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Creating genome-edited animals using i-GONAD — Transcript

by GenScript USA Inc. · 1,213 words · 941 segments · language en · Watch on YouTube

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0:01皆様本日はチェーンスクリプトベピなぁに
0:04ご参加いただきまして誠に有難うござい
0:06ます
0:07本日の司会進行を止めますチェーン
0:10スクリプトの無駄そのと申しますどうぞ
0:12よろしくお願い致します
0:14初めてお目にかかる方のためにチェーン
0:17スクリプトについて少しご説明させて
0:19いただきます
0:20ジェンスクリプトはライフサイエンスの
0:22サービスや製品を提供する世界有数の
0:25バイオテク企業です
0:27遺伝子合成ペプチドタンパク質抗体
0:31前臨床医薬品開発サービスの能力を持ち
0:34基礎的な生命科学編9と初期段階の創薬
0:37サービスを専門とする一流のバイオテク
0:40企業として国際的に認められております
0:44本日のウェビナーは aiko など法に
0:46よるゲノム編集動物の作製というテーマで
0:50大塚正人教授にお話いただけます
0:53大塚教授は東海大学医学部にて研究室を
0:57主宰されておられます
0:59大塚教授の研究グループはこれまでに著名
1:02な各種土に100本を超える論文を発表さ
1:05れており緊急分野をけん引しておられます
1:08主な研究テーマはマウスの遺伝学
1:11生殖高額モデル動物の作製および機関や
1:15生殖組織への効率的な遺伝子導入のための
1:18新技術の確立です
1:21ポンディナーの所要時間は約40分を予定
1:23しております
1:25ご質問はチャットボックスに入力して
1:27いただければ後日メールにてお答えいたし
1:29ます
1:30それでは大塚教授によるベピなぁを始め
1:33させていただきます
1:34もうつか教授どうぞよろしくお願い致し
1:36ます
1:37はいそれではあのはじめたっていただき
1:39たいと思います
1:41ご紹介いただき誠にありがとうございまし
1:43た東海大学医学部の大木かと申します
1:47このような機会を与えて頂け
1:49ハイあの大変感謝しております本日は
1:54ゲノム編集動物作成法である a aiko
1:57ナット公という独自の手法についてご紹介
2:00したいと思います
2:04ここにあげましたのは8本日のプレゼンの
2:07流れになりますこの順番で一つずつ紹介し
2:10ていきたいというふうに思っております
2:13まずあのさイチョウですね
2:16クリストファーゲノム編集技術ができる前
2:18にはどのように遺伝子改変動物
2:21履歴改変マウス等がへ作られていたのかと
2:24いった方法に関してエコパの紹介したいと
2:27思います
2:29遺伝子改変動物というのは
2:32インビボねの乾霊子機能解析
2:35もしくはその人の疾患モデル動物として
2:38世界中で幅広く使用されています
2:42したがってよる良い入れ子改変動物を作成
2:45するということがまあ医療に重要なことに
2:48なるわけです
2:50で位では大きく分けて2つの方法で入れ子
2:53改変動物特に遺伝子改変マウスというもの
2:56が作成されていました
2:58一つは左側の権利注入法による方向です
3:03これはマウスの受精卵に細い針を通して
3:06dna 溶液ですねもう注入して撮影する
3:10とトラフィックマウスとを作成するような
3:12a 方法ですでもう一つは aes 細胞
3:16を変えたいあの遺伝子ターゲティング法と
3:18いう方法になります
3:20これはまあ培養細胞としての es 細胞
3:22の多能性幹細胞の中で歩いマーレ dna
3:26のフラグメントを導入して目的の遺伝子
3:29領域が置き換わったものをピックアップし
3:32てそこからマウス答えをつくっていくと
3:34いうような方法になりますでまずこちらが
3:37の顕微球に方に関してですけれどもこれは
3:40比較的簡便な方法ではあるんですけれども
3:43導入した遺伝子というのがゲノム上のどこ
3:45になぁコピー入るかということを
3:47コントロールすることができない方法です
3:49従ってせっかくその導入イメージが入った
3:52ようなトラフィックマウスが取れてもその
3:55発現パターンというものに再現性がなかっ
3:57たりひどい場合はま高くできないという
3:59ことが起こったりします
4:03一方で es 細胞開始テトラあの人間
4:06エディン方五連ターゲットいう方を用いる
4:08と1コピーの a d n a の
4:11フラグメントを狙ったゲノム領域に入れる
4:13ことが可能ですそれによって例えばノック
4:16イン動物を作った場合にはその目的で遺伝
4:20子の発現というものが来た以上でである
4:22あのを事っていうことがまあ非常に多くて
4:26またあの狙った遺伝子を壊すまあ
4:28ノックアウト動物等を作る事も可能な方法
4:31です
4:32しかしながらこの d 議員
4:34ターゲッティング法による方法に関しては
4:36非常に労力や時間およびコストがかかる
4:41方法で実際に目的のマウスを得られるまで
4:44に2年くらいかかったりするようなことが
4:47ありました
4:50そのような中クリスパーゲノム編集技術と
4:54いうものがあのできてきてよりカンペンに
4:56効果の目的のより優れた質の良い遺伝あの
5:01モデル動物というものが作れるようになっ
5:03たんですかここからまあ愛護マット方も
5:05含めてゾーイつだけの無編集技術を用いた
5:09方法に関して紹介していきたいとおもい
5:10ます
5:12まずそのクリスパーけど無編集技術に帰っ
