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13 COMO SE ANALIZAN LOS BIOFARMACEUTICOS — Transcript

by Aída Jimena Velarde Salcedo · 17,487 words · 3,176 segments · language en · Watch on YouTube

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1:59Sí.
3:54Sí.
5:49Sí.
7:44Sí.
9:39Sí.
11:34Sí.
13:17Y bueno, vamos a empezar con el primer
13:19orden de estructura, que es la
13:20estructura primaria.
13:22Eh, esta dimensión, pues como dice aquí,
13:24se corresponde a la confirmación de la
13:26secuencia de aminoácidos y por ende va a
13:29identificar la identidad del
13:32biofarmacéutico.
13:34La importancia que tiene la estructura
13:36primaria en los atributos críticos eh de
13:39calidad es, como les digo, pues aquí
13:41dice, pues tiene que ver con la
13:43identidad. Decir si eh si la secuencia
13:46es correcta, pues son los eh
13:49estaremos hablando de pues de la
13:51proteína que nosotros deseamos.
13:53Sin embargo, eh pues también eh nos
13:56puede ayudar a detectar alteraciones en
13:59esta secuencia. Una alteración en la
14:01secuencia puede provocar cambios en el
14:04plegamiento, alteraciones en la
14:06estabilidad, incrementar el potencial de
14:08agregación del producto y en algunos
14:11casos, pues también puede estar asociado
14:12con pérdida de actividad biológica.
14:15Eh por ejemplo, eh la desamidación, que
14:18se hemos es una modificación
14:21química que puede sufrir una proteína
14:23durante su purificación y
14:25almacenamiento.
14:26Eh además eh de que puede identificar,
14:29perdón, cambiar la secuencia eh del
14:31aminoácido por la pérdida del grupo
14:33amino,
14:34se ha visto que eh también reduce, puede
14:37reducir la afinidad de un anticuerpo
14:39monoclonal a su antígeno y por ende
14:42afectando directamente en su eficacia.
14:46Eh la primera técnica que vamos a
14:47revisar eh para evaluar la estructura
14:50primaria de las proteínas es la
14:52degradación de Edman.
14:54Eh esta es una técnica clásica de
14:57secuenciación
14:59eh que se basa en una serie cíclica de
15:02reacciones químicas
15:05eh que permane a permitir identificar y
15:07cuantificar secuencialmente los
15:09aminoácidos desde el extremo amino
15:12terminal de una cadena eh polipeptídica.
15:15Eh esto pues básicamente eh acoplar
15:20la eh la proteína de parte, eh o sea del
15:24del lado carboxilo dejando el amino
15:26terminal libre y pues por reacciones
15:29como dice cíclicas vamos a ir liberando
15:30de uno por uno eh cada cada aminoácido y
15:34eso lo podemos eh identificar.
15:37Identificar, perdón. Entonces el proceso
15:39de la secuenciación de Edman inicia con
15:41la reacción eh del grupo amino libre del
15:45residuo amino terminal con eh un
15:48compuesto que se llama fenil
15:49isotiocianato o PITC o como viene en la
15:52figura PTC.
15:54Eh esto bajo condiciones ligeramente
15:57alcalinas.
15:58Este reactivo va a formar un derivado de
16:02feniltiocarbamil
16:03eh o PTC
16:05con el aminoácido terminal.
16:08Posteriormente al someter al sistema a
16:10condiciones ácidas generalmente con
16:12ácido trifluoroacético
16:14se rompe selectivamente el enlace
16:16peptídico entre el primer y el segundo
16:18aminoácido liberando el residuo en el
16:21terminal en forma de un derivado cíclico
16:24con el isotiocianato denominado eh
16:27feniltiohidantoína
16:29o PHT o en la figura viene como PTH en
16:32inglés.
16:33Eh este derivado va a ser químicamente
16:36estable y puede ser separado mediante
16:38técnicas eh cromatográficas e
16:40identificado este pues principalmente
16:43por HPLC, ¿no? O sea es liberar
16:45pedacito aminoácido por aminoácido de
16:48las secuencias del extremo amino e irlos
16:50identificando obviamente comparando con
16:52el perfil eh de retención de un estándar
16:55del aminoácido con este eh
16:59con este derivado.
17:00Ah una vez eliminado el primer
17:03aminoácido la cadena resultante queda
17:05intacta y disponible para otro ciclo.
17:08Este proceso se este proceso se repite
17:10eh permitiendo reconstruir la secuencia
17:12de aminoácidos eh paso a paso, por lo
17:15tal eh por lo tanto pues nos puede dar o
17:17sea, es una técnica bastante
17:19eh bastante confiable, sin embargo, pues
17:21tiene muchas eh
17:23muchas limitantes.
17:25Am
17:26Aquí, por ejemplo, en cuanto al
17:27rendimiento, cada ciclo eh tiene un eh
17:3194-98%
17:34de eficiencia, lo que implica que, pues,
17:36eh pues, por cada ciclo se va perdiendo
17:39una fracción de la muestra.
17:41Eh esto, por lo tanto, limita el número
17:43de residuos que pueden secuenciarse con
17:45precisión, es decir, que esta técnica
17:47solamente es factible cuando estamos
17:49hablando del análisis am de proteínas
17:52relativamente pequeñas. Mientras más
17:54grande, va a llegar un punto en el que
17:56ya eh
17:57pues, no vamos a poder hacer la
17:58secuenciación con esta
18:00eh con esta seguridad.
18:03Eh en condiciones óptimas, los sistemas
18:05automatizados de secuenciación pueden
18:07analizar eh proteínas entre 30 y 50
18:10aminoácidos con alta confiabilidad.
18:12Habrá otros equipos que puedan alcanzar
18:15hasta los 80, hasta los 80 residuos.
18:17Entonces, pues, hay proteínas que no
18:18tienen esta secuencia.
18:20Pero eh pues, también incluso la
18:22caracterización solamente de esta parte
18:24del amino terminal, los primeros
18:25aminoácidos del amino terminal, pues,
18:27nos pueden dar una pauta, ¿no? De eh
18:30pues, de la identidad. Si bien no
18:31completa, pero pues, sí, eh hay un
18:34pedacito nomás.
18:36Am También eh un punto importante para
18:39que esta
18:42secuenciación sea efectiva es que la
18:43proteína debe poseer un extremo amino
18:46terminal libre.
18:48Es decir, que no haya sido bloqueado por
18:50modificaciones químicas,
18:52como eh la acetilación, por ejemplo.
18:55Am
18:56Esto pudiera llegar a ser una limitante,
18:58porque muchas proteínas recombinantes eh
19:01presentan presentan modificaciones eh en
19:03ese en ese extremo. Además, am
19:07esas reacciones, pues, son ocurren en
19:10algunas proteínas con relativa facilita
19:13facilidad. Yo en, o sea, en mi
19:16experiencia personal yo he mandado
19:18secuenciar proteínas eh con esta técnica
19:20y pues es relativamente frecuente que te
19:22digan, "No, pues tu proteína ya se
19:23bloqueó eh por la manipulación."
19:26Eh,
19:27incluso pues por estas eh pues
19:29exposiciones, cambios de solventes, eh
19:32congelación, descongelación, eh
19:35oxi este el oxígeno presente pues puede
19:38también fomentar estas esas reacciones.
19:39Entonces hay veces donde pues eso no es
19:42no es posible. Entonces eh
19:45pues es importante también controlar muy
19:46bien las condiciones eh de síntesis y la
19:48manipulación de la proteína previa al
19:50análisis.
19:52Ah, actualmente eh su uso está
19:55un pues un poquito más limitado frente a
19:57otras técnicas como la espectrometría de
19:59masas que ya puede en algunos formatos
20:01pues hacer secuenciación de novo.
20:03Sin embargo, pues la secuenciación de
20:05Edman eh pues se sigue aplicando en
20:06etapas eh de caracterización inicial o
20:09tal vez como una etapa eh confirmatoria.
20:11De nuevo, si lo comparamos con un
20:13producto de referencia.
20:16Eh, entonces se puede confirmar eh pues
20:18al menos el el extremo amino terminal de
20:21una proteína, donde incluso si se
20:23llegara a sospechar de un procesamiento
20:24incorrecto durante la expresión, pues
20:26este esta técnica pues nos permite nos
20:28permite confirmarlo. También nos puede
20:30ayudar a verificar eh truncamientos,
20:33degradación de la proteína,
20:35eh
20:37y validar, por ejemplo, algunos
20:38resultados que obtengamos por
20:40espectrometría de masas.
20:44La espectrometría de masas es la
20:46herramienta más poderosa que existe,
20:47creo yo, para el análisis de el análisis
20:50de proteínas.
20:51Eh, obviamente hay muchos formatos de
20:53espectrometría de masas, eh pero pues
20:55hay una versión en que las la que nos
20:57permite eh analizar las proteínas de
20:59muchas eh de muchas maneras y con
21:01bastante bastante precisión. Esta
21:04técnica permite confirmar eh la
21:06secuencia de aminoácidos, así como
21:09detectar y cuantificar modificaciones
21:12postradicionales, variantes moleculares
21:15y productos de degradación de la
21:16proteína con un alto nivel de
21:19resolución, dado que tiene es de las
21:21técnicas
21:23mmm
21:23más
21:25precisas y exactas para determinar la
21:29masa y la carga de algún analito.
21:32El principio general de la
21:35espectrometría de masas, al menos
21:36aplicada para proteínas, consiste en
21:39tres etapas fundamentales.
21:41Primero, que es lo que viene marcado
21:44aquí en la
21:46en la diapositiva.
21:48Donde
21:50tenemos una
21:52una etapa
21:54preparativa.
21:57Perdón, que es esta la de separación,
22:00donde
22:02la proteína que se encuentra pues
22:04principalmente
22:06en solución se puede
22:08separar de una mezcla biológica o en
22:12alguna muestra por su tamaño, por este
22:17por su por su carga, por su punto
22:19isoeléctrico. Aquí podemos utilizar
22:21diferentes técnicas de
22:24de cromatografía
22:26que nos permitan ir separando mmm
22:30una proteína dentro de una mezcla donde
22:33estén presente donde estén presentes
22:35otras.
22:36Ehh
22:38Luego tenemos
22:40bueno, también perdón, como parte previa
22:42a la preparación y que puede incluir la
22:45separación.
22:46Que esto más bien correspondería al
22:48mapeo peptídico, pero
22:50o sea, obviamente pues es parte de los
22:52formatos del espectrometría de masas,
22:54donde la proteína también se puede
22:56preparar, por ejemplo, digiriéndola,
22:58cortándola en cachitos Eh, separar
23:02posteriormente los productos de esa
23:03digestión, esos fragmentos de una sola
23:05proteína,
23:06eh, por, por ejemplo, por cromatografía
23:09de líquidos, por HPLC, eh, por tamaño y,
23:12pues, ir analizando fragmento por
23:13fragmento.
23:15Eh, independientemente de de si es la
23:18proteína completa eh, o un fragmento,
23:20eh, estas muestras
23:23eh, posteriormente van a ser eh,
23:25ionizadas
23:27para generar especies con una carga que
23:30puede ser positiva o negativa, nosotros
23:32lo podemos eh, consi- configurar
23:34principalmente en una en un estado
23:37gaseoso.
23:39Eh, la ionización se puede hacer eh,
23:41mediante electro spray,
23:43especialmente cuando se acopla se acopla
23:44justamente a a HPLC, o también eh, los
23:48el formato más, o sea, los formatos más
23:50estándar para ionización eh, es ESI o
23:53eh, ionización por electro spray o
23:55también MALDI,
23:57que ese se refiere a desorción láser
23:59asistida por matriz, donde eh, a
24:02diferencia de ESI que la proteína está
24:05en una solución, eh, aquí, pues, se fija
24:07la la muestra donde está la proteína a
24:10una matriz eh, sólida junto con algunas
24:12em, eh, resinas o polímeros que cuando
24:15se le hace incidir un eh, un láser,
24:18pues, y eh,
24:20volatiliza justamente eh, los fragmentos
24:22o la la proteína y permite la
24:24ionización.
24:26Eh, los iones eh, posteriormente van a
24:29ser separados en función de su relación
24:32masa y carga mediante un analizador que
24:35sería esta etapa.
24:37Eh, el tipo de analizador eh, que se
24:39utilice va a determinar el grado de
24:41resolución, la precisión,
24:44eh, incluso pues, el tipo de eh, de
24:46iones que pue- o sea, con qué tanta
24:48resolución se puedan separar eh, estos
24:50iones.
24:52Entre los más relevantes tenemos eh, los
24:55separadores tipo TOF,
24:57eh, TOF de Time of Flight, eh tiempo de
24:59vuelo, por ejemplo, no sé si han
25:00escuchado eh la técnica MALDI-TOF,
25:03justamente se refiere a un esquema de
25:05ionización eh MALDI en fase sólida y TOF
25:08por tiempo de vuelo, pero también pueden
25:10tener, o sea, los equipos espectrómetros
25:11además les pueden tener eh otras o otras
25:14configuraciones.
25:15También hay detectores, por ejemplo, eh
25:18tenemos eh
25:20los cuadrupolos
25:22o las trampas de iones o Orbitrap.
25:26Eh actualmente eh decía, como decía, es
25:28muy común encontrar eh formas eh
25:31híbridas donde podemos tener eh ESI con
25:33cuadrupolo o con cuadrupolo con doble
25:36cuadrupolo, triple cuadrupolo, ti-
25:38tiempo de vuelo acoplado con cuadrupolo.
25:40Eh esto pues con la eh
25:43con el objetivo pues justamente de
25:45mejorar o ajustar
25:48eh la resolución y la capacidad de
25:49análisis dependiendo pues del muestreo
25:51de las muestras que tengamos.
25:53Eh eventualmente pues estos estos iones
25:56se van a detectar, eh o sea, una vez que
25:59entran al equipo, se ionizan y entran al
26:00equipo, dependiendo del tipo de detector
26:03eh que tengan, se van a ir separando,
26:05como decía, eh de acuerdo a su masa y su
26:07carga,
26:09eh y eventualmente casi siempre al final
26:11de estos eh de estos sistemas pues hay
26:15un detector pues básicamente de
26:18de colisiones. Los iones van viajando
26:20por esta eh por estos sistemas de
26:22separación, impactan, digamos, contra
26:25una placa que va a detectar eh la señal.
26:27Entonces, eh
26:29aquí eh o sea, ese impacto va a generar
26:31lo que le llaman un espectro que va a
26:33representar la distribución de masas eh
26:35presentes en la muestra. El número de
26:37colisiones, el número de impactos eh
26:40dependiendo de la intensidad de la señal
26:42y el tiempo o la velocidad con la que se
26:45esté haciendo, pues se puede hacer esa
26:46inferencia de cuál es la masa y la carga
26:49del producto.
26:50Entonces, el espectro que se obtiene es
26:52en esencia una firma molecular que puede
26:55ser interpretada para deducir la
26:56identidad y características
26:58estructurales eh del analito, y más si
27:00ya tenemos, por ejemplo, eh espectros de
27:03proteínas eh previamente cargados, o
27:05sea, que eh
27:07o sea, esto sí es una firma única en
27:10cuanto a secuencia eh y carga, entonces
27:12pueden se pueden comparar esos espectros
27:14con las bases de datos.
27:16Am, entonces la espectrometría de masas
27:18se puede aplicar en eh distintos niveles
27:20dependiendo del tipo de información que
27:22podemos obtener. Podemos hacer, como
27:24decía, un análisis de proteína eh
27:26intacta, donde no hay una fragmentación
27:29previa, así como tal se mete al equipo
27:31para determinar eh su ma su masa molar
27:35global.
27:36Este análisis, por ejemplo, nos permite
27:38detectar variaciones eh en masa,
27:40presencias de isoformas, diferencias en
27:42glicosilación, truncam- truncamientos o
27:45degradación eh de la proteína, o sea, si
27:48eh obviamente si no
27:51nosotros esperamos
27:53eh de acuerdo a la secuencia, pues
27:54estaremos podemos identificar cuáles son
27:56esas variables.
27:58Am.
27:59Aquí la limitante que tiene este enfoque
28:01es que pues no nos proporciona
28:03información, o sea, sí nos puede decir,
28:04pues sí, tienes variantes, pero no te va
28:06a decir eh cuáles son o qué
28:08modificaciones eh qué de modificaciones
28:10tienes.
28:11Am, sí nos puede dar también una idea en
28:13cuanto a diferencias eh de masas, por
28:15ejemplo, variaciones de fosforilación,
28:18desaminación o pérdidas de eh de de
28:21ciertos grupos eh orgánicos o la
28:24ganancia de estos grupos orgánicos, pues
28:26podemos sabemos cuál es la masa, por
28:28ejemplo, cuál cuál es la masa molar de
28:29un grupo eh de un grupo fosfato,
28:32entonces si nuestra proteína tiene una
28:33masa mayor o menor a ese valor, pues
28:36podemos hablar de una ganancia o una
28:37pérdida de estos grupos de estos grupos
28:39orgánicos.
