistema
1:14:45biológico. Es decir, que nos da un
1:14:46panorama general de las proteínas
1:14:49expresadas en un sistema biológico
1:14:51determinado, que puede ser una célula o
1:14:53un
1:14:57tejido. ¿Cuál es la base de las técnicas
1:15:00de
1:15:01proteómica? La base fundamentalmente es
1:15:03la espectrometría de masa. La
1:15:06espectrometría de masa es una técnica
1:15:07que nos permite analizar las proteínas
1:15:10de un sistema dependiendo de la carga y
1:15:14de la masa de esas proteínas. Y
1:15:17básicamente consisten los pasos que se
1:15:21muestran en este
1:15:23gráfico.
1:15:26Fíjense, hacemos un
1:15:28homogenato con la
1:15:31muestra dónde están las
1:15:33proteínas. Esas proteínas se cortan en
1:15:37péptidos a través de enzimas proteas.
1:15:43Esas esos péptidos pueden purificarse o
1:15:47separarse sobre en base a técnicas de
1:15:50purificación como pueden ser la
1:15:53cromatografía o un gel, una corrida
1:15:57electroforética o una centrifugación por
1:16:01gradientes de densidad, de forma tal de
1:16:03tener una separación relativa de estas
1:16:06proteínas y luego estas proteínas o esos
1:16:08segmentos de proteínas se introducen un
1:16:12aparato o un espectrómetro de masa
1:16:15que
1:16:19carga a esas proteínas, es decir, ioniza
1:16:22a esos péptidos.
1:16:24Entonces, esos péptidos van a estar
1:16:28ionizados y se van a movilizar con
1:16:31distinta velocidad sometidos a una a una
1:16:35emisión radiactiva. Se van
1:16:38a mover a distintas velocidad según su
1:16:41masa. Los más pequeños se van a mover
1:16:43más rápidamente y los más grandes se van
1:16:45a mover más lentamente. De esa
1:16:48forma, esos péptidos que han ionizado y
1:16:52que se han movilizado dependiendo de su
1:16:55tamaño, se pueden
1:16:57analizar a lo largo de un eje por su
1:17:01radio masa
1:17:02carga y se puede calcular la intensidad,
1:17:07o sea, la cantidad relativa de cada uno
1:17:09de ellos. Entonces, en este gráfico de
1:17:11arriba, que es un espectrómetro de una
1:17:14espectrometría de masa, yo estoy
1:17:18viendo las proteínas o los péptidos, los
1:17:21segmentos de proteínas que se
1:17:24distribuyen según el cociente masa a
1:17:28carga. Entonces, acá están los que
1:17:31tienen, a la izquierda tenemos los que
1:17:32tienen más masa y menos carga y a la
1:17:35derecha los que tienen más carga.
1:17:39más masa y menos carga. Entonces, de
1:17:42esta forma vamos separando todos los
1:17:45péptidos, los fragmentos peptídicos que
1:17:48habíamos introducido en el aparato de
1:17:50espectrómetro de masa al principio.
1:17:54Entonces, separo los distintos péptidos
1:17:58dependiendo de su masa y de sus cargas.
1:18:01y veo la cantidad relativa según el
1:18:04tamaño del pico. Cuando el pico es más
1:18:07alto, quiere decir que hay más cantidad
1:18:09de esa proteína. Cuando el pico es más
1:18:11bajo, significa que hay menos cantidad.
1:18:14Y las puedo separar esos péptidos
1:18:16dependiendo de sus características de
1:18:18masa y de carga.
