Procesamiento de muestras para Microscopía Electrónica — Transcript

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1. 0:00[Música]
2. 0:02muy buenas en este vídeo vamos a
3. 0:05explicar el procesamiento de muestras
4. 0:06biológicas para su observación el
5. 0:08microscopio electrónico de transmisión
6. 0:11nos encontramos en el departamento de
7. 0:13histología de la Universidad de navarra
8. 0:15Yo soy Alfonso calvo profesor de
9. 0:17biología celular conmigo están
10. 0:20David y eukene que son técnicos del
11. 0:24departamento especialistas en
12. 0:26microscopía también se encuentran con
13. 0:28nosotros John e irati que son alumnos
14. 0:32internos del departamento
15. 0:35[Música]
16. 0:37comenzamos Para qué se utiliza el
17. 0:38microscopio electrónico de transmisión
18. 0:41fundamentalmente en biología y medicina
19. 0:43el microscopio electrónico de
20. 0:44transmisión se utiliza para observar la
21. 0:47ultraestructura celular es decir para
22. 0:49ver organos el microscopio electrónico
23. 0:51de transmisión utiliza un a de
24. 0:53electrones acelerado modificado por
25. 0:56bobinas electromagnéticas que nos van a
26. 0:58permitir aumentar mucho la
27. 1:00y por tanto podemos observar estas
28. 1:02estructuras con una gran calidad existen
29. 1:05fundamentalmente dos tipos de
30. 1:07microscopio electrónico el microscopio
31. 1:09electrónico de transmisión con el que
32. 1:10vamos a poder estudiar cortes de células
33. 1:13y tejidos y el microscopio electrónico
34. 1:16de barrido que nos va a permitir el
35. 1:17estudio tridimensional de superficies de
36. 1:21células y tejidos a gran aumento el
37. 1:25procesamiento de muestras para
38. 1:26microscopía electrónica y al igual que
39. 1:28ocurre con la microscopía óptica
40. 1:30requiere cuatro pasos primero la
41. 1:32fijación en segundo lugar la inclusión
42. 1:34en un medio que nos permita eh cortar la
43. 1:37muestra posteriormente el corte que se
44. 1:40realiza en un aparato llamado ultr
45. 1:42microtomo y el contraste lo que
46. 1:44equivaldría microscopía óptica a la
47. 1:47tinción de las
48. 1:49[Música]
49. 1:51muestras el objetivo de la fijación es
50. 1:53preservar la morfología del tejido así
51. 1:55como las estructuras celulares en el
52. 1:58procesamiento de las muestras la
53. 2:00microscopía electrónica utilizamos
54. 2:02fijadores multifuncionales como el glut
55. 2:05aldeido y el óxido deoso no utilizamos
56. 2:08fijadores precipitantes porque
57. 2:10alterarían la la estructura del tejido
58. 2:13bien pues entonces ahora irati lo que va
59. 2:15hacer es extraer nuestra solución de
60. 2:18rter deido que es que ha estado fijando
61. 2:20nuestro tejido durante 8 horas para
62. 2:22después Añadir sacarosa que va a
63. 2:25permitir mantener el tejido durante
64. 2:27hasta el momento de la inclusión
65. 2:45[Música]
66. 2:55con una pipeta pastel le le quitamos
67. 2:57toda la solución de sacarosa y después
68. 2:59pu le añadimos el tetróxido de osmio El
69. 3:03osmio tiene una doble función por un
70. 3:05lado nos sirve para la poración y por
71. 3:09otro al ser un metal pesado y además
72. 3:11tener afinidad por los líquidos nos
73. 3:14permite dar contraste al a las
74. 3:17membranas después de haber tenido el
75. 3:20tejido en det toxido de osmo 2 horas y
76. 3:23media a 4 grados en la nevera lo sacamos
77. 3:26y vemos cómo se ha oscurecido
78. 3:30a continuación eh vamos a retirar el
79. 3:32tetróxido de osmio y vamos a Añadir
80. 3:34buffer de veronal para
81. 3:41lavar retirado el
82. 3:43veronal vamos a comenzar con la
83. 3:46deshidratación del tejido mediante
84. 3:48alcoholes de gradación creciente
85. 3:50comenzando con alcohol deo
86. 3:57[Música]
87. 4:03después de haber pasado la muestra por
88. 4:05alcoholes de gradación creciente