28:41Eh también podemos hacer eh eh lo que le
28:44llaman el mapeo peptídico, que bueno,
28:46esto lo vamos a platicar ahorita en la
28:47eh en más adelante, pero pues aquí lo
28:51que pasa es que la proteína eh se
28:53digiere con enzimas, generando péptidos
28:55más pequeños,
28:57siguen totalmente este obviamente todo
28:59este eh todo este proceso y luego se va
29:02armando eh el el fragmento, se va
29:04armando el rompecabezas del fragmento
29:06completo.
29:08Eh
29:09también eh se puede hacer eh un enfoque
29:12que se le llama top down eh donde la
29:14proteína intacta
29:16eh se fragmenta sola, ¿sí? Este sin una
29:20digestión eh previa.
29:23Eh esto pues también hay equipos, por
29:24ejemplo, de como parte de la ionización
29:27que nos permiten también eh pues hacer
29:29esa fragmentación eh
29:32esa fragmentación química.
29:33Eh y esto pues también nos puede permite
29:35ofrecer obtener información eh sobre la
29:38secuencia completa, modificaciones
29:40postraduccionales o isoformas.
30:40bit differently. So, be aware that some
30:42steps shown in this video might deviate
30:45a bit depending on the mass spectrometer
30:47and analyzer used. Let's have a look at
30:50a simplified mass spectrometer
30:53consisting of an ion source, an analyzer
30:57and a detector.
30:59Before inserted into the mass analyzer,
31:02complex samples are often separated, for
31:05example, by liquid chromatography.
31:08The first two steps in mass spectrometry
31:10are called desorption and ionization and
31:13they usually occur simultaneously. This
31:16refers to the process of transferring
31:19molecules into the gas phase, during
31:21which singly or multiply charged ions
31:24are generated. A common method is called
31:27electrospray ionization, short ESI. The
31:32sample is passed through a capillary
31:34with an applied electric field.
31:36Electrostatic repulsion of ions and
31:39other physical effects causes a fine
31:42aerosol that eventually evaporates
31:44resulting in charged gas phase ions.
31:47After ionization, the ions pass through
31:50tiny slits in the mass spectrometer and
31:52are accelerated in a focused ion beam
31:55using an electric field. There are
31:57various analyzers in mass spectrometry,
32:00all of which aim to determine the mass
32:03to charge ratio of ions. One commonly
32:06used analyzer type is the time of flight
32:09analyzer. The principle is
32:11straightforward. The ions are
32:13accelerated in an electric field with a
32:16known voltage and ions with the same
32:18charge gain the same kinetic energy.
32:22Consequently, lighter ions travel faster
32:25through the flight tube than heavier
32:27ions with the same charge.
32:31And more highly charged ions travel
32:34faster compared to singly charged ions
32:37with the same mass. The time of
34:30Entonces, el mapa peptídico es la
34:32técnica central para la caracterización
34:34más detallada de la estructura primaria
34:36de de los biofarmacéuticos y en general
34:38de muchas eh proteínas. Como decía la eh
34:41previamente, ah forma parte del
34:43espectrometría de masas, pero tiene una
34:46estrategia y un procesamiento, una
34:48preparación analítica eh en particular.
34:51Decíamos que esto se basa en la
34:53fragmentación controlada de una proteína
34:55mediante de digestión eh enzimática,
34:58casi siempre es utilizando tripsina,
35:01seguida de una separación, casi siempre
35:05por eh pues cromatografía cromatografía
35:08de líquidos.
35:10Y posteriormente, pues a esos esos
35:12péptidos son los que se eh inyectan en
35:15el equipo, se ionizan, se separan y se
35:17obtienen los espectros.
35:19La el análisis eh o sea, estos estos
35:22espectros de cada péptido generado nos
35:25ayudan eh a reducir la complejidad de la
35:27proteína completa en unidades más
35:29pequeñas para obtener información con
35:31mucho más eh precisión.
35:33Entonces, cada péptido actúa como un
35:36segmento identificable de la secuencia
35:38total
35:39eh y eh se llama mapa peptídico porque
35:43el conjunto eh de esos péptidos
35:45obtenidos eh genera eh un patrón que es
35:48altamente hm reproducible para una
35:51proteína dada. Eh por ejemplo, pues una
35:53proteína que tiene una secuencia dada y
35:55más eh si utilizamos una proteína que
35:59hace pues hace cortes en sitios
36:01específicos que son conocidos, eh por
36:03ejemplo, la tripsina que hace cortes
36:06eh
36:07eh contiguos a lisinas y argininas, pues
36:11incluso se puede predecir de acuerdo de
36:13acuerdo a la secuencia in silico se
36:15puede hm inferir cuál va a ser el el
36:18patrón de péptidos eh que se va a
36:20obtener. Y esto pues es altamente
36:22reproducible, por ende funciona como una
36:25huella digital eh de la estructura.
36:28Eh,
36:29y de nuevo, si esto lo comparamos eh con
36:31bases de datos justamente de estos
36:33espectros, podemos identificar eh la
36:36proteína, eh la o sea, identificarla.
36:40O sea, qué proteína es, eh incluso pues
36:42de qué especie, eh qué grado de
36:45variación tiene comparado con los
36:47espectros eh con los espectros
36:49hm teóricos.
36:51Entonces, eh el flujo experimental pues
36:53consiste que la proteína es sometida a
36:55un proceso de desnaturalización
36:58para exponer los sitios del corte
37:00enzimático. Aquí sí es importante eh que
37:02haya eh pues que esté la la proteína
37:05desnaturalizada. Esto casi siempre se
37:07hace utilizando urea eh o guanidina.
37:11Y eh se realiza la reducción de los
37:13puentes disulfuro usualmente con eh DTT,
37:16pues también para garantizar justamente
37:18la desnaturalización.
37:20Y una etapa de eh alquilación con eh
37:24yodoacetamida, pues para que la proteína
37:26esté completamente eh desnaturalizada, o
37:29sea, para que esos puentes disulfuro no
37:31se vuelvan a formar.
37:33Una vez que la proteína está
37:34completamente desplegada y se ha
37:36estabilizado, se lleva a cabo la
37:37digestión enzimática.
37:39Eh,
37:41les digo con eh con tripsina.
37:44Después de la digestión, la mezcla de
37:46péptidos se va a separar mediante HPLC o
37:49UHPLC, o sea, de eh
37:52la U eh es así como de ultra
37:55de ultra precisión,
37:57eh lo que permite pues separar eh los
38:00péptidos con propiedades fisicoquímicas
38:02eh similares. También aquí pues uno
38:04puede de definir
38:06de acuerdo a la cromatografía de cómo
38:08está compuesta la matriz,
38:10eh con base en qué se van a separar,
38:13¿no? Casi siempre es basado eh en el
38:15tamaño.
38:16Eh, esos eh esos péptidos que se
38:19separan, o sea, conforme se van
38:20separando, está acoplado eh al equipo
38:24eh y va directamente al sistema eh de
38:27ionización y al detector.
38:29Ah, entonces los péptidos eh
38:32los a partir de los espectros que
38:34espectros que se obtienen se identifican
38:36sus masa,
38:37eh su carga
38:39y le como les digo en muchos casos eh su
38:41secuencia cuando se comparan en bases de
38:44datos. Em, también hay equipos eh que
38:47dependiendo de la configuración pues
38:48permiten hacer esta ah
38:51esta secuenciación esta secuenciación de
38:53novo que ni siquiera no sea necesario eh
38:56comparar con bases de datos, sino que se
38:57pueda hacer directamente, pero
38:59obviamente pues tienen que ser
39:00fragmentos relativamente pequeños.
39:03Ah, entonces el mapeo peptídico nos
39:05permite confirmar la secuencia de
39:07aminoácidos, modificaciones
39:08postraduccionales,
39:11eh identificar eh
39:14como se corta en pedacitos se puede ver
39:16y justamente la localización, o sea,
39:18como se puede identificar cada fragmento
39:20y y ese en qué posición está con
39:22respecto a la a la secuencia de la
39:24proteína global, pues nos da nos permite
39:26acotar un poco mejor eh en dónde se
39:29llevó a cabo eh pues alguna
39:31modificación, en qué residuo ocurre esa
39:33modificación.
39:34Mmm, también permite detectar mmm
39:37degradación localizada, así también como
39:40evaluar la consistencia entre lotes o en
39:42estudios de de estabilidad.
39:45Em, entonces
39:47esta eh en general la espectrometría de
39:49masas eh para el análisis de proteínas
39:52pues yo creo que es
39:53la mejor eh la mejor técnica que existe.
39:56Nos permite analizar proteínas
39:58complejas, eh detectar cambios
40:00estructurales sutiles eh que por en que
40:02con muchas técnicas eh analíticas eh no
40:06sería posible.
40:07Ah, sin embargo eh su implementación eh
40:10eh debe ser altamente controlada, o sea,
40:12es bastante engorrosa, o sea, sí
40:14requiere de mucha eh capacitación tanto
40:16para la preparación de la muestra eh
40:20para el
40:22funcionamiento correcto eh de los
40:24equipos en cada corrida y también eh el
40:26análisis de datos es complejo y requiere
40:29eh software especializado. Entonces, eh
40:32pues no no todo, o sea, sí se requiere
40:34mucho entrenamiento y mucha mucha
40:36infraestructura para poder eh hacer un
40:39análisis con espectrometría de masas eh
40:41de proteínas.
40:43Eh de hecho, pues en México pues no son
40:44tantos los laboratorios eh
40:47que cuentan con este tipo de equipos, o
40:48sea, no es algo tan trivial como, por
40:50ejemplo, una cámara de electroforesis,
40:52¿no? Sí se requiere una infraestructura
40:53bastante específica y el mantenimiento
40:56de estos equipos es caro.
41:01Para evaluar eh estructuras de orden
41:03superior eh en las proteínas, aquí pues
41:06ya no ya no vamos a hablar de la
41:07secuencia de aminoácidos, sino de las hm
41:10de la estructura eh secundaria,
41:13eh terciaria e incluso cuaternaria, ¿no?
41:16Eh por ende, lo que se quiere evaluar en
41:20este en este nivel es el plegamiento y
41:24la forma tridimensional del producto,
41:26porque, pues, como ya hemos dicho,
41:28determina en gran medida eh la actividad
41:31la actividad biológica. Entonces, se
41:33deben de implementar técnicas que nos
41:35permitan identificar la presencia de
41:38hélices alfa, láminas beta, la
41:40estructura tridimensional y estructura
41:42eh cuaternaria en el caso de que estemos
41:44hablando de proteínas con múltiples eh
41:47subunidades.
41:49Eh aquí eh la estructura secundaria pues
41:51representa algunos eh retos eh
41:54analíticos, po- y bueno, se la
41:56estructura secundaria y terciaria es un
41:58primero, pues, que eh estas estructuras
42:01de orden superior suelen ser eh
42:03dinámicas. Las proteínas no suelen ser
42:06eh rígidas, sino que existen en un
42:08conjunto de conformaciones en equilibrio
42:11y también, pues, depende mucho eh la
42:13conformación que van a tomar pues en qué
42:15condiciones eh o en qué medios o
42:17sistemas se encuentren.
42:19Ah, muchas técnicas analíticas
42:21proporcionan la información global
42:23también de estas de estas estructuras,
42:25lo que a a veces puede dificultar eh el
42:28detectar cambios locales en
42:30funcionalmente relevantes, no sé en qué
42:32posiciones, no te pueden dar idea de,
42:33"Ah, pues sí, aquí hay una esta proteína
42:35tiene hélices alfa, pero no te dice
42:37cuántas, ¿no?"
42:39Eh, las condiciones de medición, como
42:40decía, también pueden alterar la
42:42estructura, especialmente aquellas
42:44técnicas que requieren una preparación
42:46intensiva de la muestra y que la
42:47pudieran llegar a alterar.
42:50Entonces, ah, de nuevo hablamos de este
42:53enfoque ortogonal, donde pues se deben
42:56de se debe hacer este análisis con un
42:58enfoque eh multitécnica y
43:00complementario.
43:02Eh, una técnica que se utiliza para
43:05analizar la estructura secundaria de las
43:07proteínas es el dicroísmo circular.
43:10Esta es una técnica espectroscópica que
43:13se utiliza para eh evaluar el orden
43:16superior, de nuevo, la estructura
43:17secundaria en condiciones cercanas a su
43:19estado nativo, es decir, eh pues con que
43:21esté la proteína en solución, o sea, no
43:23necesita una preparación eh pues tan
43:26extensa.
43:27Ah, sin embargo, pues no ofrece una
43:29estructura tridimensional detallada,
43:33pero sí nos dice información clave sobre
43:34el contenido estructural y sobre la
43:36estabilidad.
43:38Entonces, el fundamento del dicroísmo
43:40circular se basa en la capacidad de las
43:43moléculas quirales, como lo son las
43:45proteínas, de absorber de manera
43:47diferencial la luz eh polarizada eh
43:51circularmente hacia la derecha o hacia
43:53la izquierda.
43:55Este fenómeno surge porque los
43:57cromóforos presentes en la proteína, que
43:59van a estar dados principalmente por los
44:01enlaces peptídicos y eh los residuos
44:03aromáticos, se se en un entorno
44:06asimétrico, lo que genera una respuesta
44:08óptica dependiendo de la conformación.
44:12Entonces, lo que se mide es la
44:13diferencia de absorbancia entre ambas
44:15polarizaciones,
44:17lo cual se expresa como un grado de
44:20elipticidad.
44:23Entonces, esta señal va a depender tanto
44:25de la composición química como de la
44:27organización espacial de la molécula.
44:29Entonces, pues al hablar de la
44:30organización espacial, pues nos va esto
44:32también se infiere como la estructura eh
44:35secundaria y en muchos casos pues
44:36también la terciaria.
44:39Entonces, eh
44:41en el análisis de proteínas con el eh
44:44dicroísmo circular se analizan dos
44:46regiones espectrales, generalmente en la
44:48región del ultravioleta lejano, que es
44:50va a estar entre los 190
44:53y los 250 nanómetros, que es lo que se
44:55ve aquí en el rango en la diapositiva,
44:58eh la cual va a provenir principalmente
45:00del enlace peptídico.
45:02Esta región es altamente sensible a la
45:04estructura a las estructuras eh
45:06secundarias, ¿no? Entonces, diferentes
45:08conformaciones
45:09van a generar eh espectros
45:11característicos, que es lo que se ve
45:13justamente eh en la diapositiva.
45:17Entonces, por ejemplo, las hélices alfa
45:19presentan eh mínimos de absorbancia
45:22entre 208 y 222 nanómetros,
45:26mientras que las láminas beta muestran
45:27una señal distinta, generalmente con un
45:29mínimo cercano a los 218 nanómetros.
45:33También las estructuras desordenadas
45:36presentan espectros más planos o con
45:37mínimos desplazados. Entonces, eh de
45:40hecho aquí en la diapositiva pues se ve
45:41cómo cómo se vería el un espectro
45:43característico de una proteína que tenga
45:45estas eh estas estructuras.
45:47Eh entonces, esto nos permite estimar el
45:50contenido relativo de la estructura
45:52secundaria y detectar cambios
45:53conformacionales inducidos por
45:55condiciones externas, o sea, si la
45:56proteína no está bien plegada, pues el
45:59va a haber cambios en en espectro que se
46:00obtiene.
46:02Si nos vamos a regiones eh más hacia eh
46:05el UV cercano, entre los 250 y 320
46:09nanómetros, la señal eh que se va a
46:11generar va a estar dada por eh residuos
46:14aromáticos como el triptófano,
46:17tirosina y fenilalanina y algunos
46:19puentes disulfuro.
46:21Eh esta región
46:22eh refleja el entorno tridimensional
46:24también de estos cromóforos, por lo que
46:26nos va a proporcionar también
46:28información aquí ya más sobre la
46:29estructura terciaria.
46:32Entonces, el el dicroísmo circular es
46:34una técnica pues bastante versátil.
46:37Se utiliza para confirmar comparar,
46:38perdón, la conformación de una proteína
46:40entre lotes,
46:42lo cual va a ser relevante eh para
46:44asegurar la consistencia de producción.
46:46Eh es fundamental en los estudios de
46:48estabilidad también, donde se evalúa el
46:51efecto pues de variables como la
46:52temperatura, el pH o la composición del
46:54buffer sobre la estructura.
46:56Entonces, también una ventaja pues es
46:58que nos permite evaluar la proteína en
46:59diferentes en diferentes estados. Eh
47:02además que eh
47:04pues el equipamiento que es o la
47:06infraestructura que se necesita pues no
47:08es tan compleja como la que se necesita,
47:09por ejemplo, para la espectrometría de
47:11masas.
