Introduccion a las bioseparaciones 1 — Transcript

Full transcript

1. 0:00aquí comienza entonces el curso de
2. 0:02procesos de separación o de separaciones
3. 0:07y vamos a establecer primero que son los
4. 0:11productos de separación donde están
5. 0:12insertados dentro del proceso
6. 0:15biotecnológico
7. 0:18aquí está representado
8. 0:22dos las dos partes de nuestra / todo
9. 0:25bien proceso
10. 0:27biotecnológico la parte esa de aquí
11. 0:29arriba que tiene que ver con la vida
12. 0:31reacción
13. 0:34y esta generación del inóculo de la
14. 0:38preparación del medio de esterilización
15. 0:41luego ya seguirían en shewan ya que
16. 0:44siguen el inóculo pues él se utiliza
17. 0:47para inocular el el rector para hacer la
18. 0:49producción a una escala mayor
19. 0:52la optimización del medio de todo lo que
20. 0:55tiene que ver con la bio reacción pues
21. 0:57está incluida en esta etapa que
22. 0:59ingeniero se le llama bio reacción
23. 1:02una vez que se genere el producto de
24. 1:03interés por el metabolismo de los mismos
25. 1:07que se están cultivando ya sea producto
26. 1:10primario o secundario
27. 1:13se tiene que purificar como saben el
28. 1:16biorreactor para que crezca el organismo
29. 1:17pues hay que probarle de fuente de
30. 1:19carbono fuente de nitrógeno y minerales
31. 1:24entonces se tiene que hacer para que
32. 1:26crezcan y produzca el producto en atrás
33. 1:28la situación es que entonces el producto
34. 1:30de interés pues está está disuelto o
35. 1:34generado dentro de un mar de productos
36. 1:36que genera la célula también
37. 1:38es preciso entonces en la mayoría de los
38. 1:41bio procesos se tiene que purificar ese
39. 1:43producto de interés no entonces la
40. 1:45mayoría sí
41. 1:48y es ahí donde entra la bio separación
42. 1:50que sería la parte inferior
43. 1:53la vida separación que esencialmente es
44. 1:57la purificación
45. 2:01del producto de interés
46. 2:05es como que en la parte de arriba se le
47. 2:08llama upstream por estar arriba del bien
48. 2:11proceso
49. 2:15entonces todo el curso tiene que ver
50. 2:17entonces con esta parte de acá abajo la
51. 2:21parte de vía reacción se supone que
52. 2:22ellas son expertos de ayudar a un curso
53. 2:24de cinética y de diseño de biorreactores
54. 2:27tengo mis dudas pero es bueno que ellas
55. 2:29son expertos
56. 2:31en este curso aprender entonces la
57. 2:33segunda parte la vio separación
58. 2:37y como ven pues hay dos hay dos rutas
59. 2:40aquí
60. 2:42aquí trazadas una vez que cae o termina
61. 2:45la bio reacción el producto tiene se
62. 2:49tienen dos opciones que el producto sea
63. 2:51intracelular o que el producto sea
64. 2:54extracelular y entonces seguiremos esta
65. 2:56ruta
66. 2:58si el producto es este de acá es
67. 3:00extracelular
68. 3:02el primer paso de purificación puede
69. 3:05separar las células el material celular
70. 3:07y queda no nada más con el líquido donde
71. 3:09está disuelto el producto de interés
72. 3:11pero como dije se ha disuelto con otras
73. 3:13cosas y se sigue entonces haciendo la
74. 3:17purificación que seguiremos pues esta
75. 3:18ruta donde hacemos la purificación como
76. 3:21tal y la presentación final
77. 3:24del producto como lo veíamos antes
78. 3:27y por otro lado el producto entre
79. 3:28celular se queda de lo produce la célula
80. 3:30pero no lo excreta se queda dentro de
81. 3:33ella y entonces es preciso romper o
82. 3:37fracturar a la célula y entonces el
83. 3:39primer por eso que aparece el primer
84. 3:40paso este de rompimiento a células y
85. 3:43luego ya que rompes pues remueves esos
86. 3:46desechos celulares y ya continúas llegas
87. 3:49al otro punto este de purificación como
88. 3:52tal
89. 3:53entonces
90. 3:55ahí está en dónde está el curso
91. 4:01donde estaba situado pues nuestro curso