5:15て簡単におさらいしますと
5:17クリスパーを使って a
5:19標的領域を編集するためには大きく分けて
5:232つのコンポーネントを用いますひとつは
5:26キャス何タンパク質という dna の
5:29切断活性を保ったまあ酵素です
5:32でもう1つはその酵素お客9ノッカーの
5:35タンパク質を標的良医意味
5:38あの移動させるとめに必要な外だあれ姉と
5:41いう短い rna の配列
5:43そのガイド rna のその後ラッシュた
5:45の20円きほどっていうのはつの標的配列
5:48の dna のあのゲノム上の dna の
5:50配列に相補的な配列を持ったも動画 a
5:53あの人工的に設計することが可能です
5:568それを a と思ったその外だあれ姉と
5:59お客内のタンパク質を用いて標的領域もう
6:03あのゲノムの dna 配列に dna
6:06二本鎖切断タブストランドブレイク dsb
6:09をえっと導入することが可能ですねそう
6:12やって導入されてされた dena の
6:15二本鎖切断箇所というのはそのさいごーが
6:18もともと持っている dna の修復 a
6:21ですね2つのメディアなあのパスウェイが
6:24あるんですけれどもそれを用いて注目さ
6:27れることになりますその主経路をうまく
6:29利用して表できるようイティ人への6返球
6:32というものを弔辞させるわけで
6:35一つはエラー plone な n a t
6:37でパスウェイというものでこれは切れて
6:39しまったところをとにかくまあ早く
6:41くっつけてしまおうというようなことを
6:44行うんですがまぁ正確に戻ってあのあの
6:46修復された場合というのはまたそこが同じ
6:49ように切断されてしまうのでそういった
6:51ことを繰り返しているに8短いそのイン
6:54カー手段で bジョンイン出るがまあ入っ
6:56てそこのい連機が壊れてしまうといった
6:58ことが起こります
7:00一方で hdr パスウェイというのは
7:02ひどいまぁ正確な a
7:04修復経路なんですけれども
7:06切れたところの両端にえっと相補的な配列
7:10を馬っこを利用してえっとを修復するよう
7:13な ak なんですが例えばこの時に外
7:16から dna 段平を
7:18あの導入した理あのした場合にその dn
7:22段平の両端にですねこの切れたところに
7:24騒動な配列をえっとを付加しておくと相同
7:28組換えを利用してうまくきれいに国に
7:30adn フラグメントを挿入することが
7:33できるといったことで knock in
7:35道部作成等に利用されたりちまうこういっ
7:38たノックアウトへのクイーンというものが
7:40ゲノム編集
7:41クリス part 特にくれスパゲノム
7:43編集技術を用いると簡単にできるように
7:46なってきました
7:48ではどのようにクリスパーゲノム編集技術
7:51を用いてゲノム編集動物特にマウスですね
7:55作っていくかというと
7:57先ほどお話ししました兼備注入法という
8:00比較的まあシンプルな方法を用いて
8:03ノックアウトやノック妹行うことが可能に
8:06なってきています
8:08その大きな流れなんですけれどもまずその
8:112ペアの動物を準備する必要があります一
8:15つ目の a 動物というのは受精卵を回収
8:18するための音人隠滅まーすです
8:21でその妊娠した女っマウスを
8:22サクリファイスて this error
8:24を体外に取り出し一の体外に取り出した
8:26受精卵にゲノム編集し薬を兼備注入法と
8:30いう非常に高価な機器を用いてまたとの
8:33高度な技術を使ってま注入する方法ですね
8:36こういった方法で
8:38あのドーンと導入したりもしくは最近よく
8:42行われるのはへ
8:44in vitro 苗 l
8:45エレクトロポレーションですねいう方法を
8:47用いると多数の受精卵をこういったと彼の
8:52電極のに挟んで一度に電気パルスを与える
8:55ことでゲノム編集しやごま大概でるあの
8:58導入してあげるということが可能です魔攻
9:00にこのように処置された受精卵に関しては
9:03その後
9:04おいっちペアの越冬マウスを用いて準備た
9:07議員選挙状態のあのメスマウスを用いて
9:11その欄干に移植しますそうするとこの
9:14genie 金目つマウスが妊娠を継続し
9:17てゲノム編集動物を出産するといった流れ
9:21になります
9:22まあいずれにしましても対応内での a 棟
9:24配当から必要なるって言う点とあと2つ
9:27ペアのネットをマウスを準備しなくては
9:29いけないといったことになります
9:31これが8多くのところで行われる下のん
9:35一度作成法なんですけれども本日街のご
9:38紹介します相棒なった方に関しましては
9:40この採卵や海外での操作
9:45またイジョクといったステップを完全に
9:47スキップできる国家の方法になります
9:51さらにこの2番目のマウスを準備する準備
9:54したり維持する必要がないといった方法に
9:56なります
9:57それではどのようにへ phenom 併給
10:00動物がぷくられるのかというとこの妊娠満
10:02そのものにへ
10:06の欄干の中にですねゲノム編集し夜光虫
10:08ニューシティエレクトロポレーションを
10:10この卵塊に対してかけることでそのまま
10:13このメスマウスが22 t オエッとして
10:16キュッさんするといった流れになります
10:20それでは8この後なった方の8ステップに
10:23関してもう少し詳しくへとはいないと思い
10:26ます
10:28このようにえっと名として
10:31うまく名とした目住まうそうですね準備き
10:33てその日のうちにですねこのメスマウスを
10:36待っ空いて背中を曲開始このメスマウスの
10:40えっとを背中から
10:42卵巣やランターを露出させますをのような
