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Como Preparar Gel de Poliacrilamida 12% para SDS-PAGE em 5 Passos Rápidos! 🔬🧪 — Transcript

by Bruno Mayer · 2,897 words · 439 segments · language en · Watch on YouTube

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0:00Olá, pessoal. Eu sou Bruno Maer, sou
0:02biomédico e pesquisador aqui da
0:03Universidade Federal de Ciências e Saúde
0:04de Porto Alegre e no vídeo de hoje a
0:06gente vai preparar um gel de
0:07poliacrilamida a 12%. Então vamos comigo
0:13[Música]
0:16acompanhar. Então a gente vai ã colocar
0:19plástico filme na bancada para proteger
0:20a
0:21bancada, que a gente não quer contaminar
0:25a bancada com acrilamida, que eu já vou
0:27mostrar para vocês o problema
0:34dela. Então a gente separa um local
0:37aonde a gente vai trabalhar com
0:38acrilamida para não contaminar essa
0:40bancada, porque como vocês podem ver
0:42aqui, a acrilamida ela líquida, ela é a
0:46acrilamida líquida, ela é tóxica. Então
0:48tanto pro contato com a pele, com os
0:50olhos, ela é cancerígena, então é um
0:52produto que a gente não quer derramar na
0:54bancada ou encostar nele. Então sempre
0:56que a gente for trabalhar com a
0:58piramida, a gente vai trabalhar usando
0:59as luvas. Aqui a gente vai utilizar
1:02esses moldes de vidro, então, para
1:04colocar o gel aqui dentro do molde.
1:05Depois vocês vão acompanhando no vídeo.
1:07Primeira coisa que a gente vai fazer é
1:09higienizar esses vidros. Muito bem.
1:11Então, com álcool 70 e um pouco de
1:12papel, a gente vai fazer a limpeza dos
1:14nossos
1:20[Música]
1:28moldes. Certo? Então, com os moldes
1:31limpos, a gente pode preparar esses
1:33moldes. A gente vai est utilizando um
1:34kit da marca Biohrad para montar a
1:37estrutura onde o gel vai ficar ali
1:39dentro, né? Como se fosse montar
1:42uma, como é que eu posso dizer isso? Um
1:45molde pro gel, né? Então, a gente pode
1:47notar aqui no vidro que ele tem uma
1:50partezinha mais elevada, né? Quando a
1:53gente coloca o vidro em cima
1:56dele, ele forma um uma espécie de
2:00vãozinho aonde o gel aqui no meio. Então
2:04posicionado. Aqui a própria placa da Bio
2:07ela já diz escrito a parte que tem que
2:09ficar para cima. Então tem uma seta
2:10apontando para cima e a parte up. Então
2:12eu vou só colocar esse vidro aqui, vou
2:14deixar ele bem alinhado um com o outro e
2:17vai ficar dessa forma
2:19aqui. Daí para colocar no molde, a gente
2:22pode deixar o molde aberto. Ele tem um
2:24como se fosse uma porteirinha. Dessa
2:27forma ele tá fechado e aí dessa forma
2:29ele tá aberto. Então eu coloco o nossos
2:32o vidro aqui dentro e aí prendo eles
2:36fechando dessa forma assim, ó.
2:38Agora o vidro tá preso aqui e aí tá
2:42pronto já para entrar no molde depois no
2:44nosso nosso aparato de plástico ali.
2:46Então eu vou montar esse primeiro que a
2:48gente vai fazer dois g ao mesmo
2:50tempo. O segundo a mesma coisa. A parte
2:53up para cima, a gente coloca o vidro.
2:56Então alinha eles dois. Vai ficar dessa
3:00maneira. A gente abre o aparato e então
3:05coloca ele o vidro aqui dentro.