92. 4:04porque porque se necesitan desarrollar
93. 4:07bien separaciones
94. 4:10mucho del curso van a ver que está
95. 4:12centrado en proteínas recombinantes que
96. 4:14es una parte primordial en su
97. 4:16preparación en la carrera ingeniería de
98. 4:18bioprocesos muchas de las cosas van a
99. 4:22estar centradas en proteínas en
100. 4:24purificación de proteínas que pueden ser
101. 4:26la tierra recombinantes pero estos
102. 4:28conceptos son trasladables a todo lo que
103. 4:30sea un bio producto
104. 4:33ácidos de penicilinas a esta parte que
105. 4:37sea producida con por cultivo celular
106. 4:42específicamente hablando de las
107. 4:44proteínas es necesario desarrollar el
108. 4:47labio separación en el sentido de aquí
109. 4:50está muy general aquí
110. 4:54en esta positiva pues no se establece
111. 4:58este rompimiento como lo vamos a
112. 5:02como lo vamos a hacer
113. 5:12no se establece este rompimiento como lo
114. 5:15vamos a hacer y luego está esta
115. 5:17separación como la vamos a hacer y aquí
116. 5:21están los pasos generales pero no hay
117. 5:22detalles de específicamente qué pasa y
118. 5:25de ahí es a lo que se llama el diseño de
119. 5:27la bio separación y es preciso
120. 5:29establecer los pasos necesarios
121. 5:34para poder purificar una proteína
122. 5:37recombinante aún cuando hay métodos
123. 5:39metodologías digamos generales los
124. 5:41represos se tienen que diseñar
125. 5:42específicamente para una proteína en
126. 5:44particular pues siempre está esa
127. 5:46necesidad de establecer los pasos
128. 5:48necesarios para proteínas en particular
129. 5:50los otros compuestos de origen biológico
130. 5:52pues son un poco más estándar en su
131. 5:55purificación y ácidos orgánicos seguirán
132. 5:57una ruta corta veamos algunos algunos
133. 6:00ejemplos al final
134. 6:05al final puede haber diversas
135. 6:06alternativas sobre estos signos de
136. 6:09interrogación y cuál será escoger
137. 6:10escoger la que cueste menos desde el
138. 6:13punto de vista del costo de purificar lo
139. 6:17que pudiera ser muy grande como saber
140. 6:21esta diapositiva ya es un poco vieja lo
141. 6:24que presenta aquí pero él todavía sigue
142. 6:28dando información de algo importante
143. 6:32en el eje
144. 6:35en el eje de esta la concentración
145. 6:39inicial del producto de interés como
146. 6:42cayó del reactor y entonces se hizo la
147. 6:44reacción alcanzaste cierta concentración
148. 6:47del producto interés eso es lo que está
149. 6:49a veces lo que llama aquí el eje y
150. 6:51concentración inicial
151. 6:54y en el eje x está cuál es el precio de
152. 6:58venta de un producto en particular y
153. 7:01entonces aquí hay algunos ejemplos
154. 7:05vamos a ver el etanol que anda por acá
155. 7:09se produce a concentraciones
156. 7:11relativamente altas y pues su precio de
157. 7:15venta es bajo el ácido cítrico es otro
158. 7:18caso similar se produce a
159. 7:20concentraciones altas su costo es bajo
160. 7:23sería la parte izquierda de la curva
161. 7:25pero en la parte derecha pueden
162. 7:27encontrar que pueden ver que empiezan a
163. 7:29aparecer proteínas bueno antes de la
164. 7:32parte de una parte media por ejemplo el
165. 7:35ácido de jíber el ico
166. 7:37ya no se produce en una concentración
167. 7:39tan alta y entonces se traduce a nos
168. 7:41cuesta o el precio de venta va a
169. 7:44aumentar y luego si ya aparece en
170. 7:46proteínas por ejemplo aquí está la
171. 7:48insulina
172. 7:50se produce la contracción en las bajas
173. 7:53y se va a vender más caro anticuerpos
174. 7:55monoclonales que estaría por aquí pues
175. 7:57todavía más caro y así pudiéramos llegar
176. 8:00hasta cosas que están muy diluidas en el
177. 8:03en el medio de cultivo
178. 8:07entonces qué es lo que representa aquí
179. 8:08como ven es inversamente proporcional si
