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Precipitacion 3 — Transcript

by Omar Gonzalez Ortega, PhD · 3,389 words · 573 segments · language en · Watch on YouTube

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0:00y terminar con la presentación de
0:02precipitación
0:05nos quedamos en ahora todos los dos
0:08vídeos anteriores serán precipitamos a
0:11la proteína de interés que no se
0:13desnaturalice y luego preparamos ese
0:15sólido y lo re disolvemos y seguimos
0:18purificando en caso de que
0:21de que se haya precipitado mi proteína
0:23de interés y algunos otros o algunas
0:26otras proteínas
0:29y teníamos las opciones después mueve el
0:32inmueble al ph y adiciona sales
0:35adicional y solvente orgánico o
0:37adicional
0:39y polímeros no hay únicos
0:43la otra opción que ya comentaba también
0:45era
0:47en la primera opción está precipitando
0:49la proteína de interés y en solución
0:51quedan las proteínas contaminantes lo
0:53que vamos a ver aquí en esta en la
0:55primera parte de esta presentación es
0:59es el otro enfoque que es precipita a
1:03las proteínas contaminantes y que en
1:05solución te quede la proteína de interés
1:07separas el sólido de la solución pero
1:10ahora te quedas sigues trabajando con la
1:12solución porque ahí está la disuelta la
1:14proteína de interés que para que este
1:16enfoque funcione la proteína de interés
1:19no debe precipitarse entonces lo que sea
1:23que se vaya a hacer no debe perturbar la
1:25ella sólo debe afectar a las
1:27contaminantes entonces tu proteína debe
1:29ser resistente a eso que hagas para que
1:32se precipiten los contaminantes si tu
1:34proteína nos resiste pues está
1:36precipitando no te va a servir este
1:38enfoque entonces aquí dependes de la
1:40proto proteína de interés si resiste lo
1:43que vas a lo que vas a hacer
1:46entonces es lo que está aquí en esta
1:48primera diapositiva
1:51si tu proteína de interés presenta
1:52estabilidad en condiciones extremas de
1:54temperatura ph o solventes orgánicos la
1:57concentración puede solvente orgánicos
1:59podemos entonces utilizar este es el
2:01segundo enfoque y aquí está lo que vamos
2:03a ver las opciones
2:06qué serían estas tres temperatura ph y
2:09solventes orgánicas
2:11en el caso de naturación por temperatura
2:14las ecuaciones las veo en el siguiente
2:16vídeo
2:18la descripción pues matemática de el
2:21proceso de desnaturalización no por
2:22temperatura más bien por el incremento
2:24en la temperatura
2:27como sabemos todas las proteínas
2:30si sube la temperatura de todas de una
2:34solución no importa qué proteína tenga
2:36si lo sube lo suficiente la proteína se
2:39va a precipitar pero lo va a hacer de
2:42manera irreversible
2:44qué es lo que pasa cuando se cocina un
2:46huevo y el huevo pues tiene un montón al
2:49de proteína
2:51rompemos el cascarón sale la yema y la
2:54clara
2:55que hizo son fluidos muy viscoso por la
2:59alta concentración de proteína
3:01y qué es lo que hacemos lo cocinamos y
3:03subimos la temperatura y se ocurre una
3:07precipitación al subir la temperatura
3:08estas favoreciendo el efecto hidropónico
3:11la interacción hidrofóbica y las
3:13partículas de proteína empiezan a unirse
3:14por el sector fólico y eventualmente
3:16dejan de estar disueltas y en ese
3:19momento es cuando el huevo ves que era
3:21era transparente y ahora ya está blanco
3:23o amarillo para el caso de la hiena
3:26con mi intensidad pues que ya no es
3:29transparente ni la yema ni la clara
3:32y se debe entonces a esa precipitación
3:35irreversible de proteínas no hay forma
3:38de que mejor y es el huevo ya cocinado y
3:40al enfriarse se regrese a la yema y a la
3:44clara original y por eso es que es
3:46irreversible