47:12Eh también nos permite eh monitorear eh
47:16de manera inten- o sea, monitorear
47:18procesos de de desnaturalización que
47:20pueden ser intencionales o no.
47:23Eh
47:24también nos permite evaluar el
47:27desarrollo de las formulaciones, o sea,
47:28si un nos permite determinar si un
47:30excipiente
47:32puede eh estabiliza o desestabiliza más
47:35eh la molécula.
47:36Es una técnica rápida.
47:38Ah requiere relativamente poca cantidad
47:40de proteína.
47:42Eh permite estudiar proteínas en
47:44solución, en condiciones cercanas a las
47:47fisiológicas y tiene la capacidad para
47:48monitorear cambios estructurales en
47:50tiempo
47:51en tiempo real.
47:53Eh sin embargo, pues una las limitantes
47:55que tiene esta técnica es que
47:56proporciona información muy global
47:59eh
48:00lo que implica pues que los cambios
48:01locales pues en algunos casos puedan no
48:03ser eh detectados si no afectan signi-
48:06significativamente el contenido, o sea,
48:08la estructura eh de la proteína.
48:11Eh además eh pues los espectros a veces
48:14no nos permiten eh pues no no se puede
48:17estimar
48:18qué tanta qué en o sea, en qué
48:20proporción, o sea, cómo cuantificar en
48:22qué proporción han sido eh estos cambios
48:24en la estructura
48:26eh lo cual pues mete un poquito de eh de
48:29incertidumbre y aparte pues no te dice
48:31no te dicen dónde.
48:36Otra técnica que se puede utilizar para
48:38analizar la estructura las estructuras
48:40de orden superior de las proteínas es la
48:42espectroscopia de infrarrojo
48:45específicamente eh acoplada a la
48:47transformada de Fourier.
48:49Esta es una herramienta bastante robusta
48:52para análisis de la estructura
48:53secundaria de las proteínas y tiene una
48:56eh buena capacidad para analizar tanto
48:59muestras en solución como en el estado
49:01en el estado sólido, en el estado seco.
49:04El fundamento de esta técnica se basa en
49:07la absorción de la radiación infrarroja
49:09por parte de las moléculas
49:11lo que va a introducir transiciones
49:12vibracionales en los enlaces químicos.
49:15Cada tipo de enlace va a presentar
49:17frecuencias con una vibración
49:19característica, lo que permite obtener
49:21un espectro que funciona como una huella
49:24molecular. De hecho pues la técnica de
49:26eh infrarrojo pues se utiliza para eh
49:29elucidar la estructura pues de muchas
49:31moléculas pequeñas.
49:33Ah sin embargo, bueno, eh en proteínas
49:35pues los espectros que se obtienen son
49:37más complejos
49:39no se puede eh definir la estructura hm
49:42con tanto detalle eh como para como para
49:44una molécula pequeña pero también nos da
49:47información eh relevante, por ejemplo,
49:50eh del enlace peptídico
49:52eh
49:55y otros eh y otras órdenes de estructura
49:57superior como tenemos aquí eh bucles,
50:00hélices alfa, láminas beta, etcétera.
50:04Eh la señal más relevante de los
50:06espectros proviene de eh del enlace
50:08peptídico, particularmente las
50:11vibraciones asociadas al grupo amida,
50:13justamente del enlace peptídico.
50:15Estas vibraciones son sensibles a la
50:17estructura secundaria
50:19porque van a depender de la red de
50:20enlaces de hidrógeno que van a
50:22estabilizar eh la conformación.
50:24O sea, de todas las eh pues la nube
50:27electrónica que va a estar alrededor de
50:28cada de cada átomo, ¿no? De las eh de
50:31los residuos aledaños.
50:33Eh la región eh más importante del
50:36espectro hm del espectro de infrarrojo
50:39de una proteína es la denominada banda
50:42amida 1
50:43que se localiza entre los 1600 y los
50:451700 nanómetros.
50:48Eh
50:50y esta vibración se va a originar
50:51principalmente por la vibración de
50:53estiramiento del enlace eh
50:55carbono-oxígeno del grupo eh del grupo
50:58peptídico y es altamente sensible a la
51:00conformación de la proteína.
51:01Eh aquí, bueno, no se ve eh en este hm
51:05en el espectro que se muestra en la
51:06diapositiva no incluye este rango, pero
51:08pues ese sería uno de los eh de los
51:10rangos de longitud de onda que se
51:11analizan.
51:13Eh esta banda de la amida 1
51:17eh
51:18es una señal compuesta por diferentes
51:21elementos como las hélices alfa, las
51:23láminas beta y las regiones
51:24desordenadas.
51:26El análisis de esta de esta banda pues
51:29requiere técnicas de procesamiento como
51:30de convolución o derivadas de segundo
51:32orden que van a permitir separar las
51:34contribuciones individuales y estimar el
51:36contenido relativo de cada estructura
51:38secundaria, de aquí la importancia de
51:40utilizar la transformada de Fourier para
51:42hacer el análisis.
51:44Eh
51:46este este tipo de análisis eh son útiles
51:49para detectar, de manera similar al
51:50dicroísmo circular, cambios circulares
51:53inducidos eh por condiciones de estrés,
51:55eh incluso cuando estos cambios no son
51:58evidentes mediante otras, mediante otras
52:00técnicas. Entonces, pues sería una
52:01técnica
52:03eh complementaria, ¿no?
52:05Eh la espectroscopia de infrarrojo es
52:08utilizada también, pues, en las eh en
52:10los estudios de formulación para evaluar
52:12los efectos de los excipientes,
52:14también, por ejemplo, durante la
52:16liofilización, nos permite monitorear
52:18cambios estructurales eh en cada etapa,
52:21en la etapa de congelación, el secado
52:23primario y el secado secundario.
52:26Eh y en estudios de estabilidad, pues,
52:28nos puede ayudar a detectar cambios en
52:30la estructura asociados con agregación o
52:32degradación.
52:36Eh la limitante
52:39pues, está en la interpretación. Eh la
52:42interpretación de la banda amida 1 puede
52:43ser compleja y de pende de modelos
52:45matemáticos, pues, lo cual, pues,
52:47también al el hecho de que dependa
52:50eh de ciertos modelados, eh pues,
52:52también nos da cierto grado de
52:54incertidumbre.
52:56Eh
52:58Esto, por ejemplo, ah también mezclado
53:01cuando hablamos de un análisis de
53:02muestras en el en solución, pues, eh la
53:06interferencia del agua también es un
53:08desafío importante durante el análisis.
53:12Ah además, la espectroscopia de
53:14infrarrojo proporciona información sobre
53:16la estructura, principalmente sobre la
53:17estructura secundaria, pero no ofrece
53:19detalles sobre la estructura terciaria
53:21eh o cuaternaria. Entonces, aquí yo creo
53:23que podríamos decir
53:24eh
53:26que la
53:28eh espectroscopia de infrarrojo, junto
53:30con el dicroísmo circular, yo creo que
53:32se complementan bastante bien. Y voy a
53:34hacer aquí una corrección. Eh estoy
53:36viendo ahí en la diapositiva le
53:37Justamente sí, lo que estamos viendo es
53:40estas estos patrones diferenciales de la
53:42banda amida uno, está en el rango, no
53:44nada más que lo estaba leyendo al revés,
53:46una disculpa.
53:50Otra técnica que se utiliza para
53:52analizar las estructuras de estructuras
53:54de orden superior de las proteínas es la
53:56espectroscopia Raman, de hecho en los
53:58últimos años ha tenido eh un boom, un un
54:00auge bastante eh importante como una
54:03técnica analítica.
54:05Eh la espectroscopia Raman es una
54:06técnica vibracional
54:08que eh de manera similar que la
54:11espectroscopia de infrarrojo nos va a a
54:14proporcionar información sobre la
54:16molécula a partir de las vibraciones de
54:18sus enlaces químicos.
54:20Eh sin embargo, a diferencia de
54:24pues de las de la espectroscopia
54:26infrarroja, pues el fundamento de la
54:28técnica Raman eh es distinto.
54:31Eh
54:33Decíamos que la espectroscopia
54:34infrarroja se basa en la absorción de la
54:36radiación
54:38eh
54:39y que se observa por, o sea, por estas
54:41vibraciones, pero tiene que ver con la
54:42absorción de luz. La espectroscopia
54:45Raman se fundamenta en la dispersión
54:47inelástica de la luz.
54:49Eh es decir,
54:52cuando un as monocromático, generalmente
54:54un láser,
54:56incide sobre una muestra, la mayor parte
54:58de la luz se va a dispersar sin cambio
55:00de energía.
55:01A este eh a esta dispersión
55:04se le llama eh dispersión de Rayleigh.
55:07Sin embargo, una pequeña fracción va a
55:09interactuar con las vibraciones
55:10moleculares produciendo un cambio
55:14en la energía del fotón incidente.
55:18Este fenómeno va a generar señales
55:20desplazadas en frecuencia conocidas como
55:22los desplazamientos Raman
55:24y eh pues van a ser específicas estas
55:27vibraciones dependiendo eh pues de lo
55:29que se esté
55:30las moléculas o los enlaces que estén
55:33presentes, por ejemplo, los enlaces
55:35eh
55:37vibracionales de una proteína.
55:39Eh, del enlace peptídico, eh,
55:42vibraciones de las cadenas laterales,
55:44interacciones intramoleculares.
55:46Entonces, sí podríamos hablar de que nos
55:47está dando un poquito eh, más de nivel
55:51de la con respecto a la espectroscopia
55:53eh, infrarrojo.
55:55Entonces, la espectroscopia Raman nos va
55:57a dar información sobre la estructura
55:59secundaria, particularmente en la región
56:00de la amida 1, pero también en la región
56:04de la amida 3, que esa está entre los
56:071200 y 1300 nanómetros.
56:10Ah, sin embargo, bueno, una de sus
56:12fortalezas es que también permite
56:13obtener eh, información sobre el entorno
56:16de residuos aromáticos, como tirosina,
56:18triptófano, fenilalanina. También
56:21evaluar el estado de puentes disulfuro,
56:24interacciones proteína-ligando y cambios
56:26en la estructura terciaria. Entonces,
56:27como eh, sí tiene un, pues, más alcances
56:30que la espectroscopia eh, infrarrojo.
56:33Am, también decíamos que infrarrojo,
56:35pues, tiene la limitante eh, que las
56:37proteínas en solución, pues, el agua,
56:39pues, también genera eh, una absorción
56:41eh, interferencia en los espectros. Eh,
56:44en Raman, pues, la señal del agua, pues,
56:47es mucho más débil, entonces, eh, bueno,
56:50nos nos da una señal mucho más fina eh,
56:53cuando hablamos del análisis de
56:54proteínas en sistemas eh, acuosos o en
56:57solución.
56:59Ah, entonces, esto nos permite analizar
57:01proteínas sin necesidad de modificar
57:03tanto eh, el medio en el que están
57:05dispersas.
57:06También estudiar condiciones cercanas a
57:08las fisiológicas y monitorear eh,
57:10cambios en tiempo real.
57:13Ah, de manera similar a la
57:15espectroscopia de infrarrojo y el
57:16dicroísmo circular, eh, la
57:18espectroscopia Raman nos permite eh,
57:21aplicarse eh, para la la evaluación de
57:24formulaciones, para ver cómo los
57:26excipientes eh, afectan la estructura de
57:28una proteína.
57:29Eh, por ende, pues, también se utilizan
57:32eh en esto en estudios de estabilidad.
57:35Eh,
57:37pues sí.
57:38Ah, también nos permite
57:41hm obtener información relacionada eh o
57:45por ejemplo con procesos de agregación.
57:49Eh, se ha visto que la formación de
57:50agregados suele estar acompañada por un
57:53aumento en el contenido de eh
57:55estructuras de tipo lámina beta, lo cual
57:57pues se refleja
57:58caen cambios en la banda en las bandas
58:01amida.
58:02Además, la exposición de regiones
58:04hidrofóbicas en cambios en el entorno de
58:06residuos aromáticos puede detectarse
58:09mediante vibraciones en bandas en bandas
58:12características.
58:14Eh, la limitante que tiene esta técnica
58:16es que la intensidad de la señal es
58:19inherentemente baja,
58:21ya que la dispersión de Raman es un
58:22fenómeno eh poco eficiente.
58:25Por ende, eh los tiempos de adquisición
58:27de o de las muestras, o sea, son eh eh
58:30pues son más grandes, o sea, es una
58:31técnica más tardada o requiere
58:33concentraciones muy altas de la de la
58:35proteína. Que bueno, esto tal vez para
58:37la industria farmacéutica no sea hm tan
58:40limitante y luego a veces en
58:42investigación eh sí puede resultar
58:45hm más difícil eh obtener una eh la una
58:48proteína purificable en una
58:49concentración eh suficiente para poder
58:52analizarlo con este con esta técnica.
58:55Hm, también ah puede haber ruido causado
58:59por fluorescencia de fondo,
59:02especialmente en proteínas con
59:05formulaciones con componentes
59:06fluorescentes. Aquí tal vez pues para eh
59:10pues para biofarmacéuticos no sea tan
59:12trascendental.
59:13Eh, por otro lado, otra limitante es que
59:16la interpretación de los espectros puede
59:17ser compleja y eh sin embargo, o sea, a
59:21pesar de que es una técnica versátil,
59:22pues no alcanza el nivel de resolución
59:24para el análisis de la estructura como
59:26lo pudiera alcanzar eh la resonancia
59:29magnética o la cristalografía.
59:35La eh resonancia magnética nuclear nos
59:38permite em obtener información detallada
59:42sobre la estructura tridimensional de
59:44una proteína, a diferencia de otras
59:47técnicas como eh infrarrojo, la
59:49espectroscopia Raman, que solo dan
59:51información pues más global eh o podemos
59:54decir incluso semicuantitativa.
59:56Ah la resonancia magnética nuclear
59:58ofrece una visión detallada de la
1:00:00organización molecular y del
1:00:01comportamiento dinámico
1:00:04de una proteína en solución.
1:00:07Esta eh se basa
1:00:10en el comportamiento de ciertos núcleos
1:00:13atómicos eh principalmente eh del
1:00:16hidrógeno, del carbono y del nitrógeno,
1:00:20que poseen eh un spin nuclear.
1:00:22Cuando estos núcleos se colocan en un
1:00:24campo electromagnético externo, es
1:00:26decir, o sea, se exponen a eh a imanes
1:00:29bastante potentes, sus ni sus niveles de
1:00:32energía se separan y pueden absorber la
1:00:34radiación electromagnética a frecuencias
1:00:37específicas para eh transitar entre
1:00:40entre estos niveles.
1:00:43La frecuencia a la que ocurre esta
1:00:44absorción va a depender del entorno
1:00:46químico eh del núcleo de de de cada
1:00:50átomo, lo cual eh da lugar al concepto
1:00:54de desplazamiento químico,
1:00:56que es extremadamente sensible al tipo
1:00:58de enlace químico, entorno electrónico,
1:01:02interacciones intermoleculares y la
1:01:04conformación eh tridimensional, es
1:01:06decir, eh la vibración o el
1:01:10comportamiento del spin cuando se hacen
1:01:13vibrar eh con un, o sea, con una fuerza
1:01:16electromagnética, pues va a variar
1:01:18dependiendo pues de la estructura
1:01:19tridimensional.
1:01:21Eh en proteínas, cada átomo genera
1:01:25una señal específica,
1:01:27lo que permite construir un mapa
1:01:29detallado eh de la molécula.
1:01:32Este desplazamiento químico permite
1:01:34utilizar a la resonancia magnética
1:01:35nuclear como una herramienta muy
1:01:37sensible para detectar cambios
1:01:39conformacionales sutiles,
1:01:41así como eh interacciones
1:01:43proteína-ligando,
1:01:45efectos de las modificaciones
1:01:46postraduccionales y alteraciones
1:01:48inducidas eh por la formulación.
1:01:51Am,
1:01:53además, a través de diferentes eh
1:01:56tipos de experimentos o conforma o
1:01:58configuraciones de la resonancia
1:01:59magnética nuclear, es posible también
1:02:02evaluar eh la flexibilidad en regiones
1:02:04específicas, los movimientos
1:02:06conformacionales en diferentes eh
1:02:08escalas de tiempo e intercambios entre
1:02:10estados estructurales.
1:02:12Ah, o sea, al final ah la resonancia
1:02:15magnética
1:02:17pues nos permite eh obviamente después
1:02:19de un análisis
1:02:21de los espectros bastante eh bastante
1:02:23complejo, un un análisis computacional
1:02:26exhaustivo,
1:02:27eh podemos obtener información sobre eh
1:02:30la estructura tridimensional de una
1:02:31proteína, algo que pues no eh pues no se
1:02:34logra con las técnicas que habíamos
1:02:35visto previamente.