180. 8:11produces una concentración alta del
181. 8:13producto en la bio reacción
182. 8:16el costo de venta va a disminuir
183. 8:22es esa razón suficiente para establecer
184. 8:24la importancia de las de la separaciones
185. 8:29porque también lo que está aquí
186. 8:32representado tiene que ver con
187. 8:34con lo siguiente mientras más diluido
188. 8:39está el producto más etapas de
189. 8:41purificación tienes que agregar para
190. 8:44lograr purificar y eso se traduce en el
191. 8:47extreme te estoy invirtiendo estoy
192. 8:49invirtiendo iba a terminar entonces
193. 8:51vendiendo sea un precio alto
194. 8:53entonces la separación es importante
195. 8:56desde el punto vista económica
196. 8:57obviamente también la vio reacción la
197. 8:59reacción debería buscar siempre tener
198. 9:01concentraciones muy altas del producto
199. 9:03de interés pero eso no lo discutimos
200. 9:05aquí como dije se expone aquí ya son
201. 9:07expertos en en esa parte aquí está un
202. 9:11poco más representado lo que estoy
203. 9:12diciendo
204. 9:14en esta tabla está en esta columna el
205. 9:18costo de la vio separación y hay unos
206. 9:20ejemplos aquí entonces si ven al etanol
207. 9:24de lo del costo que yo no vendo no es
208. 9:28cierto el costo que lo que me cuesta a
209. 9:30mí generar etanol el 15 por ciento que
210. 9:33está asociado a la purificación
211. 9:37y ácido cítrico ya es un poco más
212. 9:41penicilina g es hay más o menos 20 30
213. 9:45por ciento y penetran si brincamos a
214. 9:48proteínas pues resulta que la política
215. 9:51es el costo sea la bio separación a la
216. 9:53purificación puede ser hasta el 80 por
217. 9:56ciento del costo total del producto es
218. 10:00decir 20 por ciento nos costó nada más
219. 10:02hacer la vio reacción el mayor costo
220. 10:04está en la en la purificación y esto
221. 10:08tiene que ver si regresamos a esta
222. 10:10figura pues tiene que ver con la misma
223. 10:12relación que está aquí el etanol se
224. 10:14produce concentraciones altas la biomasa
225. 10:16del agua dura también el ácidos y
226. 10:18tratamiento es por eso el coste de la
227. 10:20separación entonces relativamente bajo
228. 10:22pero la las enzimas a granel que se
229. 10:25producen en contracción bajas si son
230. 10:27recombinantes todavía más bajas y las
231. 10:30terapéuticas pues están súper diluidas y
232. 10:32pies se traduce a te va a costar mucho
233. 10:34purificar las iba a terminar costando
234. 10:37más ese material a la hora que se vende
235. 10:40al consumidor
236. 10:42va a regresar
237. 10:45esta de aquí
238. 10:47como ven aquí hay
239. 10:50vamos a ver esta ruta pensamos que
240. 10:53venimos por acá
241. 10:55al menos aquí lo que está representado
242. 10:57en este diagrama de flujo hay 12 que no
243. 11:00conocemos detalles pero al menos están
244. 11:02representando cuatro pasos para obtener
245. 11:04el producto de interés purificado
246. 11:08y eso es lo que estaba más o menos
247. 11:10representado en esta en esta diapositiva
248. 11:13y la pregunta es por qué es importante
249. 11:16minimizar es el número de pasos acá en
250. 11:19la representación como digo pueden ser
251. 11:23estos cuatro están aquí pero
252. 11:24internamente aquí a lo mejor hay tres
253. 11:27etapas
254. 11:30y está lo mejor tiene dos etapas
255. 11:33entonces a esos pasos se refieren
256. 11:38y se refiere
257. 11:41esta diapositiva cuántos pasos en total
258. 11:45vas a hacer para obtener tu producto de
259. 11:47interés purificado
260. 11:49pensemos que son así como está
261. 11:51idealizado ya pensamos que son cuatro
262. 11:56y lo que está aquí como ven hay varias
263. 11:58curvas y esencialmente lo que representa
264. 12:01lo siguiente tienes estas cuatro etapas
265. 12:05y lo que va a funcionar siempre es bueno
266. 12:07pensemos que el producto cayó del