3:48no vamos a hablar de subir la
3:49temperatura tanto hasta el punto de que
3:52precipitemos de
3:54pase esta parte no más bien si vamos a
3:57subir la temperatura porque porque las
4:00proteínas combinan test son las que se
4:02van a precipitar no me interesa
4:04recuperarlas no me interesa que se
4:06puedan revisó los tintes y así es como
4:09funciona este
4:11aquí hay información
4:14gráfica más o menos de lo que estoy
4:16estableciendo acá por acá en el eje ya
4:18está el porcentaje de proteína que
4:21permanece sin desnaturalizar los aquí
4:23tienes 100 por ciento pues tienes tu
4:25solución y tiene toda la proteína del
4:27100 por ciento de la proteína disuelta y
4:30estás pues no sé a 35 grados en tiras y
4:33empiezas a calentar
4:35en esta representación que está aquí
4:38tienes 5 proteínas en solución la p1 p2
4:43p3 p4 y p5
4:48no tiene cinco proteínas y empiezas a
4:50calentar supongo que llegamos a hasta 45
4:59como ves la proteína
5:01voy a trasladar la cola del cielo
5:05como de las proteínas las 5 y la 4 que
5:09siguen estando completamente disueltas
5:11el 100% no les afectó que tuviéramos la
5:14temperatura la p3
5:16por el contrario ya bajamos del 100% lo
5:19que implica que algo de la proteína 3
5:22que estaba en solución ya se precipitó
5:25por la atracción de subir la temperatura
5:28la proteína 2 bajó todavía más
5:33y la proteína 1 pues anda por acá en 70%
5:38lejos
5:40entonces la proteína
5:431 el 30% ya la vez ya se precipitó sólo
5:47queda en solución el 70 por ciento la
5:49está desnaturalizando por acción de la
5:52temperatura del incremento de la
5:53temperatura
5:55vamos a subir hasta 50
5:59seguimos calentando
6:01las proteínas 4 y 5 pues a ellas les dio
6:04igual que esté la solución en 50 siguen
6:06estando disueltas del 100 por ciento de
6:093 pues ya abajo y anda como el 75 por
6:12ciento
6:13lados
6:15y anda por acá a lo mejor en 15%
6:20y la 1
6:22pues anda por acá con el 30% de las
6:26proteínas 1 2 y 3 son claramente más
6:29sensibles al calentamiento que la 4 y la
6:315 entonces
6:33podemos llegar
6:38qué será
6:43vamos aquí a 57.5
6:49de temperatura
6:51ahí ya las proteínas las dos que está
6:55cambios ya todas se precipitó la 1
6:58también la 3
7:00pues anda por aquí
7:01digamos que donde en un 25% el 75% días
7:05del principito pero ya empezamos a
7:06aceptar a la 4 la 4 ya lo mejorando en
7:1040% y las 5 tantos también ya la también
7:14ya la afectamos a la proteína 5 pero
7:19pues digamos que andamos todavía en el
7:2175% de lo que originalmente estaba
7:24disuelto
7:27entonces a esta temperatura vas a tener
7:30un sólido que tiene el 100% de la
7:35proteína 1 y de la 2 tiene el 75% de la
7:403
7:42tiene el 60% de la 4
7:46y tiene el 25% de las 5
7:50es en solución
7:53ya ya solo te están quedando las
7:56proteínas 3 4 y 5 hasta esta temperatura
7:59de aquí
8:02entonces ya avanzaste en tu proceso de
8:06purificación como digo lo que te
8:09interesa aquí es la solución y este lo
8:12que está representado aquí es que solo
8:13tiene sentido este este enfoque si tu
8:17proteína de interés es 5 y tiene más
8:20resistencia al calentamiento está más
8:22desplazado hacia la derecha pues su
8:24curva no está aquí que sería
8:25completamente sensible a la temperatura
8:27su curva la queremos que donde por acá
8:29para que resista más al incremento de la
8:32temperatura
8:33esto sería desnaturalización
8:36desnaturalización por por calentamiento
8:38por acción de la el incremento en la
8:40temperatura
8:46bueno voy a decir el ejemplo como dijo
8:50luego ya
8:51a hacer en el siguiente vídeo está esa
8:55opción luego aquí nada más como un
8:58comentario particular la polimerasa la
9:02enzima que se utiliza para hacer la pcr