1:18:20Entonces, este gráfico es analizado en
1:18:23la computadora en base a bases de
1:18:26datos sobre las características de las
1:18:29distintas proteínas y de esa forma puedo
1:18:31identificar qué proteínas se expresan en
1:18:34ese tejino y en qué cantidad
1:18:37relativa. De esa
1:18:42forma puedo, por ejemplo, comparar dos
1:18:45tejidos en dos momentos del desarrollo
1:18:47distintos o el mismo tejido en dos
1:18:49momentos de un desarrollo distinto y
1:18:52entonces ver que el patrón de expresión
1:18:55de proteínas varía a lo largo del
1:18:57desarrollo en un mismo tejido. o puedo
1:18:59comparar dos tejidos distintos y ver
1:19:02cuál es el patrón de expresión de
1:19:03proteínas en un tejido y cuál es el
1:19:05patrón de expresión de proteínas en otro
1:19:08tejido. Esta información es muy
1:19:11importante porque ustedes sabrán que la
1:19:16diferencia entre distintos tejidos o la
1:19:19diferencia de un mismo tejido a lo largo
1:19:22del desarrollo se basa en que hay una
1:19:26expresión génica diferencial.
1:19:29entre ellos. Es decir, se expresan
1:19:30distintos conjuntos de genes. La
1:19:32expresión de distintos conjuntos de
1:19:34genes hace que sean distintos dos
1:19:36tejidos entre sí o que sea distinto un
1:19:39mismo tejido a lo largo de distintas
1:19:41etapas del
1:19:42desarrollo. El producto final de la
1:19:46expresión de los genes que codifican
1:19:49para proteínas es el patrón de expresión
1:19:53proteica.
1:19:55Entonces,
1:19:56mediante la proteica, yo obtengo
1:19:59información sobre el tipo de proteínas
1:20:04que expresa un determinado tejido o una
1:20:06determinada célula en un determinado
1:20:08momento y la proporción o cantidad
1:20:11relativa de esa misma proteína a lo
1:20:14largo del en ese
1:20:17tejido.
1:20:20Entonces, la proteica nos permite
1:20:26identificar el tipo de proteínas que
1:20:28expresa un sistema biológico y la
1:20:31proporción de las mismas. Para eso en
1:20:35general se utilizan dos pasos, como les
1:20:37dije antes. Primero, un paso que me
1:20:38permite separar las proteínas.
1:20:44generalmente son
1:20:45fragmentadas y luego esas
1:20:48proteínas se analizan en el
1:20:51espectrómetro de masa. Una de las formas
1:20:53de purificar, de separar en la primera
1:20:56etapa a esas proteínas es una
1:20:59electroforis
1:21:00bidimensional. Los métodos por los
1:21:02cuales se separan originalmente las
1:21:04proteínas no son tan importantes que
1:21:06ustedes lo sepan. Lo importante
1:21:07conceptualmente es que sepan que la
1:21:09espectrometría de f de masa permite
1:21:14analizar la cantidad total de proteínas
1:21:17de un tejido y la proporción de cada una
1:21:20de ellas y que hay distintas técnicas
1:21:22que me permiten en un paso inicial
1:21:23purificarlas. Una de esas técnicas es la
1:21:26electrólisis bidimensional, donde yo
1:21:28separo proteínas en una
1:21:30primera
1:21:32corrida por pH y luego ese gel en forma
1:21:37de tira lo invierto y lo pongo en otro
1:21:41gelo calles en las cuales van a correr
1:21:44según su peso molecular. Entonces, en el
1:21:47gel final voy a tener separados en este
1:21:50sentido los péptidos según su carga. Y
1:21:54en este sentido el vertical por su peso.
1:21:57Después cada uno de estos fragmentos yo
1:21:59lo puedo cortar y poner en el
1:22:01espectrómetro de masa o cortar todos y
1:22:04ponerlos en el espectrómetro de masa y
1:22:06analizarlos.
1:22:08Otra forma de purificación son las los
1:22:10métodos de cromatografía líquida, en los
1:22:13cuales tengo un tubito donde tengo
1:22:17bolitas de compuestos que
1:22:20forman
1:22:22un forman como fuese unrejado también
1:22:25con espacios. Entonces, yo pongo la
1:22:27muestra de proteínas arriba y las
1:22:29proteínas que estén sean más grandes van
1:22:32a tardar más en pasar por este por esta
1:22:35por este tubito de cromatografía,
1:22:37mientras que las más livianas van a
1:22:39pasar más rápidamente. Entonces, yo
1:22:41mediante cromatografía por filtración en
1:22:44gel puedo separar las proteínas por su
1:22:47tamaño.