1:02:37Am,
1:02:39ah la resonancia magnética eh sin
1:02:42embargo no es una hm técnica que se
1:02:45puede utilizar como para el monitoreo eh
1:02:48en un proceso rutinario.
1:02:50Eh, es más bien ah una técnica que se
1:02:54utilizaría en en etapas eh de
1:02:57investigación y desarrollo y de
1:02:58caracterización avanzada.
1:03:01Eh, en estudios de biocom de
1:03:03biocomparabilidad o cuando queremos
1:03:05cuando se quiere obtener el registro
1:03:06sanitario de un medicamento eh
1:03:09biotecnológico biocomparable, pues se
1:03:11puede utilizar para demostrar eh
1:03:13similitud entre el producto de
1:03:16referencia contra el producto que se
1:03:18quiere aprobar.
1:03:19Es decir, eh, esta es una técnica que se
1:03:21utiliza más para la parte de
1:03:22investigación y de aprobación, no tanto
1:03:25eh, como una forma eh, de monitoreo
1:03:27rutinario durante la producción.
1:03:30Am, también nos es útil para estudiar
1:03:32interacciones proteína ligando, lo cual
1:03:35también puede ser relevante para la
1:03:36caracterización eh, de anticuerpos o
1:03:39proteínas con la actividad o alguna
1:03:40afinidad específica.
1:03:43Am,
1:03:45aquí, ah, pues algunas de las limitantes
1:03:47que presenta la resonancia magnética eh,
1:03:49nuclear es la, pues la complejidad
1:03:51instrumental. Am,
1:03:54incluso me atrevería a decir eh, que es
1:03:56más complejo que la espectrometría de
1:03:58masas.
1:03:59Eh, los equipos también son muy
1:04:01costosos.
1:04:03También de nuevo no hay muchos
1:04:04laboratorios
1:04:05eh, pues que utilizan este tipo de, este
1:04:08tipo de equipos. Am, además otra
1:04:11limitante es la necesidad de trabajar
1:04:15con altas concentraciones de muestra, lo
1:04:17cual puede ser ser difícil en ciertas
1:04:19etapas del desarrollo, del desarrollo
1:04:21tecnológico de un biofarmacéutico.
1:04:24Además eh, el análisis de proteínas
1:04:26grandes es más desafiante debido a la
1:04:29superposición de señales y a la rápida
1:04:31relajación de los eh, de los núcleos eh,
1:04:34y también pues yo agregaría
1:04:36am,
1:04:37pues la importancia eh, pues de la
1:04:40capacitación eh, humana para manejar e
1:04:43interpretar este tipo de datos.
1:04:46Pero pues es una técnica eh, bastante
1:04:48bastante noble, si la proteína no es muy
1:04:50grande y la podemos obtener en muy buena
1:04:52cantidad, eh, pues yo creo que se puede
1:04:54eh,
1:04:55pues mandar a analizar por resonancia y
1:04:58obtener una información bastante
1:04:59detallada sobre eh, sobre la estructura
1:05:02tridimensional. Eh, sin embargo yo creo
1:05:04que para el análisis de proteínas, ah,
1:05:06para determinar la estructura
1:05:08tridimensional con muy buena precisión,
1:05:10la que más se utiliza es la
1:05:12cristalografía eh acoplada con rayos X.
1:05:17La cristalografía de rayos X es la
1:05:19técnica de referencia para determinar la
1:05:21estructura tridimensional de proteínas
1:05:23con una eh resolución eh atómica
1:05:26bastante bastante buena y no solamente
1:05:29se utiliza para el análisis de
1:05:30proteínas, sino también eh para otro
1:05:32tipo de de biomoléculas, pues ya sabemos
1:05:35eh que por ejemplo la estructura de la
1:05:36doble hélice del ADN pues se pudo eh
1:05:39determinar justamente con eh con
1:05:42cristalografía de rayos X.
1:05:44Esta técnica eh permite visualizar la
1:05:47posición espacial de los átomos dentro
1:05:49de una proteína,
1:05:50lo que lo convierte en una herramienta
1:05:52fundamental para comprender la relación
1:05:54entre estructura y función, o sea, de
1:05:57hecho también eh nos permite hm en el
1:06:00caso de que sea posible cristalizar una
1:06:02proteína en condiciones, por ejemplo,
1:06:04interaccionando con algún ligando o con
1:06:06algún cofactor, pues se puede también eh
1:06:09tener obtener
1:06:11pues esta fotografía con gran detalle eh
1:06:13de cómo se llevan a cabo estas
1:06:14interacciones.
1:06:17Y bueno, el fundamento de esta técnica
1:06:18se basa en la interacción de los arro de
1:06:21los rayos X con una nube con la nube
1:06:24electrónica eh de los átomos eh que
1:06:26están ordenados en un cristal.
1:06:29Cuando un haz de rayos X incide sobre un
1:06:31cristal de proteína, los electrones se
1:06:33van a van a dispersar la radiación en
1:06:36diferentes direcciones.
1:06:38Obviamente esta eh
1:06:40esta dispersión va a estar determinada
1:06:44por el arreglo periódico del cristal.
1:06:48Estas ondas dispersadas van a interferir
1:06:50entre sí generando un patrón de
1:06:51difracción característico que es el que
1:06:53se ve aquí en la imagen del lado
1:06:55derecho, eso que se ven como rayitas y
1:06:58puntos.
1:06:59La posición e intensidad entre los
1:07:01puntos de difracción van a contener
1:07:03información sobre la distribución
1:07:04electrónica en el cristal.
1:07:07Ah, mediante transformadas matemáticas y
1:07:10un análisis eh pues bioinformático
1:07:12bastante eh exhaustivo, es posible
1:07:14reconstruir un mapa de densidad de
1:07:16electrónica, a partir de la cual se
1:07:18puede modelar la estructura
1:07:20tridimensional de una proteína pues con
1:07:23bastante bastante exactitud eh en el
1:07:26orden pues de
1:07:27de angstroms de de medición.
1:07:30Am,
1:07:31aquí por ejemplo eh en el Protein Data
1:07:33Bank,
1:07:35pues es donde suelen cargarse eh las
1:07:37estructuras eh obtenidas a partir de
1:07:39patrones de difracción de de rayos X
1:07:42pues de muchas de muchas proteínas,
1:07:44incluidos pues también biofarmacéuticos.
1:07:47Ah, aquí bueno obviamente el punto más
1:07:49importante para la cristalografía de
1:07:51rayos X pues es la obtención de los
1:07:53cristales de proteína y que sean
1:07:54cristales eh de alta calidad. Yo también
1:07:57en el video anterior que hablábamos de
1:08:00que veíamos a la cristalización de
1:08:01proteínas como una técnica eh de
1:08:03separación y de purificación,
1:08:05eh pues una vez que se obtiene el
1:08:07cristal, pues este es si es lo
1:08:08suficientemente bueno, em,
1:08:11se puede analizar por eh por difracción
1:08:15de rayos X.
1:08:16Am,
1:08:17entonces pues para formular un cristal
1:08:19decíamos que las moléculas de proteína
1:08:21deben de organizarse en una red
1:08:23tridimensional ordenada y repetitiva, a
1:08:25diferencia pues de un
1:08:27proceso eh de agregación o de
1:08:29precipitación.
1:08:31Eh y esta y este arreglo ordenado para
1:08:34formar el cristal requiere de
1:08:35condiciones fisicoquímicas muy
1:08:37específicas y particulares para cada
1:08:39proteína. De ahí que decíamos que pues
1:08:42no todas las proteínas cristalizan en
1:08:43las mismas condiciones y no todas las
1:08:45proteínas eh son cristalizables.
1:08:48En general podemos decir que la el
1:08:50proceso de cristalización es un proceso
1:08:52pues altamente empírico,
1:08:54de falla, prueba y error,
1:08:56eh y puede requerir eh un screening de
1:08:59cientos o de miles de condiciones,
1:09:01eh lo cual pues dificulta el análisis.
1:09:04Ah, muchas proteínas, especialmente eh,
1:09:07las que son muy grandes o altamente
1:09:09flexibles, son difíciles eh, de
1:09:11cristalizar.
1:09:13Sin embargo, eh, una vez que se obtiene
1:09:14el cristal,
1:09:16eh, y se obtiene un eh, un cristal de
1:09:18buena calidad, pues este ya se puede eh,
1:09:20analizar
1:09:22eh, cuando se expone una red de rayos X,
1:09:24un haz de rayos X en un difractómetro.
1:09:27El patrón de di, el patrón de difracción
1:09:29generado se va a registrar me, mediante
1:09:32detectores, que serían así como como
1:09:33viene aquí, como am, como láminas
1:09:35fotográficas,
1:09:37eh, y se generan estos patrones de
1:09:39difracción que se ven como puntitos,
1:09:40¿no?
1:09:41Eh, estos datos se procesan eh, para
1:09:43obtener intensidades y posiciones eh, de
1:09:46los reflejos.
1:09:47A partir de ahí se calcula un mapa de
1:09:49densidad electrónica, decíamos con
1:09:51bastante eh, con bastante precisión.
1:09:54Am, esta técnica eh, pues proporciona
1:09:58información estructural con muy buena
1:09:59resolución, en decíamos en el rango de
1:10:01Armstrong,
1:10:02para identificar la posición de átomos
1:10:04individuales, la geometría de los
1:10:07enlaces, eh, inter, dis, discernir entre
1:10:10eh, enlaces eh, covalentes de no
1:10:12covalentes, interacciones
1:10:13intermoleculares,
1:10:15sitios de unión a ligandos, organización
1:10:17de dominios, muchas otras, o sea, es la
1:10:19técnica eh, más fini, más fina con la
1:10:22que contamos en el momento para eh,
1:10:24establecer la estructura tridimensional
1:10:27de una proteína.
1:10:28Eh, esto en biofarmacéuticos es
1:10:30relevante pues para entender, por
1:10:31ejemplo, los mecanismos de acción, eh,
1:10:33interacciones con receptores, sitios de
1:10:35reconocimiento, por ejemplo, para los
1:10:38eh, para los anticuerpos o decíamos
1:10:40interacción con eh, con cofactores en un
1:10:42enzima o ir monitoreando cómo es em,
1:10:46que un enzima va transformando a su
1:10:48sustrato y lo va convirtiendo en el
1:10:49producto final, ¿no?
1:10:52Am, obviamente la cristalografía, igual
1:10:54que la resonancia magnética, pues no son
1:10:56técnicas de rutina.
1:10:58Eh, esas se utilizan más en etapas eh de
1:11:02investigación y desarrollo.
1:11:04Am,
1:11:06y bueno, ah, la principal limitación es
1:11:09que pues la estructura obtenida
1:11:11corresponde a al orden cristalino de la
1:11:14molécula,
1:11:15eh, lo cual pues puede ser algo
1:11:17diferente al estado en solución.
1:11:20Eh, además no proporciona información
1:11:22sobre heterogeneidad estructural, ya que
1:11:24el cristal eh representa una
1:11:25conformación promedio y hasta podemos
1:11:27decir es un punto en el que
1:11:30pues una, o sea, es es la foto en la que
1:11:32una proteína pues se quedó quieta,
1:11:34podemos decirlo así, ¿no?
1:11:36Am, otra limitación pues es la
1:11:39dificultad para analizar eh, obviamente
1:11:41se para obtener los los cristales y
1:11:43también para analizarlos, ¿no? Proteínas
1:11:45muy grandes y flexibles o altamente
1:11:47glicosiladas pueden ser difíciles de
1:11:49analizar.
1:11:51Ah, además pues el proceso es altamente
1:11:54laborioso, también es bastante costoso y
1:11:57pues como decíamos no es adecuado para
1:11:59análisis eh rutinarios, pero si queremos
1:12:02ah confirmar la estructura
1:12:04tridimensional de eh de nuestro producto
1:12:06y en conjunto con toda la información,
1:12:08eh, o por ejemplo de con información con
1:12:10técnicas más rutinarias obtenemos cierto
1:12:13patrón y ese patrón está asociado con
1:12:15estas con esta hm con este cristal y con
1:12:19esta estructura, pues ya podemos hacer
1:12:21una inferencia y conectar todos los
1:12:22puntos, ¿no?
1:12:24Eh, para por ejemplo am,
1:12:27ya un análisis más rutinario, ¿no?
1:12:28Entonces, si nosotros en el análisis
1:12:30rutinario
1:12:31con técnicas menos am,
1:12:34de menor resolución vemos cambios, pues
1:12:37también podemos inferir cambios en la
1:12:39cambios en la estructura, ¿no?
1:12:44Otro eh,
1:12:46nivel o otro ah criterio de análisis que
1:12:50debemos de tomar en cuenta eh al momento
1:12:52de caracterizar eh un fármaco, un
1:12:55biofarmacéutico, una proteína
1:12:57terapéutica es la eh estabilidad y el
1:13:00grado de agregación.
1:13:01Si bien ya hemos mencionado que algunas
1:13:03eh de las técnicas am
1:13:07que vimos anteriormente eh se pueden
1:13:09utilizar también para evaluar justamente
1:13:11la estabilidad de una proteína
1:13:14terapéutica, pues también existen otras
1:13:16que nos permiten complementar esta
1:13:18información y que van a estar eh
1:13:20centradas en evaluar
1:13:21eh en la agregación o la
1:13:23desnaturalización de eh del producto.
1:13:26Ya sabemos que una un biofarmacéutico,
1:13:28una proteína terapéutica como un
1:13:30principio activo de un medicamento debe
1:13:32de mantener su estructura, pureza y
1:13:34actividad durante todo el ciclo de vida
1:13:36del producto, que esto va a abarcar las
1:13:38etapas pues de la producción, la
1:13:41purificación, su procesamiento upstream
1:13:43y downstream, pero también durante el
1:13:45almacenamiento,
1:13:48eh transporte y administración.
1:13:51Entonces, ya hemos mencionado muchas
1:13:53veces a lo largo de este curso que la
1:13:55agregación pues es uno de los
1:13:57principales eh desafíos técnicos que
1:13:59puede presentar un medicamento
1:14:01biotecnológico, ya que afecta tanto a la
1:14:04calidad del producto y eh está asociado
1:14:08con eh la seguridad, ¿no? Con el
1:14:10compromiso eh con alteraciones, cambios
1:14:13en la seguridad, principalmente por las
1:14:15reacciones de inmunogenicidad.
1:14:17Ah entonces vamos a ver algunas de las
1:14:19técnicas que nos pueden ayudar a evaluar
1:14:21estos estados am de agregación de una
1:14:24proteína.
1:14:26Aquí eh una técnica que eh también vamos
1:14:29a hablar pues es la espectroscopia de
1:14:30fluorescencia.
1:14:32Esta se basa en la capacidad de ciertas
1:14:34moléculas de absorber la longitud de
1:14:36onda eh una longitud de onda específica
1:14:40eh y emitir una longitud eh emitir luz a
1:14:43una longitud de luz de de una
1:14:47de onda mayor.
1:14:49Ah, esto pues se conoce como
1:14:51fluorescencia, ¿no? O sea, donde hay una
1:14:53eh una excitación y una absorción en una
1:14:55longitud de onda diferente.
1:14:58Ah, esto pues va a estar eh establecido
1:15:01por eh cromóforos fluorescentes que eh
1:15:04casualmente eh pues en las proteínas
1:15:06suelen ser,
1:15:08o sea, los aminoácidos aromáticos suelen
1:15:10tener esta propiedad eh de
1:15:12fluorescencia, que tenemos el
1:15:15triptófano, la tirosina y la
1:15:17fenilalanina.
1:15:19Entonces, cuando un residuo aromático
1:15:21absorbe luz,
1:15:23eh entra en un estado excitado y
1:15:25posteriormente va a regresar al estado
1:15:27basal emitiendo luz. Eh generalmente eh
1:15:31la excitación ocurre alrededor de los
1:15:32280 nanómetros y la emisión entre 300 o
1:15:36350 nanómetros, ya en el rango eh pues
1:15:39casi visible, sí, visible, ¿no?
1:15:41Ah, la posición e intensidad de la
1:15:43emisión o va a obviamente te van a
1:15:45depender fuertemente del entorno local
1:15:48eh del residuo, ¿no?
1:15:50Am,
1:15:51cuando el triptófano, por ejemplo, eh
1:15:53por de por decir que es el eh el
1:15:56aminoácido más fluorescente,
1:15:59cuando este triptófano está enterrado en
1:16:02un núcleo hidrofóbico de una proteína,
1:16:04su emisión ocurre a longitudes de onda
1:16:06más cortas, eh donde se puede ver que
1:16:09hay un desplazamiento bases más hacia la
1:16:11longitud de onda del azul y ocurren con
1:16:13mayor intensidad.