9:04la pcr pues seguramente hicieron alguna
9:10en la presa al temperaturas altísimas la
9:13polimerasa deberse forzosamente a
9:16resistir esas temperaturas altísimas
9:17entonces ella es una proteína que cae en
9:20esta categoría de es mi proteína de
9:23interés y las produjera por ejemplo de
9:24manera recombinante lo podemos purificar
9:26muy sencillo nada más subiendo la
9:28temperatura de la solución se van a
9:30precipitar la mayor de las proteínas y
9:32ella seguramente va a ser la única que
9:35sobreviva
9:36entonces si hay proteínas pero ya
9:38dependemos de los casos en particular
9:42bueno la otra opción es pues cambiamos
9:47el ph
9:52pero vayámonos phs extremos
9:57tenemos nuestra solución de proteínas y
9:59vamos a empezar a agregar protones
10:02pero nos vamos a ir a ph muy bajos
10:06qué es lo que va a pasar otra vez las
10:08proteínas se comportan diferentes
10:10las proteínas por ejemplo que tienen
10:13puntos eléctricos bajos pues son porque
10:16funcionan en ambientes ácidos
10:18y ellas resisten más a ese ambiente
10:21ácidos para y proteínas que tienen
10:22puntos eléctricos del 7o arriba
10:25y si bajamos el ph mucho son mucho más
10:27inestables entonces las proteínas si
10:30tienen diferencias o se comportan de
10:32manera diferente a la hora que nos
10:33movemos a los extremos
10:36aquí de manera general está representado
10:39qué es lo que pasa a la hora que
10:41agregamos bajamos mucho el ph
10:45como saben pues estos son los los carros
10:48chinos que proporcionan cargas negativas
10:51y las aminas
10:53que en condiciones fisiológicas pues
10:55proporcionan cargas positivas en una
10:57proteína también ya sabemos que si
11:00empezamos a agregar así que ha sido pro
11:03tomamos a este cargo silo y agregamos
11:06mucho ácido pues los protejamos a todos
11:10entonces lo único que va a sobrevivir
11:12aquí hay error y lo único que va a
11:13sobrevivir
11:14son las aminas que proporcionan casos
11:17positivos
11:21adicionalmente no se les olvide que el
11:24agua tiene afinidad por cosas cargadas y
11:27pequeñas entonces el agua prefiere
11:29interactuar con este entonces también si
11:32ya había moléculas de agua rodeando
11:36o la que había si estas son las
11:37moléculas de agua
11:39que están disolviendo la proteína pues
11:42ahora resulta que ellos quieren
11:43prefieren venirse a disolver este y es
11:46lo que está representado aquí va a haber
11:47una salida de moléculas de agua eso va a
11:49dejar de disolver a la proteína
11:51adicionalmente como cargamos la proteína
11:55positiva
11:57se presentan repulsión es dentro de la
12:00una proteína es decir estas cargas
12:01empiezan a revelarse
12:05y eso termina abriendo a la proteína se
12:08pierde la estructura terciaria que lo
12:10que está representado acá abajo se
12:12empieza por estas repulsión es empieza a
12:15abrirse y se pierde la estructura se
12:17desnaturaliza
12:20entra en efecto y ver fóbico se une se
12:22forma un precipitado que ya no puedes
12:24disolver pero no te interesa entonces
12:26para que funcione esta proteína debe
12:28resistir ph es bajos o ph saltos
12:32es otra opción y la última opción es
12:35adiciona solvente orgánicos que ya lo
12:37veíamos en el vídeo anterior pero ahora
12:39es lo voy a agregar a temperatura
12:41ambiente y en contracciones más altas
12:42porque lo quiero especificar a los
12:44contaminantes el requisito es el mismo
12:47la proteína de interés tiene que
12:49soportar esas altas concentraciones y
12:51altas temperaturas desde el solvente
12:53orgánico
12:56entonces se hace a temperatura ambiente
13:01se deje incubar que se precipite en los
13:03contaminantes y realizamos para que la
13:05de interés permanezca mayormente