1:22:50Estas bolitas que yo tengo en este gel,
1:22:54puedo tenerlas cargadas. Entonces, puedo
1:22:56separar las proteínas por carga. Estas
1:22:59mismas proteín, estas mismos, este
1:23:01mismas bolitas de gel que yo tengo el el
1:23:04tubo de cromatografía, puedo tenerlas
1:23:06unidas a un anticuerpo, entonces me
1:23:08permiten retener determinadas proteínas.
1:23:10Entonces, mediante este procedimiento
1:23:12llamado cromatografía líquida, yo puedo
1:23:14separar mediante distintas técnicas
1:23:16distintos grupos de proteínas y luego
1:23:19utilizarlos para la espectrometría de
1:23:22masa.
1:23:24En la espectrometría de masa,
1:23:26básicamente lo que se hace es mediante
1:23:29un láser se puede cargar o ionizar la
1:23:33muestra de proteínas que luego se
1:23:37aceleran hacia un detector. Las más
1:23:40pequeñas van
1:23:41a transitar más rápidamente que las más
1:23:45pesadas. y voy a obtener un gráfico de
1:23:49picos de las distintos
1:23:52polipéptidos dependiendo de la velocidad
1:23:54con la cual se desplazaron. Entonces voy
1:23:56a tener un gráfico de barras, de picos
1:24:00de las distintas proteínas que tengo en
1:24:02la muestra que estoy
1:24:05analizando. Entonces,
1:24:08en en la en la en las técnicas de
1:24:12proteica, tengo un primer
1:24:14paso
1:24:16donde purifico y separo
1:24:20proteínas de una
1:24:22muestra y en un segundo paso introduzco
1:24:26esas proteínas que han sido previamente
1:24:29cortadas con una enzima en polipéptidos
1:24:32en un espectrómetro de masa. en el
1:24:34espectrómetro de masa, ionizo esos
1:24:38polipéptidos y los acelero. Esa
1:24:41aceleración va a depender del tamaño.
1:24:43Entonces, dependiendo de la carga y del
1:24:46tamaño, puedo separar las proteínas y
1:24:50saber qué proteínas y en qué cantidad
1:24:52relativas están en la muestra que estoy
1:25:02analizando. Disculpen que está tardando
1:25:05el pasaje de las de las
1:25:09diapositivas.
1:25:13Entonces, por ejemplo, yo
1:25:18puedo hacer un fraccionamiento
1:25:21subcelular y
1:25:23obtener péptidos de cada una de esas
1:25:26fracciones
1:25:28subcelulares y someterlo ometría de
1:25:31masa.
1:25:32Y entonces voy a tener una información
1:25:34sobre la cantidad de
1:25:36proteínas con que tengo en cada uno de
1:25:40esas fracciones subcelulares. Entonces
1:25:42voy a saber, por ejemplo,
1:25:45que
1:25:47tengo
1:25:4922,260
1:25:50péptidos que forman parte de
1:25:532197 proteínas, porque yo esos péptidos
1:25:56los analizo a través de información que
1:26:00tengo en la red.
1:26:03Esas proteínas, dependiendo de dónde las
1:26:05obtues, voy a saber que están en
1:26:07distintas localizaciones
1:26:08subcelulares y que tienen distintas
1:26:11características y distinta proporción,
1:26:13distinta cantidad.
1:26:17Entonces,
1:26:18volviendo al
1:26:20inicio,
1:26:23proteómica me
1:26:25permite
1:26:27analizarema biológico cuál es el
1:26:29conjunto de proteínas que se expresan y
1:26:32en qué cantidad. Es decir, se obtienen
1:26:35las proteínas de la muestra, se
1:26:37fragmentan, se pueden utilizar distintas
1:26:40técnicas para la purificación y
1:26:42selección de estas proteínas o péptidos
1:26:45fragmentados, como pueden ser eh una
1:26:48corrida electroforética
1:26:50bidimensional en cromatografía líquida o
1:26:55fraccionamiento
1:26:56subcelular o o separación por
1:27:00centrifugación con gradientes de
1:27:02densidad.