267. 12:10reactor y tiene concentración de un
268. 12:13gramo por litro
269. 12:15hacer la primera etapa siempre puedes
270. 12:19buscar
271. 12:20de la etapa 1 a la 2 sigas teniendo esa
272. 12:24misma concentración
273. 12:26pensemos que es más pensamos tendremos
274. 12:30que el más pensemos que es un kilogramo
275. 12:32de producto de interés
276. 12:35lo que está representada ya es en cada
277. 12:37etapa nunca vas a recuperar ese
278. 12:39kilogramo completamente porque se
279. 12:41traduce a si lo puedes hacer pero vas a
280. 12:44tener que invertir mucho tiempo o lo que
281. 12:46sea siempre es bueno vamos a fijar un
282. 12:48rendimiento o una recuperación entonces
283. 12:51podríamos decir vamos a estar
284. 12:53recuperando el 90% en estas cuatro
285. 12:55etapas de la primera etapa
286. 12:57recuperas punto nueve kilogramos nada
287. 13:01más
288. 13:02hace la segunda etapa y recuperas punto
289. 13:0481 kilogramos nada más y eso pensando
290. 13:07que entonces tenemos un rendimiento por
291. 13:09etapa
292. 13:11de 90% el 90% del material que entra yo
293. 13:16lo puedo recuperar y seguirá avanzando
294. 13:18entonces eso es lo que está representado
295. 13:20entonces en la diapositiva
296. 13:27en esta de aquí aquí faltan unas falta
297. 13:31información esta es la del rendimiento
298. 13:33del 90%
299. 13:35el 95%
300. 13:39y esta ex trabajo es del 60%
301. 13:42entonces estamos en la línea de lo que
302. 13:45está hablando yo es empezamos acá no
303. 13:47hacemos etapas y estamos en el 90
304. 13:50recuperamos el punto 90 kilogramos punto
305. 13:549 kilogramos punto 81 y así
306. 13:59llegaremos aquí alrededor de puntos 72
307. 14:03con esas tres etapas
308. 14:05si son 4 vamos a tomar está
309. 14:09estamos no
310. 14:1365 lo mejor es lo que estamos
311. 14:16recuperando al final
312. 14:18entonces del kilogramo que tú metiste
313. 14:20solo recupera 650 gramos ya al final con
314. 14:24estas cuatro etapas y considerando que
315. 14:28recuperas del 90% en cada etapa es por
316. 14:30eso es importante minimizar que si nada
317. 14:32más fueran 3 si estuvieras aquí
318. 14:36lo recuperas más
319. 14:40digamos que es 73
320. 14:44setecientos treinta y tres gramos
321. 14:47si lo hicieras con 322 por eso es
322. 14:50importante minimizarlos obviamente
323. 14:52también quisiera recuperar lo más que se
324. 14:53pueda si fueran cuatro etapas pero
325. 14:55recuperas el 95 por ciento es decir
326. 14:57estás aquí
327. 15:00nos ocuparemos mucho más de la
328. 15:02del producto de 820 gramos
329. 15:074
330. 15:10también aquí está representado
331. 15:13y si tu rendimiento es muy bajo
332. 15:19vamos a tomar esta de 60 por ciento
333. 15:37esta va a ser el 60 por ciento de
334. 15:40rendimiento haces una etapa aquí voy a
335. 15:42poner empezamos acá con un kilogramo
336. 15:44primera etapa recupera nada más el 60
337. 15:47por ciento puntos 6 kilogramos dos
338. 15:51etapas punto 36 kilogramos
339. 15:54y así y pensamos que fueran las cuatro
340. 15:57que estamos estableciendo los
341. 16:00rendimientos del 60 en cada una de las
342. 16:02está recuperando y al final nos es 120
343. 16:05gramos nada más del producto entonces es
344. 16:08importante minimizar el número de tapas
345. 16:12que el rendimiento sea alto y esto es
346. 16:14algo idealizado pensemos que llegamos
347. 16:16que estamos acá y decimos son 10 etapas
348. 16:18pues suerte porque vamos a recuperar una
349. 16:20miseria es el rendimiento es bajo
350. 16:23entonces siempre es importante pensar
351. 16:25eso
352. 16:26aquí está representado el proceso
353. 16:28idealizado idealizado debió separación
354. 16:31de manera ideal sólo tenemos 244 etapas
355. 16:35donde la pureza está en el eje la presa
356. 16:40el punto interés está en el eje y y acá
357. 16:42está en los pasos