13:07disuelta
13:17aquí hay aquí en la segunda viñeta hay
13:19un ejemplo el alcohol deshidrogenasa
13:21está encima de la levadura
13:23la podemos purificarse adicionamos al
13:26medio 30% de 33% de etanol a 25 grados
13:31en esa contracción orgánico es altísima
13:33la mayoría las proteínas se van a
13:34desnaturalizar por esta concentración
13:36tan alta de solvente blanco
13:38de tu proteína tiene que resistir ese
13:41cambio para permanecer en solución y que
13:43las contaminantes pues si caminan se
13:45precipiten no nos importan
13:48aquí hay información de una
13:51deshidrogenasa encima
13:55y en este mismo esquema de vamos a
13:58agregar solvente orgánico tiene el eje x
14:00está la concentración el porcentaje de
14:03alcohol y acá en el eje pues está una
14:07medida de
14:09cuánto queda todavía en solución de tu
14:12proteína entonces vamos a empezar con el
14:15100 por ciento
14:18toda la proteína está disuelta la enzima
14:22está disuelta y aquí hay varias curvas
14:23como ven hay curvas para metanol etanol
14:28voy a hablar de este joven 21 propaganda
14:33hay más cosas para más alcohol eso lo
14:35voy a describir esas 3
14:37qué es lo que sabemos respecto a
14:40hidrofobicidad lo que sabemos es que el
14:43propano
14:46es mas hidrofóbico que el etano
14:49y el etanol es más hidrológico que el
14:51metano nada más por el número de
14:53carbonos que tiene
14:55y eso se traduce a cómo impactan a la
14:59precipitación de las proteínas entonces
15:02la curva del
15:04[Música]
15:05del metanol
15:11qué es esta de arriba
15:14que sigue este comportamiento
15:18con 100 empezamos a agregar el metanol
15:21pero y eventualmente en algún punto
15:24empieza a bajar ya no tengo el 100% de
15:27la proteína disuelta
15:29y empiezo a bajar sigo subiendo
15:31concentración de metano
15:33sigo precipitando más proteínas
15:38vamos a comparar esa curva con el etanol
15:42estando al igual pues empezamos en 100
15:45pero luego empieza a perturbar empieza a
15:48precipitar proteínas y empieza a bajar
15:50la concentración de proteínas vamos a
15:54ver esas dos curvas
15:56y supongan que adicionamos entonces
16:00adicionamos
16:04a uno o el otro alcohol a esta
16:07concentración al 30%
16:10tenemos nuestra solución de encima y
16:11agregamos tenemos los experimentos de no
16:14agregamos metanol y en otro talón que es
16:17lo que está representado aquí
16:19que con metanol tienes todavía
16:23aproximadamente el 60 por ciento de
16:25proteína disuelta el 40 por ciento ya es
16:28el principito
16:30pero si lo haces conectando pues resulta
16:33que ya tienes el 0% de soltería
16:35precipita este tono y entonces también
16:38importa la hidrofobicidad del solvente
16:41mientras más hidrofóbico sea pues es
16:43mejor precipitante más expone la
16:45proteína al mismo solvente y se
16:47precipita
16:51y tienes que va a hablar del propano si
16:54hacemos el experimento con propano como
16:56ven el propano a partir de aquí le digan
16:58como 15 por ciento de alcohol boggiano
17:02de proteína por ser más hidrofóbico
17:04entonces si depende del solvente
17:06orgánico éste está esta precipitación
17:08depende grandemente como ven
17:12independientemente eso tu proteína tiene
17:15debe resistir esa adicción desaliento
17:17blanco no se puede precipitar
17:20siempre se precipite que lo que sea en
17:22menor proporción que las proteínas
17:23contaminantes
17:30finalmente entonces para precipitar para
17:32el segundo enfoque de precipitó
17:33contaminantes me quedo con la de interés
17:35en solución tienes tres opciones sobre
17:38la temperatura baja el ph
17:41o adición al solvente orgánicos a
17:43concentraciones altas y a temperatura
17:45ambiente en los tres proteínas debe