1:27:03y luego introduzco esas proteínas en un
1:27:07espectrómetro de masa en la cual se
1:27:11cargan iónicamente las proteínas y se
1:27:14aceleran y se van
1:27:17registrando esas proteínas que han sido
1:27:19aceleradas o esos péptidos que han sido
1:27:22acelerados dependiendo de la
1:27:26velocidad en que se desplazen, que
1:27:29depende de la relación más a carga.
1:27:31Entonces, voy a tener un gráfico donde
1:27:34tengo la distribución de las distintos
1:27:37péptidos dependiendo de su relación más
1:27:39a carga, la cantidad de cada uno de
1:27:42ellos dependiendo de la altura de los
1:27:43picos y luego esto lo analizo con
1:27:47fuentes informáticas que me permiten
1:27:50detectar a qué proteínas pertenecen cada
1:27:53uno de estos segmentos peptídicos.
1:27:55Luego de ese análisis, entonces saco la
1:27:58conclusión de qué proteínas y en qué
1:28:00cantidad se encuentran en ese sistema
1:28:03biológico.
1:28:05Entonces, haciendo una síntesis de la
1:28:09primer parte del seminario
1:28:12dos, hemos visto algunas técnicas que
1:28:15nos permiten trabajar,
1:28:18analizar proteínas.
1:28:22Dos de ellas se basan en la reacción
1:28:25antígeno anticuerpo, que son la
1:28:27inmunocitoquímica y el western blood. La
1:28:31inmunocitoquímica nos permite detectar
1:28:34la distribución en un tejido o en una
1:28:36célula de una determinada proteína.
1:28:40El western blot nos
1:28:42permite detectar la presencia o no de
1:28:46una proteína, la cantidad relativa y el
1:28:48peso molecular de una proteína en un
1:28:52homogenato, en el plasma y no nos
1:28:55permite ver la distribución dentro de
1:28:58ese tejido que homogeneizamos. Si
1:29:01queremos saber la distribución dentro
1:29:03del tejido que homogeneizamos,
1:29:05necesitamos
1:29:07hacer un celular.
1:29:10para saber si la proteína está en un
1:29:11determinada fracción. Esto no es lo
1:29:14habitual. Generalmente el westermelo se
1:29:16hace a continuación de un de un
1:29:19homogenato o de una muestra de plasma.
1:29:22Hablamos también de la cintometría de
1:29:23flujo que nos permite analizar células
1:29:28que van pasando por un flujo líquido y
1:29:31que son analizadas a través de un láser
1:29:36según la emisión de luz.
1:29:40que se
1:29:42emite, que emite cada una de las células
1:29:45al pasar por ese láser. La reacción
1:29:48antígeno anticuerpo a través de una
1:29:50fluorescencia me permite marcar algunas
1:29:52de células y otras no. Entonces, a
1:29:54través de la citometría de flujo me
1:29:56permite separar las células marcadas de
1:29:58las que no están marcadas.
1:30:01Y por último,
1:30:03hemos visto el concepto de proteica que
1:30:06nos permite
1:30:10analizar
1:30:12globalmente las proteínas que se
1:30:14expresan en un tejido en un determinado
1:30:17momento. Entonces, la inmunocitoquímica
1:30:19y el western blot nos permite analizar
1:30:22proteínas individuales en un sistema
1:30:25biológico, mientras que la proteica nos
1:30:27permite analizar el conjunto de
1:30:29proteínas en un sistema biológico. Lo
1:30:33importante que ustedes deben saber de
1:30:35estas técnicas es saber cuáles son los
1:30:38fundamentos, cuál es la información que
1:30:40nos dan y como consecuencia de esa
1:30:42información cuáles son las ventajas y
1:30:43las desventajas de cada una de esas
1:30:45técnicas y cuáles son las utilidades de
1:30:48estas técnicas.
1:30:51De esta forma terminamos entonces con el
1:30:53seminario de hoy con la primer parte y
1:30:58en la próxima parte que la vamos a dar
1:31:00en una próxima filmación vamos a
1:31:03analizar técnicas que nos permitan
1:31:05estudiar ácidos nucleicos. M.

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