3:09A gente pode usar até a própria bancada
3:10para alinhar esses vidros aqui. E aí
3:14fecha essas abinhas dele, vai dar um
3:17estralinho e aí tá conectado. Então aqui
3:19dentro vai ser onde a gente vai pipetar
3:22o gel nessa parte de cima. E esse furo
3:24de baixo a gente vai fechar depois ele
3:27com essa borrachinha aqui, colocando ali
3:29no molde. Já mostro mais à frente no
3:32vídeo. A gente vai utilizar esse suporte
3:34aqui da Bioad para fazer a montagem do
3:35gel. Então, primeiro a gente coloca o
3:37suporte e coloca aquelas borrachinhas de
3:39vedação na parte de baixo dele. Então
3:42elas vão encaixadas aqui nessa nessa
3:44área destinada para
3:46elas. Depois de colocar a borracha de
3:48vedação, ela é que vai vedar a parte de
3:51baixo do gel. Então a gente vai encostar
3:53aqui os os pezinhos do aparato.
3:56Encaixamos ele aqui e levantamos a
3:58presilha.
4:00E aí colocamos o gel aqui. E essa
4:02presilha então vai pressionar o vidro
4:05contra aquela borracha, fazendo com que
4:07não vaze o líquido ali por baixo. Então
4:09aqui a gente vai colocar o segundo gel
4:11também
4:12encaixado no nosso aparato ali, os
4:14pezinhos encaixados. E aqui então o
4:17nosso suporte para receber o gel, para
4:19receber a primeira a primeira camada de
4:21gel. A gente vai fazer dois tipos de gel
4:23diferente, um gel de empilhamento e um
4:25gel de corrida. Então, esse é o molde já
4:28prontinho e agora a gente vai pra
4:29preparação do líquido do que vai virar o
4:32gel. Então, posteriormente. Então, nessa
4:34próxima etapa a gente vai precisar de
4:36alguns tubos
4:37Falcon. A gente vai fazer então dois
4:39géis. O primeiro gel que a gente vai
4:41fazer vai ser o gel de corrida, onde a
4:43gente vai pipetar ele no vidro, depois
4:46sobrepor com um pouco de água, depois a
4:48gente tira a água e coloca um gel de
4:50empilhamento. Mas a gente então vai
4:51fazer o gel de corrida nesse primeiro
4:53falcon aqui, só seguindo as instruções e
4:56as medidas que a gente vai colocar aqui
4:58na tela. O primeiro ingrediente, então,
4:59que a gente vai colocar aqui para fazer
5:01o gel é a acrilamida. Então, a gente vai
5:03utilizar aqui uma uma acrilamida com
5:05bisacrilamida. Então é uma, por isso gel
5:07de poliacrilamida, mistura de duas
5:09acrilamidas. Hã, 4 ml, então, ou 4000
5:14microl aqui no nosso
5:26foco. Pipetados 4 ml, então, da
5:28crilamida aqui dentro, é sempre
5:30importante lembrar que até as ponteiras
5:32que a gente pipeta a crilamida, elas
5:34ficam contaminadas e têm que ser
5:35descartadas em local apropriado. o
5:37descarte de poliacrilamida e a gente
5:40coloca então aqui dentro para ser
5:41descartado depois adequadamente, até
5:43porque esse reagente aqui, como eu
5:44comentei anteriormente, ele é
5:46cancerígeno. Todas as recomendações
5:48aqui. Então o segundo o segundo
5:50ingrediente então que a gente vai
5:52adicionar no nosso gel é um TRZ HCL de
5:55pH 8,8 para o gel de corrida. um
5:59reagente que a gente preparou
6:00previamente, mas no próximo vídeo a
6:02gente pode também mostrar como que se
6:03prepara esse tris aqui. Então, desse
6:06trozo a gente vai pipetar
6:08373 microl. Então, primeiro eu vou
6:11pipetar 3.000 e depois eu vou
6:13complementar com os outros 73.
6:21Então aqui eu já terminei de pipetar
6:23então esse volume 3733 do nosso Tris HCL
6:27PH
6:288.8. O nosso próximo ingrediente então
6:31que a gente vai adicionar é um pouco de
6:33água desse
6:34lado. Então aqui a gente já separou um
6:37tubo Falcon com um pouco de água e o
6:39volume então que a gente vai colocar é
6:41de
6:422107 microl.
6:46Então, primeiro eu vou pipetar
6:562.000. Então, o nosso próximo
6:58ingrediente que a gente vai colocar é o
7:00SDS a
7:0110%. Então, são 100 microl que a gente
7:04vai colocar aqui. 100 microl.