17:47resistir el tratamiento que no se
17:50precipite o que se precipite lo menos
17:51que se pueda
17:53bueno finalmente está la precipitación
17:56por ahora similar
17:58el problema de él
18:01de la precipita del primer enfoque donde
18:04precipitamos a la proteína de interés
18:07y en ley las contantes quedan en
18:09solución el problema es que la proteína
18:12de interés seguramente está disuelta
18:14junto con muchas otras proteínas
18:17y cuando adiciona sales o lo que sea que
18:20decidas hacer no solo se precipita la
18:23proteína de interés en el sólido también
18:24se precipitan juntos en el mismo sólido
18:28pues va hasta la proteína interés y
18:29algunas contaminantes
18:33entonces lo que trata decir es que esas
18:35precipitaciones no son selectivas
18:37perturbamos a todas las proteínas
18:40en menor o en mayor medida lo que se
18:43busca es que perturbe yo precipite en
18:45mayor medida a la de interés se van a
18:49presentar más contaminantes pero busco
18:50que sea en menor medida medida entonces
18:52al final en el sólido sigue tienen una
18:54mezcla de proteínas que se le hiciste
18:56bien está enriquecida en la proteína de
18:59interés
19:01bueno entonces el enfoque mejor sería
19:05porque nos precipitamos a la proteína de
19:08interés pero que exclusivamente se
19:10precipite ella
19:13como lo hacemos lo podemos hacer a
19:14través de precipitación por afinidad
19:20comienza aquí es selectivo es lo que
19:22estoy diciendo
19:24y aquí pues se va a utilizar la parte
19:26que veíamos en la introducción a la
19:28separación es la parte de reconocimiento
19:30molecular
19:36entonces lo que vamos a hacer es
19:38utilizar reconocimiento molecular y
19:43aquí están los dos ejemplos
19:47esta es la proteína de interés
19:53podemos entonces tener en la solución
19:55nuestra proteína interés y agregarle un
19:57anticuerpo que reconoce a esa proteína
19:59de interés que es esta y está
20:02representado aquí
20:04ese anticuerpo se va a unir en las dos
20:06regiones de estas variables a la
20:09proteína de interés y adicionó más
20:12moléculas de
20:16de anticuerpos y se va a formar pues una
20:18cadena como ven ahí
20:21entonces pero ese reconocimiento pues es
20:24muy selectivo solo se va a unir a
20:26nuestra proteína de interés y se va a
20:28formar esta cadena
20:30entonces es selectivo en ese aspecto si
20:32hay muchas contrastantes no importan no
20:33se van a unir
20:36y lo otro que está creándose con esta
20:39unión es que se está formando esta tira
20:42que es muy grande y va creciendo de
20:44tamaño muy rápido y eventualmente el
20:46agua ya no quiere disolverla y por nada
20:48más por tamaño del que note y sólo a ti
20:50me voy a encantar con moléculas de agua
20:53o con moléculas de proteína que no estén
20:56en este esquema y se precipita entonces
20:59vamos a generar un sólido que tiene dos
21:02componentes nuestra oportunidad de
21:04interés y el anticuerpo entonces
21:08pero sólo ellos dos tendremos que hacer
21:10un paso adicional para separar esos dos
21:13compuestos y poder utilizar el
21:16anticuerpo
21:18pero pues ya pasamos de esa situación
21:20que ya nada más son dos
21:23cuando pudieran ser diez o quince o
21:26veinte
21:26entonces si avanzas más en la
21:29purificación para el caso de proteínas
21:32con la estructura cuaternaria podrás
21:34agregar pues esta molécula que está
21:37representado así como una tira pero que
21:39tiene dos sitios de unión con la
21:41proteína de
21:42de interés pero tiene estructura contern
21:45al entonces pudieran formarse estas
21:47redes por los otros monómeros de
21:50proteína que forman en la estructura
21:52cuaternaria y ahora formar una red y
21:56entonces yo agregué esto