358. 16:44este es el primer paso es remoción de
359. 16:46insolubles como no incrementa mucho la
360. 16:51pureza
361. 16:55aquí en remoción de insolubles están si
362. 16:59es producto extracelular pues están
363. 17:01operaciones de separación de biomasa que
364. 17:05pudiera ser centrifugación y filtración
365. 17:10producto intracelular que ellas están
366. 17:13involucradas pero primero hay que hacer
367. 17:15un rompimiento de los entonces en la
368. 17:18remoción de insolubles también están
369. 17:20este proceso se considera el rompimiento
370. 17:23el como digo no no aumenta mucho la pues
371. 17:26nada más estás quitando las células para
372. 17:28quedarte con el medio las células
373. 17:30enteras si es extracelular hacerlas
374. 17:33rotas si es intracelular
375. 17:37ese es el padre es el primer paso en el
376. 17:39segundo paso
377. 17:42este de aquí que se llama aislamiento
378. 17:45del producto aquí voy a escribir la
379. 17:48definición
380. 17:51se separan
381. 17:56el producto de interés
382. 18:01de moléculas muy diferentes
383. 18:11entonces pensamos que el producto de
384. 18:13interés es una proteína lo que se
385. 18:15refiere el aislamiento del producto es
386. 18:16voy a separar todas las proteínas
387. 18:21porque hay más proteínas y es un cultivo
388. 18:23de rápido haber un montón de proteínas
389. 18:24aquí se refiere entonces separó todas
390. 18:27las proteínas ahí va mi proteína de
391. 18:29interés separó todas las proteínas pero
392. 18:32todo a ser un conjunto y las separó de
393. 18:34cosas que son muy diferentes a él por
394. 18:36ejemplo como viene de la bio reacción
395. 18:38pues podemos quitarle la glucosa
396. 18:40residual que era la fuente de carbono
397. 18:42por ejemplo el nitrógeno residual todas
398. 18:44estas sales las podemos separar y eso es
399. 18:48lo que ocurre en esta en esta etapa de
400. 18:50aislamiento del producto si no vas a
401. 18:52aquí todavía no se persigue separar las
402. 18:55proteínas unas de otras para que yo
403. 18:57obtenga la de interés si es más bien
404. 18:59todo lo que sea proteína lo sepa cosas
405. 19:03que sean muy diferentes
406. 19:05de ácidos sales todas estas partes
407. 19:08diferentes
408. 19:11ahí vamos a dar varias
409. 19:13varias operaciones que tienen que ver
410. 19:15con él
411. 19:18el aislamiento del producto
412. 19:21específicamente pues algunas carreras de
413. 19:25extracción en líquido líquido
414. 19:31y absorción por ejemplo
415. 19:34vamos a ver esas esas
416. 19:39esas
417. 19:42esas operaciones son esos procedimientos
418. 19:45como si la etapa de purificación en esta
419. 19:48etapa de purificación ahora si separamos
420. 19:50el producto de interés
421. 19:56moléculas similares
422. 20:02es una proteína
423. 20:05tenemos ya separamos un grupo de
424. 20:09proteínas dónde va la de interés ahora
425. 20:10si ese paro todas las proteínas
426. 20:12contaminantes de mi producto de interés
427. 20:15y eso podemos hacerlo por cromatografía
428. 20:21y no sé qué más vamos al curso
429. 20:24bueno esa es una de las opciones muy
430. 20:28socorridas para hacer la purificación y
431. 20:30como ven aquí pues a esta tercera etapa
432. 20:33se le da purificación cuando en realidad
433. 20:34todas purificación pues la purificación
434. 20:36aquí se refiere a este paso de separar
435. 20:40el producto interés de moléculas que son
436. 20:41similares ay
437. 20:44luego finalmente viene la etapa esta de
438. 20:48pulido aquí nada más es
439. 20:52es la preparación
440. 20:55del producto
441. 20:59de interés
442. 21:01para comercialización
443. 21:07y el producto de interés se va a vender
444. 21:10como un sólido se va a ver si se va a
445. 21:13vender como un sólido pues hay que
446. 21:14secarlo vamos a haber secado ahí si lo
447. 21:17vamos a vender como una solución