7:14Então, o nosso próximo ingrediente aqui
7:16nessa receita é o APS, também a 10%,
7:19geralmente ele fica congelado aqui na
7:21nossa mão, a gente já descongelou ele
7:23para poder pipetar. Então, na solução, a
7:25gente vai utilizar aqui 50 microl
7:32dele. E por fim, a gente vai usar um
7:36Tmed, apenas 10 microl. E a partir então
7:39do contato do Temmed com APS, é que vai
7:42começar de fato a solidificação dessa
7:44solução aqui. Então a gente vai
7:46adicionar os 10
7:51microled e a partir daí vai começar a
7:54parte de formação de gel mesmo
7:56propriamente
8:00dita. Então eu vou fechar aqui o meu meu
8:03frasco, meu volume final 10 ml. Quer
8:06dizer que deu tudo certo as medidas que
8:08a gente pipetou aqui. Vou fazer uma
8:12mistura e depois de algumas inversões, a
8:15gente já pode pipetar isso aqui no nosso
8:17suporte. Então agora a gente vai pipetar
8:205 microlros em cada um dos nossos
8:28suportes para que o gel faça a sua
8:31solidificação na parte na parte interior
8:34do vidro. Então, encosta minha
8:42pipeta. A gente tem que observar se ele
8:44também não tá vazando por algum local.
8:46Então, depois de colocar o primeiro ml,
8:48a gente verifica se não tem nenhum
8:49vazamento aqui na nossa estrutura. E aí
8:52eu posso colocar o segundo ml.
8:58Então a gente sempre vai pipetar entre
9:01os vidros e o gel, então ele vai
9:03solidificar entre os vidros.
9:29Feito o primeiro, a gente vai pro
9:31segundo. Mesma coisa. pipetamos o
9:33primeiro ml e a gente observa então se
9:35não há nenhum vazamento do do gel pela
9:38borracha que deve que deve vedar o vidro
9:40ali embaixo.
10:07M.
10:11Depois de pipetado então esse volume de
10:135 ml em cada um dos vidros, a gente vai
10:16completar o restante do volume do vidro
10:17com
10:19água para que a água então ela pressione
10:22o gel e fique
10:26retinho. Não tô vendo o gel ali, mas
10:29tudo
10:30bem. Então aqui eu só vou
10:32completar e
10:35vazou. Esse aqui vazou. né?
10:40Ó, é esse da esquerda aqui, o gel ele
10:44vazou aqui embaixo, então a gente acabou
10:46perdendo esse gel. E o nosso gel da
10:49direita, a gente consegue ver que o
10:51volume dele continua na no local onde
10:53deveria. Então a gente vai
10:56colocar Então, a gente vai colocar a
10:58água na parte superior aqui do
11:02gel. Pode ver que a água começa a se
11:04separar do gel, eles não se misturam. E
11:07é justamente isso que a gente espera. A
11:09água vai pressionando o
11:13gel e vai formar uma linha de separação
11:16entre o que é gel e o que é água depois,
11:18quando ele se solidificar.