21:58y se forma una red porque tiene dos
22:00sitios de unión en los extremos similar
22:02a lo que pasaba con el anticuerpo de
22:04hecho pudiera ser anticuerpo lo de abajo
22:07pero se generan redes porque tiene
22:10estructura cuaternaria y entonces
22:11también precipitó y en ese sólido pues
22:15sólo está la proteína tetra américa o no
22:18lo que está representado aquí más lo que
22:20agregué para precipitar pero
22:23las uniones estas líneas de aquí como ya
22:25son muy específicas
22:29me baso en el reconocimiento el número
22:31de interacciones para que el
22:33reconocimiento sea más selectivo
22:38bajo ese mismo esquema alguien dijo ven
22:41y por qué no agregamos anticuerpos está
22:44bien porque no usamos este enfoque
22:47pero desde un inicio porque no agregamos
22:50el anticuerpo pero unido a una molécula
22:53muy grande para que en cuanto desee una
22:56la proteína de interés se tiene el
22:57sonido muy rápido y eso lo que está
22:59representado aquí ganamos dos cosas con
23:02ceros entonces tenemos esto se llama
23:05macro ligando que es pues es una es un
23:08polímero es una cadena muy larga y tiene
23:11como ven tiene unidos a los anticuerpos
23:14lo adicionamos a nuestra solución de
23:17proteínas donde está la de interés
23:21y se van a unir como ven aquí de unir
23:24selectivamente
23:26pero ya se hace un monstruo conforme se
23:28empiezan a unir la próxima interés se
23:31hace un monstruo y se precipita y lo que
23:34está representado aquí aquí hasta el
23:35monstruo unido a la oportunidad interés
23:38y en solución pues quedan las cuestiones
23:40en contaminantes
23:44como hace un sólido podemos separar los
23:46que vamos a ver en el siguiente tema o
23:48en dos temas más adelante no recuerdo
23:49podemos separar el sólido de la solución
23:52muy de manera muy sencilla
23:59ya que tenemos ese producto podemos
24:02perturbar
24:04podemos reviso al verlo
24:07y perturbando la interacción perturbando
24:10esto que se formó aquí ya sabemos que
24:12podemos perturbar las interacciones
24:14aunque sean en antígeno anticuerpo
24:17mientras sepamos qué tipo de
24:19interacciones hay cuando es antígeno
24:20anticuerpo es muy sencillo perturbar esa
24:22unión bajando el ph aquí pudiéramos
24:25tomar el sólido que es el macro ligando
24:28más la proteína de interés y disolver
24:31una solución ácida y eso va a hacer que
24:33se rompe la interacción joven aquí ya no
24:35hay interacción
24:36y tienes una solución que tiene dos
24:39componentes el macro ligando y la
24:41proteína de interesante pero mejoró
24:43ligando como estar pintado aquí es muy
24:44grande entonces también como vamos a ver
24:47eventualmente
24:50separar cosas
24:53o representar aquí el problema y la
24:55proteína de interés separar cosas muy
24:58muy que son de tamaños muy diferentes es
25:02relativamente sencillo puedo poner una
25:04barrera donde solo pase en mi proteína
25:07de interés
25:09y el macro ligando no puede atravesar
25:11entonces se para otra vez repito esta
25:14parte separar por tamaño siempre que las
25:17moléculas sean muy diferentes en tamaño
25:19es relativamente sencillo y
25:20eventualmente veremos cómo se puede
25:23lograr eso
25:24entonces esto es todo de la parte de
25:28precipitación como dijeron si este vídeo
25:29hablo de la descripción matemática

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This page contains the full transcript of Precipitacion 3 by Omar Gonzalez Ortega, PhD, generated from the public captions YouTube serves with the video. The transcript has 3,389 words across 573 segments, with the original timestamps preserved so you can click any line to jump to that moment in the embedded player.

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