1:16:15Eh sin embargo, cuando
1:16:18eh
1:16:19un triptófano está expuesto al solvente
1:16:22o a un ambiente más polar,
1:16:24la emisión se desplaza hacia longitud de
1:16:26ondas mayores, más hacia hacia el rojo.
1:16:29Y puede también disminuir en intensidad.
1:16:31Entonces, estos cambios eh en el patrón
1:16:35de fluorescencia
1:16:36eh nos permiten utilizar esta técnica
1:16:38como un sensor del estado de plegamiento
1:16:40de una proteína.
1:16:42Ah, eh para evaluar el estado de
1:16:44plegamiento, la exposición de regiones
1:16:46hidrofóbicas y cambios conformacionales.
1:16:49Eh y bueno, también vale la pena eh
1:16:51mencionar que la técnica de
1:16:53fluorescencia, pues también se puede
1:16:54utilizar, pues para evaluar eh pues
1:16:56órdenes órdenes de estructura, no nada
1:16:59más eh estabilidad y agregación de una
1:17:01proteína.
1:17:03Sin embargo, eh la fluorescencia, pues
1:17:05se puede utilizar en los estudios de
1:17:07estabilidad, ya que permite detectar
1:17:09cambios tempranos en la estructura que
1:17:11preceden a la agregación, anticiparnos a
1:17:13a predecir estos procesos.
1:17:15Ah, esto es útil porque muchos cambios
1:17:18pueden no ser detectados por eh otras
1:17:21técnicas como exclusión molecular o eh
1:17:24dispersión dinámica de luz en etapas
1:17:26iniciales. Entonces, eh aquí podemos ver
1:17:28como una transición, o sea, en etapas ah
1:17:31como para un análisis estructural, así
1:17:34como eh pues para un estudio de una
1:17:37preagregación.
1:17:39Eh ventajas que tiene esta técnica es
1:17:42que la espectroscopia de fluorescencia
1:17:44es altamente sensible, lo que permite
1:17:46trabajar con concentraciones muy bajas
1:17:47de proteína,
1:17:49es rápida, relativamente sencilla, o
1:17:51sea, no requiere una preparación
1:17:52compleja de la muestra eh ni un análisis
1:17:55tan extenso como eh otras técnicas que
1:17:57ya hemos mencionado.
1:17:59Ah, además puede proporcionar
1:18:01información local,
1:18:03eh lo que la convierte en un complemento
1:18:05ideal para técnicas más globales.
1:18:07Aunque bueno, esto va a depender en pues
1:18:09del perfil de aminoácidos aromáticos que
1:18:11tenga una proteína.
1:18:14Ah, otra ventaja es que esta técnica
1:18:16tiene la capacidad de monitorear cambios
1:18:18en tiempo real,
1:18:19eh lo cual permite estudiar eh procesos
1:18:22dinámicos, por ejemplo, cambios en
1:18:24temperatura eh entre otros, ¿no?
1:18:27Ah, la limitante que tiene esta técnica
1:18:29es que pues la señal, obviamente, va a
1:18:31depender de la presencia y localización
1:18:33de los residuos aromáticos. Si una
1:18:35proteína no tiene residuos aromáticos,
1:18:37pues no va a ser eh apta para su
1:18:39análisis en fluorescencia.
1:18:41O si estos ah residuos aromáticos no
1:18:44están en regiones relevantes que puedan
1:18:46verse eh o sea, que estuvieran expuestos
1:18:48o no,
1:18:49pues la información eh pues va que
1:18:51podemos obtener va a ser eh limitada.
1:18:55Ah.
1:18:57También eh puede haber interferencia o
1:18:59lo que le llaman apago fenómenos de
1:19:01apagamiento, o sea, de que se eh
1:19:03disminuya la la señal por interacción
1:19:05con otras moléculas o por cambios en el
1:19:07entorno. Entonces, bueno, esto
1:19:10pues es una es una situación que pasa eh
1:19:12que también hay que tomar en cuenta a la
1:19:14hora de hacer eh el análisis o de que si
1:19:15estamos viendo un cambio,
1:19:17eh pues a qué se debe, ¿no?
1:19:19Ah, además, la interpretación de los
1:19:21datos puede no necesariamente ser
1:19:23directa, ya que pues mucho múltiples
1:19:25factores pueden influir en cambios en la
1:19:27señal.
1:19:29Además, no proporciona información
1:19:31estructural detallada ni localización
1:19:33precisa de los cambios dentro de una
1:19:35secuencia, o sea, ah
1:19:37no te va a dar esa eh esa pauta como lo
1:19:40hace con mucho más detalle la resonancia
1:19:42magnética nuclear o la o la
1:19:44cristalografía, pero pues para estudios
1:19:46de rutina, yo creo que pues es bastante
1:19:48bastante factible y más porque no es una
1:19:51no es una técnica eh destructiva y el
1:19:53equipo que eh los equipos que se
1:19:56utilizan y su análisis pues no son tan
1:19:57complejos.
1:20:01Y bueno, la calorimetría es otra técnica
1:20:03que se puede utilizar para evaluar la
1:20:04estabilidad de una proteína.
1:20:06Esta es una técnica termoanalí-
1:20:08analítica, como su nombre lo dice, que
1:20:10permite evaluar eh la estabilidad
1:20:12conformacional de proteínas mediante la
1:20:15medición de los cambios de energía
1:20:17asociados a su desnaturalización.
1:20:20Ah, la calorimetría la calorimetría
1:20:22cuantifica de forma directa la energía
1:20:24necesaria para desestabilizar la
1:20:26proteína.
1:20:27Es decir, nos dice eh pues con estudios
1:20:31calorimétricos, o sea, utilizando
1:20:33termodinámica, qué tan eh estable o
1:20:35inestable o qué tan propensa a la a la
1:20:37desnaturalización es una proteína.
1:20:40Ah,
1:20:42esta mide la diferencia en el flujo de
1:20:44calor entre una celda que contiene la
1:20:46muestra y una celda de referencia,
1:20:48usualmente eh la celda de referencia
1:20:50suele ser el buffer,
1:20:52mientras ambas se someten a un
1:20:54incremento controlado de temperatura.
1:20:57Eh cuando una proteína está en su estado
1:20:59nativo, la absorción de calor es
1:21:01relativamente uniforme.
1:21:03Sin embargo, al alcanzar una temperatura
1:21:05crítica donde ella se empieza a
1:21:07desnaturalizar,
1:21:08eh hay una eh ruptura de interacciones
1:21:12eh intermoleculares eh como los puentes
1:21:15de hidrógeno, interacciones hidrofóbicas
1:21:17y fuerzas electrostáticas,
1:21:19eh lo cual pues es un proceso eh
1:21:21endotérmico,
1:21:23por lo que se observa un eh un pico en
1:21:26el termograma.
1:21:28Eh al final, la forma y posición de los
1:21:30picos que se obtienen contiene
1:21:31información clave sobre eh la
1:21:34estabilidad eh de la proteína.
1:21:37Ah, entonces lo que se obtiene eh son eh
1:21:41termogramas,
1:21:43eh donde se extraen varios parámetros
1:21:46críticos, uno de ellos es la eh la TM o
1:21:49la temperatura de transición,
1:21:51eh que esta corresponde al punto donde
1:21:54la mitad de la población de la proteína
1:21:55está desnaturalizada,
1:21:58eh la entalpía de desnaturalización
1:22:02también es otro eh otro parámetro eh que
1:22:05se puede calcular, que es el delta H,
1:22:08eh refleja la cantidad de energía
1:22:10necesaria para desplegar eh desplegar la
1:22:12proteína. Entonces, una en entalpía alta
1:22:15sugiere una estructura altamente
1:22:17organizada y estable, eh mientras que
1:22:19una entalpía baja pues sugiere una
1:22:22proteína muy propensa a la
1:22:24desnaturalización.
1:22:26Otro parámetro importante al momento de
1:22:29analizar los termogramas es la forma de
1:22:31los picos.
1:22:32Ah, transiciones o picos muy estrechos
1:22:35indican procesos cooperativos bien
1:22:37definidos, mientras que picos anchos o
1:22:39múltiples pueden reflejar presencia de
1:22:41dominios estructurales independientes o
1:22:44heterogeneidad en la muestra.
1:22:46Ah, al final eh podemos decir que la
1:22:49desnaturalización eh
1:22:52es ah obviamente desnaturalización por
1:22:54temperatura es frecuentemente eh el
1:22:57primer paso hacia la agregación, por lo
1:22:59cual eh pues es importante ah evaluarlo,
1:23:02¿no? Si una proteína pues es eh
1:23:04termodinámicamente ah estable va a ser
1:23:06más difícil eh que se desnaturalice, que
1:23:09se expongan regiones eh
1:23:12hidrofóbicas y pues que se formen estos
1:23:15agregados.
1:23:16Entonces, eh la calorimetría nos permite
1:23:19eh
1:23:21nos permite identificar la temperatura a
1:23:23la cual comienza este proceso de eh
1:23:25desnaturalización, lo cual es i- eh
1:23:28necesario para definir las condiciones
1:23:29de almacenamiento y manejo.
1:23:32Además, cambios en el perfil térmico
1:23:33pueden indicar que la proteína ha
1:23:35sufrido eh modificaciones en su
1:23:37estabilidad y pues por ende eh aumentan
1:23:40eh su propensión a agregarse.
1:23:44Ah, una ventaja de la eh de la
1:23:46calorimetría
1:23:47es que no requiere eh marcadores ni
1:23:49modificaciones de la proteína, por lo
1:23:51tanto eh pues se puede analizar la
1:23:53proteína en su estado en su estado
1:23:56nativo.
1:23:57Ah, proporciona información directa
1:23:59sobre la estabilidad térmica y es
1:24:00altamente reproducible.
1:24:02Permite detectar diferencias
1:24:04estructurales o estructurales que pueden
1:24:05no ser evidentes mediante técnicas
1:24:07espectroscópicas.
1:24:10Eh vaya, porque hay algunos cambios pues
1:24:12que a- alteran en estabilidad de una
1:24:14proteína a nivel termodinámico, pero no
1:24:16necesariamente a una
1:24:18a nivel estructural, ¿no?
1:24:22Ah, por ende pues una de las
1:24:23limitaciones es que la calorimetría,
1:24:26pues no da información estructural
1:24:27específica, no indica qué regiones de la
1:24:30proteína están cambiando, sino sino más
1:24:32bien detecta el proceso global de
1:24:33desnaturalización.
1:24:35Además, eh requiere cantidades
1:24:37relativamente mayores de muestra en
1:24:39comparación de técnicas como la
1:24:40fluorescencia.
1:24:42Eh, y eh pues la interpretación puede
1:24:45llegar a ser compleja en proteínas ah
1:24:48con múltiples dominios o sistemas más
1:24:50heterogéneos. Y de nuevo, al final
1:24:52debemos de ver eh todas estas técnicas
1:24:55como ah herramientas de evaluación eh
1:24:58complementarias entre sí.
1:25:03Ah, la dispersión dinámica de luz es una
1:25:05técnica que se utiliza muchísimo para el
1:25:08análisis eh de sistemas coloidales eh de
1:25:12suspensiones o eh partículas eh
1:25:15partículas en solución.
1:25:17Y es particularmente útil para ah
1:25:20detectar la agregación en etapas eh en
1:25:23etapas tempranas.
1:25:26Eh, su principal fortaleza radica en que
1:25:29permite evaluar el sistema
1:25:32en condiciones cercanas a su estado
1:25:34nativo, sin necesidad de separación o
1:25:36modificación de la muestra. O sea, no
1:25:38requiere mucha preparación, simplemente
1:25:39pues la proteína inmersa en su propio
1:25:42medio y se ve pues cómo eh se dispersa
1:25:46eh se dispersa la luz.
1:25:48Dependiendo del tamaño eh de partícula.
1:25:51Ah, la dispersión dinámica de luz se
1:25:52basa en la interacción entre la luz y
1:25:55las partículas en suspensión. Tiene
1:25:57mucho que ver con eh el movimiento eh
1:26:00browniano en sistemas coloidales.
1:26:03Eh, cuando un haz láser
1:26:06incide sobre una solución que contiene
1:26:08eh proteínas, estas pues van a dispersar
1:26:10la luz en diferentes condiciones.
1:26:13Y debido a que las partículas están en
1:26:15constante movimiento browniano, la
1:26:17intensidad de la luz dispersada va a ir
1:26:19cambiando a lo largo del tiempo.
1:26:22Estas fluctuaciones contienen
1:26:24información sobre la velocidad del
1:26:25movimiento de las partículas.
1:26:27Obviamente pues las partículas más
1:26:29pequeñas se van a
1:26:31van a moverse más rápido generando
1:26:33fluctuaciones más rápidas.
1:26:35Y partículas más grandes se van a mover
1:26:37más lentamente.
1:26:40El análisis de estas fluctuaciones se
1:26:43realiza mediante una función de
1:26:45autocorrelación que permite determinar
1:26:47el coeficiente de difusión de las
1:26:49partículas.
1:26:50A partir de este coeficiente se calcula
1:26:53el el radio hidrodinámico de la
1:26:56partícula utilizando ecuaciones
1:26:59matemáticas.
1:27:01Y también
1:27:03esta técnica nos permite establecer un
1:27:05índice de polidispersidad que este es un
1:27:08parámetro que refleja la heterogeneidad
1:27:11de las muestras, o sea, porque podemos
1:27:12tener en una mezcla diferentes tamaños
1:27:15de partículas.
1:27:17Valores
1:27:19altos del índice de polidispersidad
1:27:21indican presencia de múltiples
1:27:22poblaciones que pueden ser pues una
1:27:25señal temprana de de inestabilidad, ¿no?
1:27:27Porque pues de manera ideal pues debería
1:27:29de haber nada más un tamaño, ¿no?
1:27:32La dispersión dinámica de luz se utiliza
1:27:35en múltiples etapas del desarrollo de un
1:27:39medicamento.
1:27:43Una de las mayores fortalezas que tiene
1:27:46la dispersión dinámica de luz es su
1:27:47capacidad para detectar la agregación en
1:27:50etapas iniciales, ¿no? O sea, ver estos
1:27:52cambios
1:27:53en la población de las partículas.
1:27:56Una limitante que tiene la dispersión
1:27:58dinámica de luz
1:27:59es que
1:28:01am
1:28:02pues tiene una buena una gran
1:28:05sensibilidad a partículas grandes.
1:28:08Por lo tanto contaminantes o el polvo
1:28:11eh, pueden afectar significativamente
1:28:13los resultados.
1:28:14Además, pues no, eh,
1:28:17no separa, eh, especies de diferentes
1:28:19partículas, es decir, que no puede
1:28:21diferenciar entre distintos tipos de
1:28:23agregados de agregados con tamaños
1:28:25similares, que eso también es un
1:28:26fenómeno que se puede, eh, que se puede
1:28:28presentar. Am,
1:28:30solamente te dice tamaños de partícula.
1:28:33Ah, la resolución de esta técnica es
1:28:35limitada en sistemas altamente
1:28:37polidispersos, es decir, eh, si tenemos
1:28:40múltiples poblaciones, eh, de tamaños
1:28:42muy parecidos, pues las señales pueden,
1:28:44eh, sobrelaparse, eh, e interferir en la
1:28:47interpretación.
1:28:49Ah, además, eh, la dispersión, o como
1:28:52decíamos que este perfil de distribución
1:28:54de las partículas, eh, se utilizan, eh,
1:28:58cálculos matemáticos, ecuaciones.
1:29:00Eh, todo esto pues está asumiendo que
1:29:03las partículas que están, eh, dispersas
1:29:05en en la suspensión o en la solución,
1:29:08son, eh, aproximada- -mente esféricas,
1:29:10lo cual no necesariamente es cierto, eh,
1:29:13para muchos sistemas biológicos o para
1:29:15proteínas complejas, pero pues es una
1:29:17técnica que se utiliza, eh, que se
1:29:19utiliza mucho para el análisis de, eh,
1:29:22soluciones y suspensiones.
1:29:26Eh, otra técnica que nos puede, eh,
1:29:29ayudar a determinar el estado de
1:29:30agregación, eh, de una proteína a lo
1:29:33largo de su proceso de producción, es la
1:29:35cromatografía de exclusión molecular. El
1:29:37fundamento de esta técnica ya lo
1:29:39habíamos, ah, mencionado
1:29:42en el video pasado cuando hablábamos,
1:29:44eh, de técnicas de separación. Sin
1:29:46embargo, pues si uno analiza los
1:29:48cromatogramas, eh, el perfil de las
1:29:50partículas que van, eh, eluyendo a lo
1:29:52largo de la columna, eh, y lo
1:29:55analizamos, eh, pues podemos, eh,
1:29:57también
1:29:58pues hacer, eh, un análisis, o sea, no
1:30:00es nada más una técnica de separación,
1:30:02sino también es una técnica analítica.