89. 4:07retiraremos el alcohol absoluto donde
90. 4:10está la muestra para poder añadirle
91. 4:13después óxido de
92. 4:17propileno el óxido de propileno es una
93. 4:21sustancia de transición entre el alcohol
94. 4:23absoluto y la resina epoxi ya que es
95. 4:27misible en ambas
96. 4:31[Música]
97. 4:33present ahora tenemos la muestra en una
98. 4:35mezcla uno a uno de epon propil hemos
99. 4:38tenido la muestra en esta mezcla durante
100. 4:40dos horas manteniendo la última media
101. 4:42hora en los tarros
102. 4:44dapad lo siguiente es introducir las
103. 4:47muestras dentro de estas cápsulas con
104. 4:50epon Por qué utilizas epon epon es una
105. 4:54resina que tiene una alta dureza a
106. 4:57temperatura ambiente es
107. 5:00y se forma a partir de una mezcla entre
108. 5:03diferentes
109. 5:04resinas Este es el aspecto que tiene la
110. 5:07cápsula con el tejido
111. 5:09dentro tenemos la estufa a 60 gr
112. 5:12programada entonces introducimos la
113. 5:15muestra para que
114. 5:22polimer después de dos días en la estufa
115. 5:25la resina ha adquirido una gran dureza
116. 5:27euken ahora está cortando la cápsula
117. 5:30para darle forma piramidal así después
118. 5:33podremos cortarla para hacer cortes de
119. 5:36una micra en en el ultramicrotomo
120. 5:39[Música]
121. 5:42[Aplausos]
122. 5:43[Música]
123. 5:49para cortar la pirámide utilizamos
124. 5:52cuchillos de vidrio o de diamante en
125. 5:54este caso de V el cuchillo tiene el filo
126. 5:59aquí y creamos un pocillo con una cinta
127. 6:02metálica en torno Al filo este pocillo
128. 6:05lo llenamos con agua para que cuando se
129. 6:08de el corte los cortes queden flotando
130. 6:10en la
131. 6:11[Música]
132. 6:16superficie en microscopía electrónica el
133. 6:19aparato que utilizamos para cortar es el
134. 6:21ultramicrotomo este se compone de varias
135. 6:23partes una de ellas una base donde
136. 6:26ponemos el cuchillo de vidrio
137. 6:29un brazo móvil en donde vamos a colocar
138. 6:32la
139. 6:33[Música]
140. 6:40pirámide con el brazo móvil vamos a
141. 6:43poder bajar y subir la pirámide Y
142. 6:45obtener los
143. 6:48[Música]
144. 6:54punos ya está la pirámide orientada para
145. 6:57cortar el corte semifino
146. 7:00he puesto 1000 nanómetros de
147. 7:03espesor Así que vamos a
148. 7:05[Música]
149. 7:07ir primer
150. 7:08[Música]
151. 7:15corte
152. 7:17[Música]
153. 7:20segundo una vez que tenemos los cortes
154. 7:24flotando en el agua con un palillo unido
155. 7:28a una pestaña
156. 7:35voy a llevar los cortes a una placa
157. 7:36térmica 50 gr
158. 7:39[Música]
159. 7:41secj lación
160. 7:46y para la tinción añadimos un poco de
161. 7:49azul de choina sobre la
162. 7:54muestra después hacemos la
163. 7:56diferenciación con alcohol de 50
164. 8:00lo
165. 8:01secamos y volvemos a dejar la muestra
166. 8:03sobre la placa de 50 gr ahora voy a
167. 8:07realizar cortes ultrafinos a 50
168. 8:09nanm 0,05 m Pero qué eso es Misión
169. 8:16[Música]
170. 8:23Imposible ya tengo los cortes en el
171. 8:25trillo de agua entonces voy a pescarlos
172. 8:29con una
173. 8:34rejilla y me ayudaré también de un pelo
174. 8:38de pestaña pegada un Pillo
175. 8:59ya tenemos todo preparado para el
176. 9:01contraste tenemos el agua filtrada el
177. 9:03acetate anilo Entonces el contraste
178. 9:06consiste
179. 9:07primero en poner las redes el corte con
180. 9:10acatur hilo y posteriormente con citrato
181. 9:13de plom ahora vamos a realizar el primer
182. 9:16contraste con acatur Nilo que va a
183. 9:19consistir en 30 minutos a 37
184. 9:24gr vamos a
185. 9:26filtrar y depositar una
186. 9:31goa
187. 9:32sobre una lámina de cera para así crear
188. 9:37una gota lo más esférica posible y de
189. 9:40esta manera poder colocar la r encima de