10:45感じですねでその露出した欄干の中に実体
10:49顕微鏡をのぞきながらガラスかペリーを
10:51用いてゲノム品種約を
10:53市で拭いて注入しますってこの欄干が金
10:56受精卵が入っているので受精卵の周りに m
11:00編集者役がたくさんあの届いているという
11:02ような状態になります
11:04てその後すぐにですね
11:06ピンセット方の電極を使用してこの卵管
11:10全体を挟んで電気パルスをかけますそうし
11:13ますとこのえっとクリスパゲノム編集し約
11:17が受精卵の中に入っていくといった流れに
11:19なります
11:21このステップをえっとを終えた後はこの
11:24メスマウスそのあのそのものの中にこう
11:27いった卵とやランカを元の位置に戻して
11:29あげて麻酔から冷ましてそのままに息余計
11:32毒てええけど無編集動物を出産させると
11:35いった英霊になります
11:38じゃあそういった ai 後ナットを行う
11:40ときに何を越冬準備したらいいのかという
11:42と
11:43ここの刺しにあげたものになります
11:45まず一番9ようなのはエレクトロプレイ
11:48たーーーーですねえっ
11:50このような得るとプレイたの危機とそれに
11:52接続した pz が彼の電極になります
11:55多くのステップを実体顕微鏡をのぞいて
11:58行うのでまぁ安いものでもいいんです
12:00けれどもこういった実体顕微鏡を準備する
12:02必要がありますまたマイクロサージェリー
12:04を行うために必要な解剖道具というものを
12:07この園準備します
12:10てもう一つはですねあのランカーの中に
12:12からキャピラリーを用いてえっと溶液を
12:15注入するんですけれどもこのから
12:17キャピラリー音波の
12:19用いるツールというのものがここにあげた
12:21a の図1に示したものになりますこれは
12:25自作することができるんですけれどもこの
12:27こちらがおですね口でえっと加えてですね
12:30いっ4吸ったり吐いたりするとこのガラス
12:31キャピラリー
12:32を使って溶液を吸ったり出したりすること
12:36が可能です
12:39でこのようなえっとツールを準備すること
12:41ができたら次に妊娠別舞うと準備する必要
12:45があります
12:46でマウスは低地雪があるのでちょうどいい
12:50あの手低中期に値するえっと相当するメス
12:53マウスを見つけてそれを押すますとかの
12:55荒廃させますでこの場合ですね80発病前
13:00気配の前期のあのマウスをへとミアの
13:05見いだす必要があるんですけれどもここで
13:08言うとまぁこんな感じですねまあをチリの
13:09部分が少し高赤く赤っぽくて少しコープ
13:12くらした関係のものを8見つけてそれを
13:16押すマット後輩各な超するとうまくいくと
13:19次の日んですね荒廃したあのしましたよと
13:23いうあの目印になるこのちっ線という
13:27プラグと呼ばれるものがこのちろいのもの
13:30ですねこれがえっと見ることができます馬
13:33後輩出来上がったものはそういったものが
13:35見えません
13:36なのでこういったプログプラグが付いた
13:38まま雄雌マウスを愛護の後初球をするその
13:41日の朝までリーチ準備しておくというよう
13:44なことになりそういったプラグ付きの
13:46マウスをその日の4時午後4時以降に使用
13:49するといった a ことになりますこの
13:52ように8
13:53ミーティンスターまあプラグが付いた梅
13:56つまりは準備ができたら
13:58実際に aiko なった方を行うまでの
14:00間にえっと注入する溶液を準備する必要が
14:03あります
14:05それはここにえっと挙げたような量で
14:07えっと混合するんですけれども
14:10まあガイドあーれーやちょっとしたノック
14:12に行う場合は ss おりゲームまた客に
14:15のタンパク質
14:16それとへと領域に色を付けたい場合は
14:19ファットグリーンなどを皇后しますここに
14:22あげた a 最中濃度ですねというのは
14:25顕微注入法で用いるときよりも10倍から
14:28100倍ぐらいこういうものになっている
14:29んですけれどもええまあトータル10枚
14:32くるリッターの溶液を準備した場合3匹の
14:34滅マウスにえっとを主張することが可能で
14:3711個のランカーたり1.5マイクロ
14:39リッターのよう息を a 中央します10
14:42えっとマウスのが熱ますはにこの1匹の
14:45メスマウスはにこのランカーを持っている
14:47のでさんマイクロリッター1匹当たり待ち
14:49をするといった計算になります
14:52このようによう息を準備することができ
14:55たら次にえっと太めに熱マウスを用いて
14:59えっとマイクロサージェリーを行います
15:01って実際に前た背中から卵巣や卵管を
15:04引き出すんですけれども松井稼でですね
15:06このように瀬川の皮膚を切開1 a
15:10切開します
15:12そうすると内側にえっと瀬川の筋肉が
15:15見えるんですけれども筋肉と皮膚の間に
15:18あるちょっと薄い膜をこのように覗いて
15:20あげて
15:24ペーパータオルのあのかけらですねそれを
15:27このようにえっと
15:29切開した部分の右側に置きますその上に
15:32卵巣や卵管を引き出してのせるといった
15:34ことになります
15:38でここで正山転圧がですあの瀬川の金利が
15:41見えるんですけどもそこを越冬ピンセット
15:44で挟んであのはさみを入れると少し小さな
15:47穴が開いて中に白いこの脂肪が見えます
15:50その脂肪を pz 5巻で引き出すとこの
15:53ように卵巣や卵管が8一緒にくっついて出
15:56てきますてくれ女を用いて規模つまんで a
16:00その位置を固定するんですけれどもこの