11:28Então gente, como vocês podem ver, esse
11:30primeiro gel aqui não tava bem vedada a
11:33borracha, ele acabou vazando. Podem ver
11:35como o líquido da acrilamida, ele desce
11:37pra bancada e acabaria contaminando a
11:39bancada se a gente não tivesse então
11:41colocado esse plástico aqui que a gente
11:43vedou bem. Então, por isso sempre se
11:45atentar para os procedimentos básicos de
11:47biossegurança. Colocando o plástico
11:49filme aqui, a gente já evitou um
11:51problema de contaminar a bancada e
11:53depois poder contaminar algum outro
11:55colaborador aqui do laboratório. Às
11:57vezes, né, muitas vezes os nossos
11:59ferimentos não dá certo e a gente
12:01precisa repetir. Então, esse primeiro
12:02gel aqui, a gente não vai conseguir
12:04aproveitar ele. A gente pode até remover
12:07e vamos dar segmento só com aquele que
12:09que deu certo até o momento. Então,
12:12dando continuidade aqui, a gente esperou
12:14um tempo o gel solidificar. É importante
12:17lembrar que alguns climas frios isso
12:19pode demorar um pouco mais e num clima
12:21quente ele solidifica um pouco mais
12:23rápido. Como a gente vai saber que o gel
12:25solidificou? A gente vai ter que tirar
12:27ele aqui do suporte e olhar ele contra a
12:30luz. Não sei se na câmera vai pegar, não
12:32sei se a câmera vai conseguir focar
12:34muito bem, mas aqui existe uma linha que
12:37a gente consegue visualizar onde divide
12:40o que é o gel e o que é a água. E agora
12:43a gente vai levar até a pia e vai
12:44remover essa água aqui de cima e aí vai
12:47fazer uma secagem para então colocar o
12:48gel de empilhamento aqui no local onde
12:50tá a água. Então a gente vai ali pra pia
12:52agora. Então aqui na pia a gente vai só
12:55eh despejar essa água
12:58aqui por inversão e a gente pode ver que
13:00o gel ele tá sólido ali dentro do vidro
13:03enquanto a água começa a escorrer aqui
13:05no lado. Então a gente já pode inverter
13:07ele consegue ver bem o gel aqui dentro
13:10do vidro. Então agora a gente vai secar
13:12o vidro com papel filtro. Então eu pego
13:15um pedaço dele e vou só tirar o excesso
13:17de água que fica aqui dentro do do nosso
13:20filtro. Eu tento não encostar aqui com o
13:23papel no gel, só para não estragar ele
13:26ali. Então aqui a gente vai tirar o
13:28excesso de água e vai deixar ele seco
13:31aqui, tanto por fora e por dentro.
13:33Então, depois de remover toda essa água
13:35aqui de cima, a gente vai colocar ele
13:37novamente no
13:39suporte. E a gente então vai colocar
13:42agora um gel de empilhamento aqui em
13:44cima. A gente vai preparar esse gel e
13:46vai pipetar ele aqui na parte superior
13:48do nosso vidro. Então agora a gente vai
13:49preparar o gel de empilhamento. Eu já
13:51separei mais um tubo Falcon aqui e a
13:53gente vai pipetar os mesmos ingredientes
13:55que a gente pipetou no gel de corrida,
13:57só que no de empilhamento a concentração
14:00e a disposição desse desse gel é um
14:02pouco diferente. Então a gente vai
14:04começar pipetando novamente a
14:06acrilamida, só que agora a gente vai
14:08pipetar 1000
14:13microl, ok? 1000 microl 1 ml de
14:17acrilamido, certo? O segundo
14:19ingrediente, então, que a gente vai
14:20pipetar é o tri HCL. Só que agora a
14:23diferença é que esse
14:25tr. E a gente vai pipetar então 780
14:35microll. Nosso terceiro ingrediente,
14:38então, é o FDS a 10% e a gente vai
14:41pipetar 60 microll.
14:50Nosso quarto ingrediente é apenas água
14:52deste lado e a gente vai pipetar aqui
14:554124 ml.
15:08[Aplausos]
15:12Depois a gente vai colocar o APS 30
15:15microl. Vou pegar no congelador. Então
15:18agora a gente vai colocar 30 microl de
15:20APS.
15:29E por último, 6 microl apenas do
15:42Temed. A gente vai dar uma homogeneizada
15:44nisso aqui. Então, a gente dá uma
15:46homogeneizada no tubo depois de
15:48misturado. Então, então aqui o volume
15:50final são 6 ml, a gente usaria três para
15:54cada gel. Como no nosso caso aqui, a
15:57gente acabou ficando apenas com um gel,
15:58a gente vai usar só 3 ml desse desse
16:01tubo.
16:03Então, e agora a gente vai colocar então
16:05o gel de empilhamento na parte
16:07superior aqui do nosso gel de corrida.
16:11Então, primeiro ele vai correr no
16:12empilhamento, vai se ajustar e depois
16:14vai de fato para o gel de corrida. Tá
16:17aqui vão ser mais ou menos 3 ml,
16:20dependendo do tamanho do do seu vidro aí
16:22que estiver
16:36usando. Eu vou deixar um espacinho neste
16:39final aqui, porque a gente vai colocar
16:41os espaçadores para formar os pocinhos
16:44aonde a gente vai pipetar a nossa
16:45amostra.