190. 9:44la gota y que el tejido esté en contacto
191. 9:47con el
192. 9:48[Música]
193. 9:53producto posteriormente haríamos lo
194. 9:55mismo con citrato de plum
195. 9:59después de este procedimiento tan largo
196. 10:02vamos a pasar por fin a la habitación
197. 10:05del microscopio
198. 10:12electrónico
199. 10:14Wow qué
200. 10:16maravilla siempre me quedo impresionado
201. 10:19Cuando veo este aparato pues este es el
202. 10:21microscopio electrónico de
203. 10:23transmisión es un de la cas 120 y como
204. 10:28la mayoría de losos electrónico de
205. 10:29transmisión tiene como cinco sistemas
206. 10:31importantes que son el sistema vacío el
207. 10:35sistema de refrigeración el sistema de
208. 10:38iluminación y la columna de las lentes y
209. 10:41el sistema de captura de imágenes para
210. 10:45iluminar eh tenemos un filamento de
211. 10:48tusteno que estaría más o menos a esta
212. 10:49altura del que salen los electrones y
213. 10:53sobre el que actúa una alta tensión de
214. 10:56hasta 120,000 V puede llegar a este
215. 10:59equipo Aunque para muestras biológicas
216. 11:01nosotros solemos trabajar un poco menos
217. 11:03a 80,000 w las lentes eh En este caso al
218. 11:08contrario que el que microscopio óptico
219. 11:09que son cristales aquí son bobinas
220. 11:12electromagnéticas y también tenemos pues
221. 11:15lentes
222. 11:16condensadoras lentes objetivo y lentes
223. 11:20proyectoras que son las que nos dan los
224. 11:22grandes aumentos al finalizar al abajo
225. 11:26del tod de la columna de las lentes
226. 11:29finalmente veremos la imagen en esa
227. 11:31pantalla fluorescente que tenemos
228. 11:34aquí Bueno bien entonces eh A qué nivel
229. 11:38se mete la muestra en el microscopio y
230. 11:40la rejilla que hemos preparado Cómo se
231. 11:42introduce en el microscopio electrónico
232. 11:44bien pues en este equipo lo que nos
233. 11:46falta por ver es el inyector de
234. 11:49muestra aquí Este es un sistema especial
235. 11:52que
236. 11:54utiliza
237. 11:56para introducir la muesca las regillas
238. 11:58se van meter aquí ahora Estamos sacando
239. 12:00el indor de muestra porque eso está en
240. 12:03en alto vacío claro Sí Dentro del
241. 12:04microscopio hay un vacío este
242. 12:06microscopio ahora mismo estamos
243. 12:08trabajando a 10 elevado men7 mm de
244. 12:13mercurio ahora vamos a quitar la la tapa
245. 12:16del inyector de
246. 12:24monstra esta es la caja una cajita donde
247. 12:27almacenamos las rejillas
248. 12:35limpiamos las pinzas la limpieza es
249. 12:38importante siempre microscopia
250. 12:48electrónica volvemos a poner la tapa
251. 13:00ya tenemos la muestra
252. 13:02preparada para volver a
253. 13:05introducirla dentro de la
254. 13:10columna Bueno ahora que ya tenemos eh la
255. 13:13rejilla la muestra dentro de la columna
256. 13:15vamos a ya el último paso es
257. 13:17visualizarla en el microscopio
258. 13:19electrónico de transmisión vamos a
259. 13:21apagar la luz vamos a trabajar con con
260. 13:26oscuridad lo primero que vamos a hacer
261. 13:28es
262. 13:31desenfocar una vez que está enfocado y
263. 13:33elegimos el campo que queremos que salga
264. 13:35en quc dejemos el campo vamos a capturar
265. 13:39la
266. 13:40imagen con la cámara digital y ya vemos
267. 13:44la
268. 13:47imagen puedes aumentar un poco la imagen
269. 13:51para por ejemplo esta zona de aquí
270. 14:01mediante el histograma vamos a
271. 14:04seleccionar la intensidad el contraste
272. 14:07ideal y ahora vemos la imagen final
273. 14:10donde podemos reconocer distintas
274. 14:12estructuras del músculo como núcleo
275. 14:14mitocondrias glucógeno bandas Z y Bandas
276. 14:18m bueno con esto hemos terminado
277. 14:20Esperamos que este vídeo os haya
278. 14:22resultado am meno didáctico y hasta la
279. 14:28próxima y