1:30:05Eh, la cromatografía mole- de exclusión
1:30:06molecular, pues también recuerden que se
1:30:08conoce eh cromatografía de exclusión por
1:30:11tamaño o cromatografía o filtración en
1:30:13gel.
1:30:14Y es una técnica que permite eh
1:30:16discriminar especies moleculares en
1:30:18función de su tamaño hidrodinámico. Ah,
1:30:21y este pues es un es una técnica
1:30:23bastante estándar para de poder
1:30:25discernir eh monómeros, oligómeros y
1:30:29fragmentos eh pues de una de una
1:30:32proteína en un proceso dado.
1:30:34Ah, ya habíamos dicho que la
1:30:36cromatografía de exclusión molecular se
1:30:37basa eh en un principio físico de
1:30:40exclusión.
1:30:41Tenemos eh en este caso se utilizan eh
1:30:44matrices o columnas cromatográficas eh
1:30:47reye eh la columna está rellena por
1:30:50partículas eh porosas de un de un tamaño
1:30:54definido.
1:30:55Eh, y entonces cuando la mes la muestra
1:30:58se inyecta, las moléculas más pequeñas
1:31:00pueden penetrar a través de esos poros,
1:31:03lo cual va a retrasar pues el camino o
1:31:06la ilusión eh y por ende eh
1:31:10eventualmente la salida de la columna y
1:31:12la de y la sí la detección.
1:31:15Ah, en cambio las moléculas más grandes
1:31:17que dan no pueden pasar a través de esos
1:31:19poros y eluyen más rápidamente.
1:31:22Ah, este mecanismo pues permite separar
1:31:24diferentes poblaciones presentes en una
1:31:26muestra.
1:31:28Eh, el volumen de elución va a estar eh
1:31:30relacionado con el tamaño hidrodinámico
1:31:32de la molécula. Eh, de hecho pues de
1:31:35dependiendo del el tamaño del poro, el
1:31:38volumen de la columna y la muestra que
1:31:41se inyecta, eh pues se puede ah se puede
1:31:44incluso hm hacer como un patrón de eh de
1:31:47calibración
1:31:49entre los tamaños, del tamaño de una
1:31:51molécula y relacionarlo con su eh con su
1:31:54volumen de elución.
1:31:56Am, otro punto importante que hay que
1:31:59tomar en cuenta es que las cromatografía
1:32:01de exclusión molecular eh no mide como
1:32:03tal la masa molecular, sino el tamaño
1:32:05efectivo en solución.
1:32:07Eh, y esto pues también, esto puede
1:32:09implicar, eh, pues que la forma de una
1:32:12molécula,
1:32:13eh, ya sea que esté en su forma más
1:32:15compacta o que una forma más laxa, puede
1:32:17influir en su, en su comportamiento,
1:32:19¿no?
1:32:20A diferencia de la espectrometría de
1:32:22masas, que esa solamente se basa,
1:32:25eh, en la masa, en la masa de los
1:32:27átomos.
1:32:29Entonces,
1:32:31la calibración, eh, de una, em,
1:32:35de una columna cromatográfica de
1:32:37exclusión molecular, eh, se realiza
1:32:39generalmente con estándares conocidos.
1:32:42Este, sin embargo, pues estos, eh, estos
1:32:44valores, en cuanto a la exactitud que
1:32:46puedan llegar a tener, hay que tomarlos
1:32:47con, eh,
1:32:50con más precaución, ¿no? Eh, aquí pues
1:32:52la técnica, eh, la técnica estándar para
1:32:55determinar el tamaño de una proteína, la
1:32:57masa molecular, es la espectrometría de
1:32:59masas. Pero de nuevo, eh,
1:33:02esta, esta técnica, eh, pues la podemos
1:33:05utilizar de forma más rutinaria, ¿no?
1:33:08Entonces, al final vamos a obtener, eh,
1:33:10cromatogramas donde cada pico que se
1:33:12vea, eh, va a corresponder a una
1:33:14población, eh, de especies, eh, de
1:33:16diferente tamaño, ¿no?
1:33:18El área bajo la curva de cada pico, pues
1:33:20es proporcional a la cantidad de esa, de
1:33:23esa especie que está presente.
1:33:25Eh, entonces, pues también podemos
1:33:26analizar los cromatogramas para calcular
1:33:28el porcentaje, por ejemplo, de un
1:33:30monómero o el porcentaje de un agregado
1:33:32o de algún fragmento, eh, que pudiera
1:33:34estar presente en nuestra,
1:33:36o sea, en nuestra muestra, ¿no?
1:33:38Mmm, entonces, la cromatografía de
1:33:39exclusión molecular es una técnica
1:33:41central para evaluar
1:33:43qué tan propensa es una proteína, eh, de
1:33:45agregarse bajo ciertas, eh, condiciones,
1:33:47dado que pues se puede cambiar,
1:33:49eh, pues el estado de la fase, eh, de la
1:33:51fase móvil en la que esté inmersa la
1:33:53proteína.
1:33:54Se utiliza para monitorear la formación
1:33:56de agregados a lo largo del tiempo,
1:33:57especialmente pues como una técnica de
1:33:59control
1:34:00a lo largo del proceso de producción.
1:34:03Eh, en control de calidad eh es una
1:34:05prueba estándar para asegurar que
1:34:06producto cumple con eh las
1:34:08especificaciones de pureza. Y más porque
1:34:11ah decíamos que
1:34:14eh va a llegar un punto en el proceso de
1:34:16producción donde eh lo importante sea eh
1:34:19separar
1:34:21eh proteínas
1:34:23que tengan propiedades fisicoquímicas
1:34:24muy similares a las de nuestro de
1:34:26nuestro biofarmacéutico y que que pues
1:34:27casi siempre van a estar relacionadas
1:34:29con este producto con el producto que
1:34:30por ejemplo en este caso pues pueden ser
1:34:32eh agregados o productos de degradación.
1:34:37Una limitante de la cromatografía de
1:34:38exclusión molecular es que eh
1:34:42es la posible interacción eh entre la
1:34:45proteína y la fase estacionaria, también
1:34:47es algo que puede suceder y esto pues
1:34:49altera la interpretación de los
1:34:51cromatogramas.
1:34:53Mmm.
1:34:55Este, además eh algunos agregados pueden
1:34:58ser inestables y disociarse durante el
1:35:00análisis, lo cual puede resultar en una
1:35:02subestimación de la presencia de
1:35:04agregados.
1:35:05También eh la resolución eh podría
1:35:09llegar a ser limitada para separar
1:35:10especies de tamaño similar, de aquí que
1:35:12bueno
1:35:13existen eh
1:35:16muchos formatos o muchas columnas
1:35:17cromatográficas que pues nos permiten
1:35:19nos permiten ir mejorando esa
1:35:20resolución, pero sí si están muy
1:35:22cercanos y también dependiendo de las
1:35:24condiciones de la corrida puede ser que
1:35:25no se puedan eh no se puedan observar.
1:35:28Además la cromatografía de exclusión
1:35:29molecular pues no nos da información
1:35:31estructural, solamente de separación y
1:35:33de eh de cuantificación.
1:35:35Aquí por ejemplo la los cromatogramas
1:35:38que se ven en la figura eh pues si fijan
1:35:40eh puede sí puede llegar a ser lo
1:35:42suficientemente fina como para dentro de
1:35:45un producto o una etapa
1:35:49eh de una fase en la etapa de producción
1:35:51que sea eh pues ya casi final, pues sí
1:35:53nos puede ayudar a discernir y también a
1:35:55separar, también es una ventaja,
1:35:57eh
1:35:58pues de proteína eh de proteína agregada
1:36:01o fragmentos.
1:36:06Una técnica que se utiliza mucho para el
1:36:08análisis de proteínas y que obviamente
1:36:10también es aplicable para el análisis de
1:36:12biofarmacéuticos y proteínas
1:36:13terapéuticas es la eh electroforesis,
1:36:16particularmente la electroforesis de
1:36:19poliacrilamida, ¿no? que es la que se
1:36:21utiliza para separar es para separar y
1:36:23analizar proteínas y existen am
1:36:26diferentes formatos que también se
1:36:28pueden aplicar como parte de la
1:36:29caracterización de un biofarmacéutico.
1:36:32Am la electroforesis pues en general eh
1:36:37eh pues es un conjunto
1:36:40eh en el que se separan eh las muestras
1:36:44eh cuando se aplica eh tenemos una
1:36:46matriz de poliacrilamida de un poro eh
1:36:48bueno de un a una concentración y una
1:36:51matriz con un tamaño de poro dado
1:36:54que eh se le aplica eh un un mapa un
1:36:57bueno un cam perdón, un campo eléctrico
1:37:01este, lo cual permite pues que migren eh
1:37:03las proteínas y se separen
1:37:05principalmente
1:37:07eh por propiedades como tamaño, carga,
1:37:10estado conformacional y también pues yo
1:37:11me voy a atrever a decir al punto
1:37:13isoeléctrico.
1:37:14Sí, entonces hay muchos formatos que
1:37:16existen eh en la electroforesis de
1:37:18proteínas, el más común es la
1:37:20electroforesis eh con SDS
1:37:24eh que es la bueno el el el los el
1:37:26acrónimo de SDS page es electroforesis
1:37:29en gel de poliacrilamida con
1:37:30dodecilsulfato de sodio.
1:37:33Eh esta es la técnica más utilizada eh
1:37:35para analizar proteínas y principalmente
1:37:37nos ayuda a establecer el tamaño hm el
1:37:41peso molecular eh de las proteínas
1:37:44eh en condiciones desnaturalizantes.
1:37:48El SDS es un detergente aniónico que
1:37:51desnaturaliza las proteínas y las
1:37:53recubre con una carga eh negativa.
1:37:56Eh ah esto el darles esa carga negativa
1:37:59elimina las diferencias de carga
1:38:01intrínseca que pudieran estar dadas por
1:38:03eh los grupos aniónicos o catiónicos de
1:38:06los residuos de los aminoácidos que
1:38:08conforman la proteína.
1:38:10Entonces, pues empareja la carga de la
1:38:12proteína y permite que eh pues la
1:38:15migración se dé principalmente al tamaño
1:38:17una vez que ocurre ese la aplicación de
1:38:19ese campo eléctrico.
1:38:21Como resultado, las proteínas se separan
1:38:23según su peso molecular aparente.
1:38:26De nuevo, eh pues el real o el más
1:38:29preciso o el más exacto, perdón, sería
1:38:31el peso obtenido por espectrometría de
1:38:33masas. O de nuevo, si complementamos eso
1:38:35con la electroforesis, pues también se
1:38:37puede pues se puede confirmar el dato,
1:38:39¿no?
1:38:40Mmm la electroforesis con SDS permite
1:38:44evaluar el peso molecular de una
1:38:46proteína, la presencia de fragmentos, o
1:38:48sea, si se está degradando la proteína.
1:38:51Eh si esta electroforesis se aplica en
1:38:54condiciones no reductoras, también nos
1:38:56puede dar la pauta de la presencia de
1:38:58algunos eh algunos agregados. En
1:39:01condiciones mmm no reductoras, eh
1:39:03generalmente pues nada más se aplica el
1:39:05SDS, eh no se
1:39:08ah no se utiliza betamercaptoetanol, eh
1:39:11DTT
1:39:12eh para desna- para romper los puentes
1:39:14disulfuro. Eh entonces también e incluso
1:39:17pues se pueden hacer comparaciones en
1:39:19condiciones reductoras y no reductoras y
1:39:21ver cómo cambia eh el perfil
1:39:24el perfil electroforético de una
1:39:26proteína. Ah por ejemplo, para analizar
1:39:29la insulina, ¿no? Que ya hemos visto
1:39:30cómo es la estructura, que es
1:39:31básicamente es una cadena A, una cadena
1:39:34B.
1:39:35Eh digamos de un tamaño de 7
1:39:36kilodaltons, es la suma de las dos
1:39:38cadenas y están unidas por puentes
1:39:39disulfuro.
1:39:41Y esos puentes disulfuro unen a la
1:39:43cadena A con la cadena B, que una es,
1:39:45digamos, sería de cinco y la otra de dos
1:39:47aminoácidos, ¿no? Entonces, si uno
1:39:49compara el perfil electroforético en
1:39:51condiciones hm no reductoras, donde no
1:39:54se rompen los puentes disulfuro, pues
1:39:56veríamos nada más una banda
1:39:57correspondiente a los siete kilodaltons
1:39:59de la insulina, mientras que si lo
1:40:00comparamos con el patrón electroforético
1:40:03en condiciones reductoras, pues veríamos
1:40:05dos bandas a dos y cinco y cinco
1:40:07kilodaltons, ¿no? Entonces, pues se
1:40:08complementan bastante también estas
1:40:10técnicas.
1:40:11Ah, también nos puede eh dependiendo del
1:40:13patrón, pues nos da la pauta de cuál
1:40:16sería eh la pureza de la me de la
1:40:18muestra, al menos enfocado hacia un
1:40:20perfil de proteínas, ¿no?
1:40:22Si vemos varias bandas eh cuando nada
1:40:24más debería de haber una,
1:40:25eh pues esto nos puede dar la idea de
1:40:27pues que haya otras otras proteínas
1:40:29presentes.
1:40:32Eh,
1:40:33entonces, eh la electroforesis eh con
1:40:36SDS se aplica eh
1:40:39ampliamente eh para verificar la
1:40:41identidad eh de una proteína
1:40:44que ya ha sido previamente caracterizada
1:40:46con técnicas más sofisticadas,
1:40:49eh para evaluar la pureza durante la
1:40:51purificación, la detección eh pues de
1:40:54posibles productos de degradación y eh
1:40:56como parte del control de consistencia
1:40:58entre lotes. Y y esta pues es una
1:41:00técnica eh pues bastante bastante
1:41:02sencilla eh que pues se se puede aplicar
1:41:04de manera rutinaria.
1:41:07Ah, la limitante de este tipo de
1:41:08cromatografía es que no refleja el
1:41:10estado nativo de la proteína,
1:41:12ya que implica
1:41:14eh pues una desnaturalización.
1:41:16Además, su capacidad de cuantificación
1:41:18eh es limitada con respecto a otras
1:41:21técnicas cromatográficas, que hay que
1:41:22aclarar que pues la cromato la
1:41:24electroforesis también es un tipo de
1:41:26cromatografía.
1:41:30Otro formato de electroforesis que es
1:41:32bastante interesante y que a veces no se
1:41:34usa tanto como yo como pues debería,
1:41:36pienso yo, eh son los geles nativos o
1:41:38blue native.
1:41:39Eh esta es una variante de la
1:41:41electroforesis que está diseñada para
1:41:44separar proteínas en complejos
1:41:46macromoleculares preservando en gran
1:41:48medida su estructura cuaternaria y sus
1:41:51interacciones no covalentes, es decir,
1:41:53es una eh electroforesis
1:41:56que nos permite estudiar eh
1:41:59analizar la presencia, por ejemplo, de
1:42:00complejos.
1:42:03Em
1:42:04y de hecho, pues se corren en en dos
1:42:07dimensiones, ¿sí? Donde en la primera
1:42:09dimensión se corre un gel donde se
1:42:11separan, justamente en condiciones
1:42:13nativas, las proteínas, como se ve aquí
1:42:15en la en la figura. Obviamente se
1:42:18separan también por tamaño, pero eh pues
1:42:20no se no se disocian los complejos, ¿no?
1:42:22Supongamos que este es el complejo de
1:42:24una proteína en un gel em
1:42:27en un gel nativo se vería como una
1:42:29banda.
1:42:30Eh y si este es este ese carril de esa
1:42:33muestra la cortamos y luego la separamos
1:42:36ya en condiciones desnaturalizantes, un
1:42:38SDS-PAGE estándar, podemos disociar
1:42:42eh pues los complejos y analizar cada
1:42:44una de las subunidades.
1:42:47Ah entonces, en la electroforesis nativa
1:42:50eh no se utilizan detergentes
1:42:51desnaturalizantes fuertes, generalmente
1:42:54em
1:42:55em se utilizan eh otro tipo de
1:42:57detergentes
1:42:59eh o incluso colorantes, eh por eso
1:43:02también luego se llama blue native
1:43:04porque se utiliza un colorante aniónico
1:43:06como el azul de Coomassie
1:43:08para darle eh esa carga a las proteínas
1:43:11y poder separarlas, pero sin
1:43:12desnaturalizarlas.
1:43:14El colorante se une a la superficie y le
1:43:16confiere una carga a la superficie de la
1:43:18proteína, le confiere una carga negativa
1:43:21eh y no desnaturaliza la proteína.
1:43:24Entonces, cuando se aplica la corriente
1:43:25eléctrica
1:43:26pues las proteínas migran de acuerdo a
1:43:28su tamaño, pero no pierden esa ese
1:43:30estado nativo.