16:46Então eu vou pegar o espaçador. Então
16:49este aqui é um espaçador que a gente vai
16:50utilizar. Então quando enfiar aqui ele
16:52no gel e o gel cristalizar, solidificar.
16:56Depois vão ficar os pocinhos aonde a
16:57gente vai conseguir pipetar a nossa
16:59amostra para fazer a corrida o SDS page.
17:02A minha dica aqui é você sempre colocar
17:04o espaçador em uma maneira que que ele
17:07não entre reto todo de uma vez. E também
17:10pode perceber que ele tem a parte de da
17:11frente e essa parte de trás, né? A parte
17:15que fica virada pra frente é onde tá
17:17escrito aqui a marca do aparelho Bioad.
17:20E ele também tem uma tipo uma
17:23sobressalência aqui nessa parte. Então a
17:25gente tenta enfiar ele dessa forma assim
17:28lateralmente que vai entrando um
17:30dentinho de cada vez para evitar que
17:31forme bolhas de ar ali dentro. Se a
17:34gente acaba colocando ele todo de uma
17:35vez e reto, forma muita bolha de ar e
17:38daí isso daí vai ser ruim depois pra
17:40gente pipetar a nossa amostra e pode
17:42atrapalhar na corrida.
17:44Então, por que que eu não enchi também
17:46ele de gel? Justamente porque depois eu
17:49ia ter que colocar o
17:52espaçador. Então, colocando ele
17:55aqui. E aí eu pressiono ele até o final.
17:59Pode ver que ainda derramo um pouquinho
18:00de
18:02líquido. Então, vou fazer até uma,
18:06pode ver que derramou um pouco de
18:07líquido. Eu vou secar um pouco
18:09desse desse nosso gel que derramou.
18:16E agora então a gente só aguarda a
18:19solidificação. No nosso caso aqui, como
18:21tá bem frio, a gente vai colocar ele
18:23numa estufa a 25º, 23º, uma temperatura
18:26ambiente para que solidifique mais
18:29rápido. Bom, então depois de esperar um
18:31tempinho, a gente consegue ver que o gel
18:33também se cristaliza aqui nessa parte de
18:35cima e a gente já pode remover então do
18:37suporte.
18:39Então eu abro essas abinhas que a gente
18:41trancou no começo e tiro o nosso vidro
18:45pela parte
18:46superior. Eu posso tanto remover o meu
18:49espaçador aqui ou posso guardar o gel.
18:52No caso, a gente vai não vai correr esse
18:53gel agora. Então eu vou embalar ele e
18:55guardar na geladeira para ser usado num
18:57outro dia. Então vou mostrar para vocês
18:59o processo também de guardar esse gel e
19:02deixar ele úmido ali na geladeira.
19:06Então, a gente pode envolver ele com um
19:10papel, um papel toalha mesmo comum. A
19:14gente aí a gente envolve ele
19:22aqui. E aí a gente põe um pouquinho de
19:24água destilada para umedecer o papel.
19:30E a gente consegue ver que já é um pouco
19:32mais fácil de lidar com
19:36ele. Caso a gente não tenha derramado
19:38nada, a gente poderia até usar esse
19:40mesmo papel filme aqui para embalar ele,
19:43mas como o nosso a nossa policrilamida
19:45acabou vazando, então eu vou utilizar
19:48um plástico aqui para envolver
19:52ele que seja
19:58novinho. Então aqui ele fica
20:00embaladinho. a gente faz a identificação
20:03aqui desse gel, coloca o nosso nome, ã,
20:06diz o que que é, que é um gel de
20:07poliacrilamida 12%, ou a gente guarda
20:10ele num local identificado. Então, a
20:13gente já tem a nossa identificação aqui
20:15no laboratório e daqui ele vai pra
20:17geladeira, então, pra gente correr este
20:19gel num próximo vídeo, tá bom? Vejo
20:22vocês no próximo vídeo. Obrigado por
20:24acompanhar e se inscreva no canal que a
20:26gente tá chegando aos 1000 inscritos.
20:28Até o próximo.
20:31[Música]

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