16:02ように出してですねクレーン目を前後に
16:06回転させながら
16:07ちょうどいい時期に卵管がくるように調整
16:11します
16:13でこれからアンそうでこちらが卵かんって
16:16特にこのぷくっとこうパンパンに膨らんで
16:19見える部分が卵管膨大部といってこの中に
16:22受精卵が入っているというようなものに
16:25なります
16:27はいまあこのような位置合わせが行えれば
16:30ok です
16:32鉄にですねアイコンあった特有の処置で
16:34ある
16:35難関への洋域の注入と得るえれくとプレイ
16:38ションかえって動画で説明したいと思い
16:40ますこのあたりはだいたい2の卵管膨大部
16:42なんですはそれより上流側ですねカーラの
16:46欄干にガラスキャプラリーで
16:49左往さして頭良い氷柱にしますいまいちf
16:52いたんですけれどもこの欄干が作ってくれ
16:54たのが分かるかと思います
16:56このぐらい入れる版も十分なんですけども
16:58まぁ少し多めに入れていますこれで注入は
17:02ok で
17:03って注入したとのランカーですねティム
17:05ワイプ辺でこのように多います
17:09で大た後にピンセットタイプの全曲でここ
17:13を肌身挟みます
17:16ここでは8直径3ミリの平板の電極を用い
17:19ているんですけれどもこんな感じですねで
17:22このようにこのランカーを挟んで電気
17:26パルスを書けば彼氏がうまく明ると電極の
17:29間小さい泡がこのようにえっとビアの出て
17:32くるわ見えるかと思いますこれで一つの
17:34ランカーの初球はをあの終わりというよう
17:36なことになります
17:38ここでは透明な溶液を用いたんですけれど
17:40も先ほどの説明しましたファット
17:42bully のあの溶液を加えますとこの
17:46ように色がついて見えるので毒にどの程度
17:49入ったのかっていうものが例えばこのよう
17:51に木村一方で覆っても大体の位置を確認
17:54することがあのできるので特に主人いたに
17:57は色をつけた方がやりやすいんじゃないか
17:59というふうに思います
18:01はいっ
18:02でえっと両方のランカの処置が終わりまし
18:05たら最終的にですねえっと
18:08クレーン名を外してまたキム i 分を
18:11外してペーパータオルも外すとって卵巣や
18:14卵管っていうのは a
18:16この筋肉の内側に元あった位置に行こう
18:20ピンセットも使って戻してあげて最終的に
18:23線せながら汗がはの切開した僕のクリップ
18:25で留めてですね麻酔が覚めるまで体を温め
18:29ながら8待つというような流れになります
18:35それではこういったステップで行う対5
18:37だった方を用いてどのようなマウスを作る
18:41ことができるのかについて淡々に説明して
18:43いきたいと思いますまず左側ですねこれは
18:46えっと遺伝子を陰でルミュー低地を入れて
18:49壊すような実験になればってここでは
18:51fox 行きリーと呼ばれるまあ点3位
18:54これは吐く年収に関連していることが
18:56分かっている点線日なんですけれどもそれ
18:58のこの部分に1回どうあれ年設計して愛と
19:02なった方でこの遺伝子を潰してあげるよう
19:04なできを行いました
19:06で特にですねキャップ9をタンパク質を
19:09あの使って入れると非常に効率よく遺伝子
19:12を壊すことができて最終的にこのような
19:14白内障のモデルを作ることが出来ますこれ
19:17は非常に高効率よく動きます
19:19またですねこのような越冬をちょっとした
19:22短い a t あの1本た dna です
19:25ね ss odnだいたい200万以下の
19:28ものを使うんですけれどもそういったもの
19:30を用いて母の口にするということも比較的
19:33簡単にできます
19:34ここではアルビノの表現形を示す icr
19:38まーすですねこれのチロシナーゼ遺伝子
19:41甲標的としているんですけれどもアルビノ
19:44のマウスはこのメラニン合成に関連する
19:46チロシナーゼいい例じゃ壊れていまして
19:48このエクソンはのこの部分にポイント
19:50ミュー提示をを組んで今そこにガイド r
19:53ネイル設計してまた野生型の配列を持って
19:56礼節 odn でこの部分をヘッドを
19:59リペアしてあげるような時期を行いました
20:01ん
20:02その結果ですねえっとまぁ非常にあの効率
20:06よく
20:08メラニン色素ができるあの
20:12きちんと回復したようなお答えを得ること
20:14ができますだいたいまあ50%弱ぐらいの
20:17効率でまあ少なくともこのこの老活では
20:20こういったノックインが動くことが分かり
20:22ました
20:23他にはですねここでは16.2キロベース
20:26のレトロ putra トランスポゾンの
20:29配列を含んだ部分を完全に掲出させるよう
20:32な a ことを行いましたこれでは2種類
20:34のガイダーで rna を用いているん
20:36ですがこのような a 方法で遺伝子の気
20:39室というものも十分あの高い法律で行うと
20:43はか俺
20:44またこちらですねまあ少々ちゃリキャ
20:47レンジングな8実験ではあるんですけれど
20:49も中部大学の五若先生たちはグループは4
20:53点号8 mega bass もの非常に
20:55高長い領域をですねインバージョンを
20:58タップを立てることにまあ i5なところ
21:00で成功しましたーいというような報告もた
21:03されています
21:06はいまあこのような会ことが可能な愛護
21:08なった方ですけれどもまだまだえっと色々
21:11と改善しなくてはいけないような部分が
21:13あります
21:14でそのなかの1つはマウスで最も
21:18ポピュラーな