1:43:32Em entonces, decíamos que este esta
1:43:34técnica permite analizar el estado
1:43:36oligomérico de una proteína
1:43:37identificando si se encuentra como un
1:43:39monómero, dímero, trímero u otras o u
1:43:42otras formas.
1:43:44Ah.
1:43:47También nos permite detectar la
1:43:48presencia de agregados no covalentes,
1:43:51que por ejemplo en SDS-PAGE no serían
1:43:53detectados porque pues esas son
1:43:54condiciones altamente desnaturalizantes.
1:43:57O también nos permite evaluar la
1:43:58formación de complejos entre varias
1:44:01proteínas y eh incluso también cambios
1:44:04conformacionales que puedan alterar eh
1:44:06la movilidad de una de una proteína a lo
1:44:09largo de la matriz de acrilamida.
1:44:11Ah, la limitante es que la resolución es
1:44:14menor en comparación con otras técnicas
1:44:16eh cromatográficas como la cromatografía
1:44:18de exclusión molecular.
1:44:20Eh.
1:44:22Eh, y bueno, también aunque se puede se
1:44:26en estas con en esta en esta
1:44:28electroforesis se conserva la estructura
1:44:30nativa en gran medida, pues puede haber
1:44:32algunas interacciones débiles que puedan
1:44:34perderse eh durante el análisis, ¿no? Al
1:44:36fin del a fin de todo está
1:44:39pues también se aplica una corriente
1:44:40eléctrica que pues también puede alterar
1:44:42alterar el flujo y la movilidad de eh de
1:44:44una proteína.
1:44:46Ah, entonces pues eso también se puede
1:44:47utilizar como una eh como una técnica
1:44:49complementaria a la cromatografía de
1:44:51exclusión molecular y a un SDS-PAGE eh
1:44:54clásico.
1:44:59Otra técnica cromatográfica y
1:45:00electroforética que se puede utilizar
1:45:02para el análisis eh de proteínas es el
1:45:04isoelectroenfoque.
1:45:06Esta técnica está diseñada para separar
1:45:08las proteínas en función de su punto
1:45:10isoeléctrico.
1:45:12Es decir, el pH en la cual la proteína
1:45:14tiene una carga neta de cero.
1:45:17Eh, el isoelectroenfoque se lleva a cabo
1:45:19en un gel que contiene un gradiente de
1:45:22pH estable
1:45:23generado por mezclas de compuestos
1:45:25anfóteros conocidos,
1:45:27como anfolitos me eh o mediante
1:45:30gradientes inmovilizados. Al final vamos
1:45:32a tener una tira que va a tener pues sí,
1:45:34como un gradiente o una escala de pH.
1:45:38Y y cuando se aplica un campo eléctrico,
1:45:41las proteínas van a migrar a través de
1:45:43ese gel en función de su carga neta.
1:45:46A medida que migran, eh eventualmente
1:45:48van a alcanzar el punto donde el pH del
1:45:50medio coincide con su punto
1:45:52isoeléctrico, por ende, eh en ese punto
1:45:55la carga neta va a ser cero y la
1:45:57proteína deja de moverse, es decir,
1:45:59queda enfocada o fija en ese pH.
1:46:03Eh entonces pues vaya, es una técnica
1:46:05que nos permite separar las proteínas de
1:46:06acuerdo a su pH.
1:46:08Am, una de las principales fortalezas
1:46:11que tiene el isoelectroenfoque es que
1:46:14tiene una resolución bastante bastante
1:46:17buena.
1:46:18Eh pequeñas diferencias en carga,
1:46:19incluso derivadas de modificaciones
1:46:21químicas eh sutiles, por ejemplo,
1:46:23pérdidas de hidrógenos, de grupos
1:46:25fosfato, etcétera, pueden generar
1:46:28desplazamientos detectables en el punto
1:46:30isoeléctrico.
1:46:32Eh en biofarmacéuticos ya sabemos que
1:46:34pues las variantes de carga pues van a
1:46:36ser in- en muchos casos son inevitables
1:46:38y pueden surgir de la desaminación de am
1:46:42de aminoácidos,
1:46:44eh oxidación de residuos azufrados,
1:46:46variaciones de glicosilación,
1:46:48el procesamiento incompleto eh de un
1:46:50extremo amino o carboxiloterminal,
1:46:52etcétera, o sea,
1:46:54todas esas variantes eh estructurales
1:46:57eh o postraduccionales que en muchos
1:46:59casos pueden llegar a ser sutiles, eh eh
1:47:02todo en conjunto van a alterar el punto
1:47:04isoeléctrico de la proteína.
1:47:06Am, entonces separarlos, en separar las
1:47:09proteínas por su pH eh o por su punto
1:47:12isoeléctrico, pues eh pues es una huella
1:47:15característica, ¿no?
1:47:17Am,
1:47:18una limitante del isoelectroenfoque es
1:47:20que no proporciona información sobre la
1:47:22naturaleza química de las
1:47:23modificaciones, nada más te dice pues
1:47:25que tiene tal punto isoeléctrico, no,
1:47:27pero no te dice por qué.
1:47:29Eh, además es sensible a condiciones
1:47:32experimentales y la interpretación puede
1:47:33ser compleja cuando existen múltiples
1:47:35variantes eh superpuestas.
1:47:37Eh, por eso ah casi siempre el
1:47:39isoelectroenfoque eh no se anali no se
1:47:42ve no se utiliza como una técnica de
1:47:44análisis por sí sola, sino que suele ah
1:47:47acoplarse
1:47:48eh con electro electroforesis de SDS
1:47:51condiciones desnaturalizantes para
1:47:53obtener información pues mucho más eh
1:47:55mucho más detallada.
1:47:57Ah, y bueno, la electroforesis eh
1:47:59perdón, el isoelectroenfoque pues
1:48:00también se puede utilizar como una
1:48:02técnica rutinaria.
1:48:06Ah, una técnica de análisis eh
1:48:08electroforética eh mucho más fina,
1:48:11eh justamente para la separación y la
1:48:14identificación de eh de proteínas,
1:48:16especialmente en mezclas complejas y se
1:48:18utiliza mucho en eh en proteómica, es eh
1:48:22es el 2D page.
1:48:24Eh, es una es o sea, son geles en dos
1:48:27dimensiones,
1:48:29eh donde se combinan los dos principios
1:48:31de separación que ya vimos.
1:48:33Eh, uno es separar las eh las proteínas
1:48:37aplicar o sea, realizar un
1:48:39electroenfoque
1:48:40en la en una primera dimensión y en la
1:48:42segunda dimensión eh una SDS page para
1:48:45separar las proteínas por su peso eh
1:48:47molecular,
1:48:49permitiendo descomponer una proteína o
1:48:51una mezcla eh compleja en múltiples
1:48:53especies que van a ser eh distinguibles.
1:48:55De aquí por eso es que se utiliza mucho
1:48:57eh en proteómica, ¿no? Donde tenemos una
1:48:59muestra en una condición dada que va a
1:49:01tener eh pues un perfil de proteínas eh
1:49:04característico,
1:49:05eh por ejemplo, en condiciones estándar
1:49:07o con algún y comparándolas con un
1:49:09tratamiento, pues podemos ver cómo
1:49:11cambia el perfil de de expresión eh de
1:49:14proteínas eh pues diferentes
1:49:16condiciones, ¿no?
1:49:17Ah,
1:49:19entonces decíamos que en la
1:49:21electroforesis en dos dimensiones
1:49:22integra el isolectroenfoque para separar
1:49:25primero las proteínas en su punto
1:49:26isoeléctrico, luego se separan con
1:49:29SDS-PAGE de acuerdo a su peso molecular,
1:49:31su tamaño molecular.
1:49:33Ah, entonces esto genera una separación
1:49:36donde cada proteína va a ocupar una
1:49:38posición específica, como se ve aquí en
1:49:40el eh en en este
1:49:43en este patrón, aquí ya no se ven
1:49:45bandas, sino más bien se ven puntos.
1:49:47Eh, y cada punto va a representar una
1:49:50proteína
1:49:51en un plano definido.
1:49:53Y el resultado es un mapeo eh proteico
1:49:56con altamente eh resolutivo.
1:49:59Eh, cada spot representa eh pues una
1:50:02proteína con un tamaño y un punto
1:50:04isoeléctrico específico, lo cual si lo
1:50:07mezclamos aquí, o sea,
1:50:09si, o sea, si hacemos una asociación
1:50:11entre estos dos parámetros, eh tamaño y
1:50:13punto isoeléctrico, pues eso casi
1:50:15siempre eh suele ser único de una de una
1:50:18proteína dada. Son pocas
1:50:21eh pues las proteínas que puedan llegar
1:50:23a tener el mismo punto isoeléctrico y el
1:50:24mismo y el mismo tamaño siendo proteínas
1:50:27diferentes.
1:50:28Ah,
1:50:30entonces esta técnica nos permite eh
1:50:34distinguir entre una microheterogeneidad
1:50:37eh de proteínas.
1:50:40Eh, por ejemplo, una proteína que en
1:50:41SDS-PAGE pudiera aparecer como una sola
1:50:43banda
1:50:44en una electroforesis de dos dimensiones
1:50:47puede descomponerse en múltiples spots.
1:50:50Eh,
1:50:52entonces ah pues al final la
1:50:55interpretación de estos mapas
1:50:57eh puede hacerse eh en términos de eh
1:51:00modificaciones químicas, por ejemplo, un
1:51:02desplazamiento eh horizontal, de hecho
1:51:05luego se ve que son proteínas eh
1:51:06prácticamente del mismo tamaño, pero se
1:51:08ven puntos como un un de puntos, eh
1:51:11luego a veces nos indica eso, cambios,
1:51:13por ejemplo, en carga, en des- en
1:51:15procesos de desaminación o de
1:51:17glicosilación.
1:51:19Eh, un desplazamiento en vertical, pues
1:51:21nos va a dar cambios eh en el tamaño,
1:51:23que puede ser un indicativo eh de
1:51:25proteólisis o de algún eh truncamiento
1:51:28durante la durante la expresión de la
1:51:29proteína.
1:51:31Eh, esta técnica se utiliza en etapas eh
1:51:34de desarrollo y pues como
1:51:36caracterización eh pues profunda de eh
1:51:39del producto. Esta tal vez no se utilice
1:51:41de forma eh tan rutinaria porque pues es
1:51:43una es una técnica eh más laboriosa
1:51:46em que la electroforesis SDS-PAGE eh
1:51:51pues estándar.
1:51:53Eh, y y tiene eh múltiples pasos que
1:51:55pueden introducir variabilidad.
1:51:58Em
1:51:59además no es ideal para proteínas muy
1:52:01hidrofóbicas o de alto peso molecular.
1:52:04Y eh pues la cuantificación es limitada
1:52:07en comparación con técnicas eh
1:52:08cromatográficas eh más rutinarias.
1:52:11Ah, aquí también vale la pena eh
1:52:13mencionar, tal vez esto no tenga tanta
1:52:15aplicación en em como para la
1:52:17caracterización de una sola proteína o
1:52:19de un biofarmacéutico, pero eh pues
1:52:22también eh en como parte del análisis
1:52:24proque- proteómico, estos geles 2D, como
1:52:26les digo, cada punto va a representar
1:52:28una proteína.
1:52:29Estas ah proteínas se pueden eh cortar y
1:52:34eluir del de el gel y analizarlas
1:52:37posteriormente por espectrometría de
1:52:38masas,
1:52:39eh hacer un mapeo peptídico,
1:52:42eh y todo lo eh todo lo que ya lo que ya
1:52:44mencionamos, pues para confirmar o pues
1:52:48identificar eh la proteína, ¿no?
1:52:50Entonces, sí podemos saber dentro de un
1:52:51mapeo de un mapa de puntos
1:52:54eh
1:52:55de electroforesis 2D, pues saber a qué
1:52:57proteína a qué proteína corresponde.
1:53:03Y bueno, otras técnicas que se utilizan
1:53:05para la caracterización de proteínas
1:53:07terapéuticas son los inmunoensayos.
1:53:09Estas son técnicas eh
1:53:12que nos permiten eh identificar eh
1:53:16proteínas
1:53:17basadas en la interacción entre un
1:53:19antígeno y un anticuerpo.
1:53:22Estas técnicas son esenciales porque
1:53:24permiten evaluar eh tanto la cantidad de
1:53:26proteínas sino su capacidad eh sino su
1:53:29reconocimiento molecular específico,
1:53:32lo cual está directamente relacionado
1:53:33con su identidad y con su función.
1:53:37Ah de aquí pues las dos técnicas que se
1:53:39utilizan para el análisis de proteínas
1:53:41son el Western blot
1:53:43y el Elisa,
1:53:45que pues en en general tienen eh
1:53:49un fundamento eh muy similar en cuanto a
1:53:51la detección,
1:53:53eh solo que ah
1:53:57hm la forma en la que se fija la muestra
1:54:01es diferente, ¿no?
1:54:03Ah en el Western blot eh se combina la
1:54:07electroforesis con una con la detección
1:54:10eh inmunológica. Esto por ende permite
1:54:13identificar eh o asignar una identidad a
1:54:16una banda proteica específica que veamos
1:54:19en un gel.
1:54:20Eh entonces el Western blot usualmente
1:54:22se desarrolla en tres etapas.
1:54:24Eh primero las proteínas se separan eh
1:54:27por tamaño mediante electroforesis.
1:54:31Eh después se van a transferir
1:54:34el gel se transfiere a una a una
1:54:36membrana sólida que esta puede ser de
1:54:38nitrocelulosa o PVDF,
1:54:41donde van a quedar inmovilizadas. Y ahí
1:54:43es en en esta eh en esta
1:54:48en esta membrana donde se hace eh la
1:54:50detección eh con lo con anticuerpos eh
1:54:53con anticuerpos específicos que van a eh
1:54:56reconocer epítopos en la proteína.
1:54:59Eh estos anticuerpos eh suelen eh
1:55:02manejarse conjugados donde eh pues
1:55:05acoplados a enzimas que pueden
1:55:07reaccionar con diferentes, eh,
1:55:09cromóforos o fluoróforos o que funcionen
1:55:11por quimioluminiscencia para que den una
1:55:13señal. Entonces, la señal, eh, generada
1:55:16refleja la presencia de, pues, de la
1:55:18proteína a la que se unió.
1:55:20Ah, generalmente en la, en el Western
1:55:23blot se utilizan, se incuban dos
1:55:24anticuerpos, un anticuerpo primario que
1:55:26es el que va a ser capaz, eh, de
1:55:28reconocer a la, a la proteína en
1:55:30cuestión y un anticuerpo secundario que
1:55:33es el que va a reconocer al anticuerpo
1:55:35primario
1:55:36y es el secundario el que tiene, eh, el
1:55:39que está conjugado con una enzima o con
1:55:41un fluoróforo.
1:55:42Eh, entonces, la, la reacción se genera,
1:55:45se genera mediante una reacción
1:55:47enzimática que puede ser
1:55:48quimioluminiscente, colorimétrica, casi
1:55:50siempre se utilizan, eh, conjugados de
1:55:52anticuerpo secundario con, em,
1:55:55peroxidasa de rábano
1:55:57eh, o con fosfatasa alcalina. O también,
1:56:00eh, puede estar acoplado con un
1:56:01cromóforo fluorescente.
1:56:04Am, el Western blot permite obtener
1:56:06múltiples niveles de información al
1:56:07mismo tiempo porque confirman, eh, la
1:56:09identidad especificada de la proteína,
1:56:12verifican el peso molecular esperado y
1:56:14también incluso nos puede ayudar a
1:56:16detectar, eh, fragmentos, eso sí la, eh,
1:56:19que conservan, eh, epítopos y que sean
1:56:21afiles, afines al anticuerpo.
1:56:24Eh
1:56:25o nos permite también evaluar
1:56:26modificaciones que afecten el
1:56:28reconocimiento, eh, por los anticuerpos
1:56:30o la presencia de isoformas, eh, o
1:56:32variantes detectables.
1:56:35Am, si bien, eh, pues esta no es una
1:56:37técnica cuantitativa, cuantitativa a
1:56:39diferencia del ELISA
1:56:41eh, el Western blot, eh, puede formar
1:56:43parte del paquete inicial de
1:56:45caracterización para
1:56:47eh, confirmar la identidad de una
1:56:48proteína.
1:56:51Eh, las limitantes que tiene esta
1:56:52técnica, eh, pues es que la la señal va
1:56:55a depender completamente de la calidad
1:56:56del anticuerpo.
1:56:58Eh, hay anticuerpos que, pues, a veces
1:57:00son poco específicos o que pueden
1:57:02generar, eh, pues, diferentes, eh,
1:57:05diferentes patrones, diferentes bandas
1:57:07de detección y no necesariamente se
1:57:09elevan a una proteína que esté degradada
1:57:11o que tenga, eh, pues, ahí al- algún
1:57:13cambio conformacional, sino, pues, que
1:57:16porque no es altamente específica.