448. 21:19disuelta en un buffer específico un
449. 21:21amortiguador específico pues ahí va a
450. 21:24estar muy involucrada ultrafiltración
451. 21:29entonces tienen que ver que tienen que
452. 21:32ver con cuál es la presentación final
453. 21:33que pudiera ser que porque si son
454. 21:35proteínas por ejemplo su estabilidad es
455. 21:37muy mala entonces conviene secarlas pero
456. 21:40a veces cuando si usted es una proteína
457. 21:42terapéutica y debe inyectar pues se
458. 21:44vende como una solución
459. 21:46si es un ácido orgánicos y espinas y
460. 21:48lina pues normalmente se secan se venden
461. 21:52como productos soñado
462. 21:55vamos a ver aquí en los ejemplos
463. 22:00a que los ejemplos estos pueden ver voy
464. 22:03a hablar nada más de éste
465. 22:06y aquí hay dos ejemplos esta es la
466. 22:09producción de penicilina g
467. 22:14y aquí están todas las etapas están
468. 22:16representado todo el proceso y aquí
469. 22:18podemos ir
470. 22:20podemos identificar las cuatro etapas
471. 22:22idealizadas debió separación
472. 22:26toda esta parte superior
473. 22:29tiene que ver con la vio reacción
474. 22:34ahí está la generación de esporas el
475. 22:38cultivo en sólido y luego transferencia
476. 22:40líquido inóculos aumentando de tamaño y
477. 22:43eventualmente inocula mosel fermentador
478. 22:45que en este caso son 100 mililitros
479. 22:49bueno de ahí entonces esa línea separa
480. 22:53hacia abajo pues va a estar la vio
481. 22:54separación
482. 22:59él
483. 23:02la pensión ag eso el mata boleto
484. 23:04secundario y la célula la excreta
485. 23:07entonces por eso la primera etapa que
486. 23:09está aquí es una filtración entonces ahí
487. 23:12está la primera etapa de aislamiento
488. 23:16se llama la remoción e insolubles perdón
489. 23:20de gente
490. 23:25este primero es remoción de insolubles
491. 23:30los insolubles personas hacerles estos
492. 23:32hongos
493. 23:34quitamos las celdas
494. 23:42y esta es la primera etapa ya que
495. 23:44eliminamos las células pueden ver que
496. 23:46sigue esta etapa que dice extracción esa
497. 23:50etapa es aislamiento del producto
498. 23:56entonces ahí separamos las insignias
499. 23:59generalmente son ácidos ácidos orgánicos
500. 24:01separamos ácidos orgánicos de moléculas
501. 24:05que sean muy diferentes ahí va la
502. 24:06penicilina
503. 24:10y hacer se hace una extracción líquido
504. 24:12el líquido dentro por 15 electrónico eso
505. 24:14lo vamos a ver también el curso vemos
506. 24:16filtración
507. 24:19y luego lo que continúa es
508. 24:27es un proceso
509. 24:34d
510. 24:36de lo voy a seguir en la purificación en
511. 24:40el tercer los 30
512. 24:43que sería estar aquí
513. 24:45calificación
514. 24:48que aquí pues hacen con un tratamiento
515. 24:50con carbono
516. 24:53que sería absorción eso también lo vemos
517. 24:55en el curso y luego lo que continua
518. 25:02son en este caso hay una hay una
519. 25:04precipitación entonces aquí hay una
520. 25:08precipitación
521. 25:12entonces que también sería purificación
522. 25:15entonces también aquí se hace
523. 25:17purificación pues aquí hay dos etapas
524. 25:19dentro de la purificación una que esa
525. 25:21traducción que vemos en el curso y otra
526. 25:23que es precipitación que también vemos
527. 25:25en el curso y eso va a generar cristales
528. 25:28de penicilina je
529. 25:32esos cristales finalmente son secados
530. 25:36acá y esa sería la de la etapa de pulido
531. 25:40la etapa final lo vamos a vender como
532. 25:43ven aquí como una sal
533. 25:46entonces por aquí hay otro ejemplo
534. 25:48también pueden identificar las las
535. 25:50cuatro etapas
536. 25:53del proceso idealizado
537. 25:57y yo creo que aquí terminamos este vídeo
538. 26:00y continuamos en otro con lo que sigue
539. 26:03de la presentación