21:19ストレーンである c 57 bl 6
21:22まあブラック6とか p 6とか呼ばれる
21:248系統がありますがその系統でのアイゴな
21:27とから難しいというようなお話を何度見に
21:30行ったことがあります例えば b 6系統
21:34でワイドなほうが成功しないとか子供が
21:37生まれてこないとかまあそういったような
21:39a ことがお聞きましたって愛護のあの
21:42ブラック6の受精卵というのは電気刺激に
21:45異常に弱いのでそういった電気情景を待つ
21:48最適化する必要があるんじゃないかという
21:50風に考えました
21:52そこでまず最初にこれはブラック6じゃ
21:54なくて mc エッジ icr という
21:56天気に比較的強い系統のマウス何ですか
22:00それを用いて電気条件を振ってどのぐらい
22:03だったらゲノム編集が可能かということを
22:05調べましたここでは電流値50 ma から
22:09400 ma まで降り一つの情景あたり
22:122匹のメスマウスを用いて愛護なった方を
22:15行いチロシナーゼを隊練習をターゲットと
22:17したゲノム返球を行ってみました
22:20って日中気配で大量買い中止実際にどの
22:25ような感じだったのか見てみましたところ
22:2750 ma ではこのグレーのバーという
22:30のは回収できたタイプの数になります
22:32沢山の体 d はあの回収できるんです
22:35けれども実際のゲノム日置流をが起こった
22:37答えはいなかったと
22:39まあこの黄色のバーガーとのゲノム編集が
22:41起こった答えのカードをえっと示してい
22:43ますでえっこの系統は出てはですね100
22:47ma で200 ma ぐらいの強肩だ
22:49共同良さそうなんではないかというふうに
22:51へというようなことを示唆する結果が得
22:54られました
22:56で実際に現在この系統を用いると計150
22:59ma で愛語ナットを承知しています
23:03それでは暗く6マウスではどうなのかと
23:05いうことを次にへと実験を行いました
23:08ここでは100 ma もしくは150
23:11ma のあのパルスをかけるような地域を
23:14行いましたがそれそれぞれ5匹ずっと滅々
23:17マウスと準備しこの場合はですねえっと
23:21欄干を引き出してきだけれども溶液は中右
23:25せずに引き出したランカーにそのまま
23:27パルスをかけてそのまま戻してあの人気を
23:30継続させるようなティッケーを行いました
23:33その結果ですね100 ma ではすべて
23:36のメスマウスが妊娠してそこから胆汁酸
23:38答えものタイピングを得ることができたん
23:41ですけれども150 ma ですとその数
23:44がずっと子を受けることが分かりました
23:47やがて100100 ma の方がより
23:49ベターではないかということがわかった
23:51理由
23:53そこで次に100 ma の条件で実際に
23:56あごマット方を行ってみることにしました
23:59そのペッカーこれになります標的遺伝子は
24:01ペットをチロシナーゼ遺伝子です
24:04でブラック6系統はこのように色がついて
24:06いますので標的電気が両アリルが
24:10ノックアウトされると色素が
24:13見られなくなるというような表現型が期待
24:15されるわけです
24:17て10匹のんあの兄心滅まあ分間介護なっ
24:19た方を行ったところすべてがえっと利益を
24:22継続し最終的に48個体の体重を得ること
24:25ができました
24:26で実際に表現型を見てみたところ90%が
24:31色素がないようなものであったと品は医療
24:34アリルがつぶれているということが分かり
24:36ました
24:38また方はれるだけあ潰れているような答え
24:40も含めます途中16%もの答えがいい何ら
24:44かのゲノム編集を受けていたということが
24:46わかり非常に高い効率で g 併給が b
24:50チックスケートでもできるということが
24:52わかったわけです
24:55これはえっとまだ未発表のデータなんです
24:57けれどもこういった英語法を用いて
25:00ブラック6マウス系統を用い
25:02実際に人形の疾患モデル等を作ることにも
25:05成功していますここではフェリペ惇明商の
25:10えっとモデルマウスを使ったあの作った例
25:12ですけれどもこの場合ですね2カ所の
25:15ガイドああana の設計値そこを同時に
25:17切って ss odn 200ベースつが
25:21まぁちょっとそれより短いぐらいない
25:23スーツオーリエのを用いてヒト方の丙火を
25:26持った配列とえっと日間するようなことを
25:30行った結果実際にですねそういったマウス
25:34が取れてきて8生きてきたまま保護の
25:36マウスでは人のエネルケトン尿症の患者
25:39さんと同じ表現形を示すということが
25:42わかっていますこのようにブラック6
25:45マウスでも十分人形のモデル動物を作ると
25:47いうことが可能にあったかぴー吹いあの
25:50言えます
25:52はいっ
25:54次にですねえっとより大きな入れとノック
25:57インができないかということでまぁ実際に
26:00はえっと ss odn を用いたの国中
26:03の非常に効率よく動くんですけれども
26:05200米ちぇる大きいエスエスディーエヌ
26:07エーとのドナーべくとアートなぁ dna
26:09を用いての口に期待といったニールは多々
26:12あるかと思います
26:15えっとこれですねちょっとあの今回から
26:17ずれるんですがえっと我々が最近8
26:21まあ別件の別の研究で行った8あのマウス
26:25に関して紹介させてくださいこれはですね
26:28えと
26:29遺伝子治療等をこのを行う上で実際に
26:34ゲノム編集の技術を用いた遺伝子治療を
26:37目指す上でベル編集し薬というものを標的
26:40の臓器にいかに効率よく打てればするか
26:45またその標的の細胞でいかに効率アップ
26:47ゲノム編集を動きかということは非常にま
26:50重要なへ課題でありそういったことを
26:52インビボで評価のできるようなモデルって
26:55いうものの開発がの望まれていましたが
26:58そのようなジョーカーの状況の中我々は
27:01その前金デッリフィー傾向慰霊地を発現
27:04するようなマウスからそのえっと gf
27:06良い練習おこう
27:08えっと壊してあげてまぁフレームがずれる
27:10ような形に来てあげてあげたまあマウスを
27:13作りましたこういった8ここでデルタ
27:15edfe とらんてぃくまーすと書いて
27:17ありますがこういったマウスを守っている
27:19とうまくこの gap のフレームを戻し
27:21てあげるようなゲノム編集を行う等つの
27:24クレームが元たところ細胞ではこのように
27:27またあの tfp の傾向があの
27:30確認するようになるといったあのシステム
27:33のまあ普通になりますまぁ実際こういった
27:36えっとあの
27:37まーすを用いてこれまでに例えばその関東
27:40にゲノム編集し約出ればする際にまあ
27:43プラスミド dna で入れるよりも
27:45タンパク質 rnp ですねを用いて入れ
27:49た方がより効率がイイですうっていうよう
27:51なことを示すような論文等を発表している
27:54んですけれどもまあこの時にですね8
27:56キャス9だけでなくてまあ実はガイドあれ
27:59ねぇもうちょっとのプラスミドもしくは
28:01その送りスパーレートレーサーれい姉の
28:03コンプレックスで枚れるようなことを行っ
28:06ていましたただその場合によっては巣の外
28:08呑 rna 擬態をもともとえっとこの
28:11マークの中で発言させておくとまぁ便利な
28:14場合もちょっとあの
28:16あったのでそういったガイドあるに発現
28:19するようなカセットをさらに導入した
28:21マウスを策定
28:23することにしました
28:24その時にですねまぁ必要なえっと
28:28カセットの大きさというものがアームを
28:29含めて500ベースぐらいになるという
28:32ようなことに会が分かりました
28:35実際一本鎖 dna をあの愛顧なった方
28:39であの導入する場合ですね非常にあの
28:42たくさんの量の dna を必要とするの
28:45で自分家で合成するというのはなかなか
28:47ちょっとは労力的には難しいですねそこで
28:50今回はそのティンスクリプトさんとの
28:53えっと共同研究ベースでですねこういった
28:55長い一方鎖 dna というものを合成し
28:58ていただいてそれをノックイン動物作成に
29:01利用するような a 実験を行いました
29:05その時にえ
29:07シンプルなその ss dna 一本鎖
29:10dna だけではなくてこそホロチョウ8
29:12まあ ps 就職をした一本鎖 dna も
29:15実際に8構成していただきそれも使用して
29:19みることにしましたまた方法としては
29:23アイゴなところだけでなく従来のつの顕微
29:26注入法も同時に行いちょっと比較等をして
29:30みました
29:31ちなみにこのえっと母のカセットに関して
29:34ワロタ2 at スティックスローカスに
29:36ノックにするような実験となっていま
29:40で実際にえっとそういった越冬のクイーン
29:42実験を行った結果ですねまあこちらが愛護
29:45なと方こちらがマイクロインジェクション
29:47方で得られた8お答えのタイピング結果
29:50ですけれどもこの la 銅像の下の方の
29:53バンドですねこれに関しては野生型の動物
29:55からも得られるバンドになります一方で
29:58この上の方の
30:00バンドに関してはうまくノックにできた a
30:02答えで増えるようなサイズのバンドになっ
30:05ていますまあこれを見ると明らかなとおり
30:08マイクロインジェクション方だけではなく
30:09て i gonna と方でも十分
30:12だ高い効率での国答えがとれているという
30:15ことがわかるかと思いますまた粉赤い枠に
30:18関しては8 ps 就職した8 s dna
30:22を用いたものであり黄色い枠の方は p っ
30:25なぜのスポンシンプルなえっと s dna
30:27を用いたものとなっていますで結果の詳細
30:31はこの表にれた通りなんですけれども
30:34まあ愛奴なぁと4枚プロジェクション方
30:36あのいずれの場合もですねこの実験に関し
30:39ては8 ps 就職をし大雪 dna て
30:42ノックイン効率が非常に高よさそうだと
30:44いうことが分かりましたまたその6 in
30:47郡愛子なった方でノックイン効率もまあ
30:49兼備駐留4と比べて全く遜色がないえっを
30:52非常に高い効率でノックにすることが可能
30:55だということが分かりました
30:58少なくつクラフトもこの実験では ps
31:01就職がまあ良さそうだと言うけカエラム得
31:03られましたがまぁ今後クソの再現性という
31:06ものはいあの確認していく必要があるかと
31:08思います
31:10で実際にへライター越冬答えのですね
31:13えっとノックイン部分の6いた部分の配列
31:16を3月意見す方で確認した結果このように
31:20ですねアームの首都からから8 pcr を
31:22行って大学機シーケンスを行ったんです
31:25けれどもこのようにまあ非常に正確にです
31:28ねなあえっと
31:30たので言えねーなーああの配列がきちんと
31:33ノックにされていることということが
31:34分かりました
31:35またこのガイナーレ姉のノックインマウス
31:38とその先ほどの出る台でフィノックイン
31:41マウスをまあ掛け合わせて両方の遺伝子を
31:43持ったマウスを用いてその末にですね
31:46キャッシュ内のタンパク質の日を関東に
31:48デリバーしてあげた場合ですねこのように
31:50えーとあのちゃんとあの標的の細胞でです
31:53ねゲノム編集が起こって傾向が発すること
31:56が発することが分かりました従ってこの家
31:59の外だあれ年発現カセットというものが
32:02きちんとワークしていることがこれで確認
32:04できたわけです
32:06はいっ
32:09てそれがより長い a dena では
32:12どうなのかということでこれは我々はいで
32:14にですねもうちょっと長いえっとカセット
32:18ですね傾向遺伝子を含むぐらいの1型 b
32:21よりちょっと短いぐらいの仮説あの ss
32:23dna をですねこの場合は自分自身で
32:25合成してのクイン実験作ったあのあのを
32:29使ったことがあります
32:31この時は逆転写ポースを利用した方法でつ
32:34かあのローラー dna を調整したん
32:36ですけれどもまぁ実際にですねあのノック
32:39インすることは可能です
32:40ただこの時はは一番行為これまでに飯の
32:44食い効率でこれ以上のも何が効率でノック
32:47にすることまだまだちょっと難しいという
32:49こともありよりあのを
32:52皆さん何らかの工夫が必要ではないかと
32:54いうふうに県時点では考えています
32:58はい
33:00ロックいいともあの少し絡むんですけれど
33:03ももう一つはコンディショナルなノック後
33:06道具ですね
33:07フロックスカセットを
33:10クロックスピード入るとエクソンの両脇に
33:12えっと
33:14挿入したようなそういったフロックス
33:16カセットを持った
33:18こんにちはのロッカーと動物っていうもの
33:20はまあニーズが高くてそういった動物を
33:22簡単に作ることができないかといった
33:25えーっ実験というものはよく行われてい
33:28ますって愛護なところに関連するものでも
33:31今の堰堤までに二つほど会報告は出てい
33:34ます一つはシーク園舎ライゴン at と
33:36いうものでこれはロックス p 2つの
33:38ロックス p 入る配列を別な的に挿入し
33:42てあげるということを行いそれによって
33:44一気に一度に広2つはガイド rna を
33:47効かせた時にはつの間がデリー経によって
33:51抜けてしまうことが多いですがそれをまあ
33:53回避しようというような方法になります
33:55ああああああテーマ2日間連続でですね
33:57同じマウスに関して2回連続態度なった方
34:01を行いましょうというような様子1最後期
34:03で方が片方のロックしぴを入れて小さい
34:06動きにもう2入れてということを想定した
34:08a 実刑になりますで実際にその標的領域
34:11ではイン出る mutation 明日
34:12それぞれの領域に書いて怒っていることは
34:15分かったんですけれどもまだのブロックし
34:17としてへきちんとまあまああの入ったもの
34:20が取れていないような状況となっています
34:22でもう一つはですね領事は大学のペンペン
34:25履く履かせたというのグループの8報告な
34:28んですけれどもこちらですね陳腐でに2つ
34:31のガイド r 姉と2つの3時開演と ss
34:34odn 寝るxp をするそれぞれ持って
34:37いるようなものを使っての同時に一気に
34:40入れてあげるようなええっ実験です
34:42まあ彼らは実際に5カ所ぐらいの廊下書に
34:46関してフロックスあのマウスをアグな
34:49ところで
34:51入れることに成功しているのでこういった
34:53方法でもまあ十分できるのかなというふう
34:55に思っています我々はまだ8 pro
34:57lite にいないんですけどけれども
34:59まあ機会があったらあのやってみたいなと
35:01いうふうにお考えています
35:03はい
35:04最後ですねえっとマウス以外の生物家では
35:08愛どなた方がどうなのかというようなこと
35:10になります
35:12でマウス以外でいるうわですね村ラットで
35:14ええ
35:16資源医学研究量の松山先生たちのグループ
35:20また続いて浜松医科大学の高林先生たちの
35:24グループがですね
35:25こなったこの成功例をこのように発表して
35:28います最近は我々もですね実際にラットを
35:32使った後なった方を行っていますここでは
35:34ですね東海アーボおいたと言うえっと東海
35:37大学で何世代も100世帯以上経前後輩
35:42繰り返して樹立された
35:45マウスこれは非常に頭のいい案ラパラっと
35:48ですね非常に頭のいいラットなんです
35:50けれどもそれでえっとまぁ愛護ナット多く
35:53なりました
35:54このロッドでうわですね特定のアミノ酸の
35:57血中濃度もしくはへとノウでの濃度という
36:01ものが高くなることが分かっていたので
36:03そのアミノ酸の代謝構想を完全
36:06ノックアウトするようなバットを作ること
36:08にしましたで最初はいくつか条件をあの
36:11電気灯器が降っていいところを見つけよう
36:13としてたんまあその中でまぁ一番良さそう
36:16のところですね実際にこの遺伝子がほぼで
36:20あの潰れているようなえっとラットを得る
36:22ことができましたそういったラットでは
36:25実際にその標的なアミノ酸の血中の濃度が
36:28上がっていることが分かりました
36:31このラットでのアイゴなった方ですけれど
36:33も実際にマウスで使うものと全く同じ
36:35ツールを用いてタッチすることが可能です
36:38ちょっとした違いというのは養液の量だけ
36:42あの違いますねえっとマウスではだいたい
36:451.5マイクロリッターを一覧からたり
36:48使うんですけれどもラットの場合ですね兄
36:51から2.5マイクロリッターぐらい使い魔
36:53まあそのぐらいが違うくらいであとは全部
36:55同じような8ステップで作ることが可能
36:58です
36:59はい
37:00低マウスラット以外てっとハムスターでの
37:03成功例がありますこれは riken
37:05brc の尾田先生たちのグループなん
37:07ですけれどもアクロシンの遺伝子に対して
37:10ハムスターでのパーツ数ことに成功してい
37:12ます
37:14重要なのハムスターというのは受精卵が
37:16非常にですねっと光感受性が高くてえっと
37:20体外に取り出してしまうと発生させること
37:22が困難だということが h られています
37:25まあそういったへ動物でまぁ愛奴なった方
37:28用いると卵管の中に受精卵がある状態周知
37:31できるので非常に高えっと
37:34ハムスターに適した方法であるというふう
37:36に館あいごのところ敵つ方法であるという
37:39ふうに考えています
37:43まあここまでのまとめですけれども
37:45a
37:46体内にあるアンカーの中にあるその受精卵
37:49に炊いて
37:51エレクトプレイジョンインディ4-21中
37:53のエフェクトぷれーしょんを破壊して
37:55ゲノム編集し薬を this error
37:57に入れてゲノム編集動物を作成することが
37:59できるということが分かりました
38:01またへもっともその
38:03ポピュラーなマウス系統であるブラック
38:05てぃくすとラインでの条件検討最適化にも
38:08成功しました
38:10またその後100 base までのあの
38:14長田 ss dna を用いたの国であれ
38:16ば非常に高い効率でロックにすることが
38:20可能だということが分かりましたその時に
38:23と合成していただいたまいースクリプト者
38:26から合成していていただいたエース ftn
38:29を用いて簡単にできるということが分かり
38:32ました500ベースペア500ベース
38:35くらいあればある意味こう
38:37短い文とエクソンの入ると朝んだロックス
38:39マウスアプロック数配列を入れたりとか
38:42あとはマイクロ r ねああれねーのかせ
38:44トイレ入れたりとかっていう十分な長さが
38:47ありますので目的に応じていろいろないー
38:50様々な使い方ができるかと思います
38:53またいろんなところに関してはマウ氏以外
38:55にもらってハムスターでの応用例が報告さ
38:57れていて今後また別な生物種でもあのでき
39:00てくるだろうなというふうに考えています
39:04出会い後のと4のアドバンテージです
39:06けれども
39:07えっと一つはその
39:09使用する動物を削減することができると
39:13いうことにあるかと思います
39:15例えばへと
39:18そうですねあの集
39:20偽妊娠動物を準備する必要がないという
39:22ことがあります日頭たその滅マウスですね
39:26を全くさっきふぁいすることなく
39:29犠牲にすることなく受け飲む20動物を
39:32つくれるということもありますので動物
39:34愛護の観点からも潰れた方法であるという
39:37ふうに言えるかと思います
39:40でもう一つはあの非常にシンプルがしたら
39:43ステップはシンプルなんですねなので
39:45えっと従来法のように難しい技術も必要と
39:49しないという大外での会調査も必要とし
39:51ないということでちょっと習えば誰にでも
39:55ゲノム変異種動物を自分自身で作ることが
39:57できるっていうような a ことにことが
40:00いい良いかと思います
40:01まぁ実際にですね卒業研究の学生たんです
40:04ね4年生とかの学生さんが自分が使用する
40:07下の迷宮動物を自分で打ったのアイゴな
40:10ところで作りましたというような報告を
40:12いくつも聞いています今後もっと多くの
40:15研究者ではパレット等に利用されていくん
40:19じゃないかというふうに期待しております
40:22でプロと君等の詳細に関しましてはこの
40:25ように論文でこれまでに発表しております
40:29またレビューやっとちょっとしたコツに
40:31関しても a子のようなタイに行って紹介
40:33していますので機会があったらご覧頂けれ
40:36ばと思います
40:38また aiko のところに関しては
40:39国内外でワークショップやえっと講習会等
40:43を得られてきました
40:45残念ながら去年はですねえっところ等の
40:48感染拡大の影響があり全てなキャンセル
40:50ぶーとなってしまったんですけれども
40:53また少しずつ再開していきたいと思ってい
40:56ますのでぜひ機会がありましたら参加
40:59いただければというふうに思います
41:02えっと以上になりますがえーっこの後方の
41:05愛奴なところの開発および変えるように
41:08関しましてはここにあげた先生方の協力の
41:10もとを行われたものになりますこの場を
41:13借りてお礼申し上げますご静聴ありがとう
41:16ございました
41:21江津科教授貴重なお話を頂きありがとう
41:23ございました
41:24おやつ文やターン
41:26ご質問やシングルストランド dna に
41:29関するお問い合わせなどがございました
41:31チャットボックスにご記入お願いいたし
41:33ます
41:34後日メールにて回答させていただきます
41:37チェーンスクリプトでは様々なベビなぁを
41:39随時開催しておりますのでご興味がござい
41:42ましたら是非ご参加ください
41:44それではこれをもちまして本日の
41:46ウェビナーを終了させていただきます
41:48お忙しいところご参加いただきまして誠に
41:51有難うございました

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