1:57:18Am,
1:57:20además, pues, como se basa en
1:57:22electroforesis, eh, de poliacrilamida
1:57:24con un SDS,
1:57:26eh,
1:57:27pues, aquí estamos hablando de un
1:57:28análisis de proteínas desnaturalizadas,
1:57:30entonces, pues, también el hecho que se
1:57:32desnaturalice la proteína puede afectar
1:57:33el reconocimiento por los por los
1:57:35anticuerpos.
1:57:37Am, además, es un proceso, eh, un
1:57:40proceso bastante laborioso y, pues, esto
1:57:42puede introducir, eh, variabilidad al
1:57:44momento de obtener los resultados.
1:57:47Am, otra técnica que se utiliza, eh,
1:57:49inmunológica, pues, es ELISA, que ELISA
1:57:52es el acrónimo, eh, de enzyme-linked
1:57:55immunosorbent assay
1:57:57o, eh, pues, ensayo de inmunoabsorción,
1:57:59eh, ligado a enzimas.
1:58:01Esta, eh, es una técnica, eh, que se
1:58:05utiliza mucho para la cuantificación
1:58:07específica de proteínas en matrices
1:58:09simples y complejas, o sea, en
1:58:11diferentes en diferentes muestras.
1:58:13Am, y combina la especificidad
1:58:18de la interacción con el antígeno el
1:58:19antígeno-anticuerpo con la amplificación
1:58:21de la señal enzimática,
1:58:23lo cual, eh, permite detectar
1:58:24concentraciones muy bajas de de proteína
1:58:26en una muestra.
1:58:28Ah, aquí, pues, el fundamento, eh,
1:58:31primero, pues, se inmoviliza, eh, la
1:58:33proteína, eh,
1:58:35bueno,
1:58:36hay diferentes variantes, se puede o el
1:58:38punto es inmovilizar o fijar
1:58:41en un pocillo de una placa,
1:58:44eh, puede ser el antígeno o la o el
1:58:47anticuerpo. Aquí, por lo que se ve aquí
1:58:48en la figura, que está inmovilizado es
1:58:50el anticuerpo que es capaz de
1:58:52interaccionar con el antígeno.
1:58:54Eh,
1:58:57y eh pues se expone
1:58:59se ex, por ejemplo, en el caso de, en
1:59:01este caso,
1:59:02que está fijado eh el anticuerpo,
1:59:05se expone luego luego a la muestra, que
1:59:07interacciona con el antígeno y con
1:59:08lavado se diluye del resto de la
1:59:11de lo que está presente en la muestra
1:59:12biológica,
1:59:13eh y después eh pues se hace
1:59:15interaccionar con anticuerpo primario y
1:59:17secundario de una forma eh pues similar
1:59:19a lo Western blot.
1:59:21Eh, en el caso de que lo que estuviera
1:59:22aquí fijado,
1:59:24eh o sea, se puede fijar el antígeno a
1:59:27la
1:59:29eh al pocillo de la placa, que se puede
1:59:31venir de una muestra biológica,
1:59:34eh o también pues de forma eh de forma
1:59:37comercial cuando lo que se quiere
1:59:38cuantificar son los antígenos, cuando
1:59:39queremos ver títulos de anticuerpos en
1:59:41una muestra.
1:59:43Y de nuevo pues se lleva a cabo eh esta
1:59:46esta interacción.
1:59:48Eh, y de, al final pues se genera una
1:59:50señal mediante una enzima conjugada que
1:59:52transforma un sustrato en un producto
1:59:54detectable. Y eh la electrofore, el,
1:59:57perdón, el ELISA pues también existe eh
1:59:59en diferentes formatos dependiendo de
2:00:01qué es lo que está acoplado a
2:00:05al pocillo.
2:00:08Mmm, entonces eh tenemos una variante de
2:00:11ELISA que sería el ELISA tipo sándwich.
2:00:13En este el anticuerpo eh de captura es
2:00:16inmovilizado en la placa fija al al an,
2:00:19al antígeno.
2:00:22Posteriormente eh o sea, se pone el
2:00:25anticuerpo fijo, se expone, digamos, en
2:00:28el caso del biofarmacéutico a la, al
2:00:30biofarmacéutico,
2:00:31eh y posteriormente se expone, se expone
2:00:34a un segundo anticuerpo que es el que va
2:00:36a detectar
2:00:38a la proteína, pero en un epítopo eh
2:00:41distinto a que el anticuerpo que está
2:00:42fijo en la, en la placa.
2:00:46Eh, esta técnica suele utilizarse para
2:00:48cuantificar anticuerpos monoclonales en
2:00:50plasma durante estudios
2:00:52farmacocinéticos, por ejemplo.
2:00:54Eh,
2:00:56y bueno, pues aquí eh este anticuerpo
2:01:00este anticuerpo sería el anticuerpo
2:01:01primario y luego tenemos el anticuerpo
2:01:03secundario que va a estar conjugado a
2:01:04una enzima y ese es el que va a generar
2:01:06eh generar una señal.
2:01:08Eh, otro formato que tenemos es el elisa
2:01:11eh indirecto, donde eh
2:01:16tenemos el antígeno
2:01:19fijado
2:01:20a a la matriz, a la matriz del pozo
2:01:24y esta se detecta mediante un anticuerpo
2:01:26primario y un anticuerpo secundario.
2:01:27Esta sería como que la versión eh más
2:01:29estándar. Se llama indirecto porque pues
2:01:32es el anticuerpo secundario el que tiene
2:01:35eh pues el fluoróforo o el eh pues la la
2:01:38enzima que va a dar esta señal, que va a
2:01:40permitir detectar el antígeno.
2:01:43Eh, también está el elisa directo, que
2:01:45la única diferencia es que pues el
2:01:48anticuerpo, nada más se utiliza un
2:01:49anticuerpo, el anticuerpo primario pues
2:01:51detecta tanto el antígeno y además está
2:01:53está conjugado con el eh con la enzima
2:01:56que va a revelar. Eh, este el enzima, el
2:01:59el elisa directo, perdón, eh no se
2:02:01utiliza no se utiliza tanto.
2:02:04Eh, el indirecto es el más eh es el más
2:02:07versátil porque permite eh jugar con una
2:02:09amplia gama de anticuerpos primarios
2:02:11utilizando el mismo anticuerpo el mismo
2:02:13anticuerpo secundario. Pero nada más ya
2:02:15nada más el dato para que sepan que
2:02:16también está el elisa eh el elisa
2:02:18directo.
2:02:20Entonces, estos este elisa se utiliza
2:02:22para detectar eh anticuerpos eh
2:02:27más que eh proteínas terapéuticas porque
2:02:29pues el anti el la proteína terapéutica
2:02:31pues ya va a estar fija como tal eh
2:02:35en el eh en la matriz.
2:02:37Eh, luego tenemos el elisa competitivo
2:02:40que aquí el analito eh compite con una
2:02:43versión marcada o eh o inmovilizada por
2:02:47la unión al anticuerpo.
2:02:49Eh aquí pues la señal es inversamente
2:02:52proporcional a la concentración del
2:02:53analito.
2:02:55Y eh es útil cuando el analito es
2:02:57pequeño,
2:02:58cuando solo hay un epítopo disponible y
2:03:01no es posible eh realizar eh un ELISA de
2:03:05tipo sándwich.
2:03:09Eh finalmente eh otro tipo de ensayos
2:03:11que suelen eh solicitarse para el
2:03:14registro sanitario de muchos
2:03:15medicamentos biotecnológicos, pues
2:03:16obviamente van a ser los bioensayos.
2:03:19Eh porque estos eh evalúan de manera
2:03:22directa eh la actividad biológica eh del
2:03:26producto.
2:03:27Eh estos en esos ensayos al final eh por
2:03:30ende, o sea, van a integrar todos los
2:03:31atributos estructurales en una única en
2:03:34una única respuesta, que pues va a ser
2:03:35la respuesta biológica.
2:03:38Eh de aquí pues no podríamos hablar eh
2:03:41de técnicas estándar como estas que
2:03:43hemos mencionado, eh electroforesis,
2:03:46este infrarrojo, espectrometría de
2:03:49masas, sino porque pues el eh
2:03:51el ensayo de actividad biológica, pues
2:03:53va a ser específico de cada eh de cada
2:03:55producto.
2:03:56Eh aquí pues dependiendo de cómo se
2:03:59pueda evaluar la actividad biológica,
2:04:01pues estos bioensayos pueden ser eh
2:04:03complejos, costosos,
2:04:05son menos reproducibles y la
2:04:06interpretación puede ser eh puede ser
2:04:09más compleja.
2:04:11Eh y también pues por ello pues debe de
2:04:13utilizarse un abordaje pues
2:04:15multienfoque, de nuevo. No voy a decir
2:04:17ortogonal porque no se va a evaluar el
2:04:19mismo atributo con una técnica con un
2:04:21fundamento diferente,
2:04:22pero eh
2:04:25pues sí debe de mezclarse en mayor
2:04:27medida, dependiendo del producto, pues
2:04:28diferentes alcances dentro de esta
2:04:30actividad biológica.
2:04:32Ah uno de ellos podría ser la potencia.
2:04:35Eh esta potencia se define como la
2:04:37capacidad de un biofármaco eh para
2:04:39producir un efecto biológico específico
2:04:42en relación pues con alguna referencia.
2:04:45Esto por ejemplo generalmente se puede
2:04:47expresar como actividad relativa en
2:04:49porcentaje con respecto a un estándar, a
2:04:52una concentración efectiva 50, una
2:04:55concentración inhibitoria 50,
2:04:57dependiendo del tipo de tipo de efecto,
2:04:59¿no?
2:05:00Ehm También pueden incluirse ensayos
2:05:04celulares, estos se basan
2:05:07En células que van a responder al
2:05:10biofármaco pues de diferentes maneras,
2:05:12¿no? Puede ser mediante medir la
2:05:14proliferación, muerte celular,
2:05:17apoptosis,
2:05:19la producción de alguna molécula
2:05:21señalizadora
2:05:23Activación de vía señalización,
2:05:26por ejemplo Con la insulina se pueden
2:05:29utilizar ensayos celulares pues para
2:05:31medir la captación de glucosa en
2:05:33respuesta a la insulina. O por ejemplo
2:05:36un anticuerpo monoclonal puede evaluarse
2:05:39midiendo su capacidad para inhibir la
2:05:41proliferación de células tumorales de
2:05:44alguna línea celular de cáncer o por
2:05:46bloquear el efecto de algún receptor.
2:05:49Tenemos los ensayos de unión al receptor
2:05:51que ya son más específicos
2:05:54que miden la capacidad del biofármaco
2:05:55para unirse a su diana molecular.
2:05:58Estos pueden utilizarse en sistemas como
2:06:01células que expresan ese receptor Como
2:06:04ensayos de unión al ligando
2:06:06A ligandos que van a estar marcados Ehm
2:06:11Y bueno vaya estos son útiles ehm
2:06:14Para evaluar la afinidad ehm pues de
2:06:17nuestro producto, ¿no?
2:06:19Ehm tenemos los ensayos enzimáticos que
2:06:21esto obviamente va a ser exclusivo para
2:06:24proteínas con actividad catalítica Donde
2:06:28pues simplemente se mide la conversión
2:06:30del sustrato en producto, ¿no? Por
2:06:32ejemplo, eh
2:06:35en una enzima hm terapéutica, digamos,
2:06:38tal vez un factor de coagulación, pues
2:06:39cómo se transforma eh
2:06:43pues el cimógeno no en una proteína en
2:06:45una proteína activa o la producción de
2:06:47cierto metabolito.
2:06:49Ah, tenemos también los ensayos
2:06:50reporteros, que estos suelen utilizar eh
2:06:53células modificadas genéticamente que
2:06:55producen eh una señal como luminiscencia
2:06:58o fluorescencia, algo que sea
2:06:59identificable cuando se activa eh una
2:07:02vía específica. Entonces, si el fármaco
2:07:05eh pues es capaz de activar esa vía,
2:07:07pues va a generar una señal.
2:07:09Eh
2:07:11también tenemos nuestras curvas
2:07:12dosis-respuesta.
2:07:15Eh
2:07:16ah aquí, por ejemplo, a medida eh que va
2:07:19aumentando la concentración del fármaco,
2:07:21aumenta la respuesta biológica hasta
2:07:22alcanzar eh un máximo.
2:07:25Eh y esto, pues, si se compara con un
2:07:27estándar, pues, permite también
2:07:28determinar la potencia eh relativa, ¿no?
2:07:31Y este tipo de
2:07:33hm
2:07:34este tipo de técnicas, pues, o sea,
2:07:36estas curvas, pues, generalmente se
2:07:37hacen en sistemas
2:07:40en sistemas in vivo, ¿no? En animales o
2:07:42ya sea en fase en fase clínica.
2:07:45Ah, aquí, pues, una un punto importante
2:07:48eh de los bioensayos eh pues, también
2:07:50depende de cuál va a ser el enfoque o la
2:07:52aplicación o para qué se quiere el
2:07:53resultado ah de ese bioensayo.
2:07:56Obviamente eh para
2:07:59el desarrollo y la caracterización
2:08:03para obtener el registro sanitario de un
2:08:05producto eh innovador, pues, sí se
2:08:07requiere hacer una gran batería de
2:08:09bioensayos, ¿no? Para asegurarnos, pues,
2:08:12que el medicamento cumple con los
2:08:13requisitos de seguridad y eficacia.
2:08:16Pero eh por ejemplo, para el proceso de
2:08:18aprobación de un medicamento
2:08:20biotecnológico biocomparable, donde ya
2:08:23existe eh información relacionada con
2:08:25seguridad y eficacia del producto
2:08:28innovador o del producto de patente,
2:08:30pues para el medicamento eh
2:08:31biocomparable pues no es necesario
2:08:33volver a hacer toda esa batería eh de
2:08:35bioensayos.
2:08:36A veces con una eh caracterización eh
2:08:39fisicoquímica, con las técnicas que
2:08:41vimos anteriormente,
2:08:42si es lo suficientemente robusta, pues
2:08:45los bioensayos no van a ser eh tan
2:08:46sofisticados.
2:08:48Eh, pero bueno, esto va a depender pues
2:08:50de la de la capacidad eh analítica y de
2:08:53la información que pueda presentar eh la
2:08:55empresa
2:08:56eh la empresa farmacéutica. Pero vaya,
2:08:58si es de un producto que ya se tiene
2:09:00mucha experiencia en el mercado, mucho
2:09:01conocimiento, pues tal vez no se para
2:09:03los bioensayos sea suficiente con
2:09:05pruebas eh bioquímicas o en ensayos en
2:09:08líneas celulares, no necesariamente
2:09:09irnos a modelos eh a modelos in vivo.
2:09:12Más de esto vamos a hablar en la en la
2:09:14unidad cuatro, cuando hablemos de los
2:09:16medicamentos biosimilares o los
2:09:18biocomparables.
2:09:20Y bueno, eh ya para terminar eh este ve
2:09:23este video, eh pues es importante eh
2:09:26resaltar
2:09:28eh bueno, respondiendo primero a la
2:09:30pregunta inicial eh del video, que si es
2:09:32posible eh caracterizar completamente a
2:09:35una proteína terapéutica, pues va a
2:09:37depender de la proteína, de qué tan
2:09:38compleja sea.
2:09:40Eh, si es una proteína que no que es
2:09:42pequeña, que no tiene muchas
2:09:43modificaciones postraduccionales, yo
2:09:45creo que sí se puede eh caracterizar eh
2:09:48por completo,
2:09:50eh pero por ejemplo, una proteína mucho
2:09:51más compleja, como un factor de
2:09:53coagulación, un anticuerpo eh
2:09:54monoclonal, eh pues tal vez esto pueda
2:09:58eh estar un poquito más eh limitado.
2:10:01Am,
2:10:03pero pues sí se puede presentar eh
2:10:04información
2:10:06lo suficientemente extensa como para
2:10:09darle esa tranquilidad a las autoridades
2:10:12regulatorias pues del de que se está
2:10:14identificando correctamente la proteína
2:10:16que se está produciendo, o sea, que de
2:10:17verdad estamos produciendo lo que
2:10:18decimos que vamos a producir,
2:10:20eh que tiene ciertos atributos de
2:10:22calidad y que eh pues tiene eh que se ha
2:10:25demostrado la eficacia mediante diversos
2:10:28bioensayos.
2:10:30Eh, ninguna técnica analítica por sí
2:10:32sola es suficiente para caracterizar eh
2:10:34un biofármaco.
2:10:36Al final eh de las técnicas que vimos y
2:10:38también se pueden utilizar otras, no
2:10:39necesariamente las que hemos visto,
2:10:41estas son las que más se utilizan para
2:10:42la caracterización de proteínas.
2:10:45Eh, cada método va a ofrecer una
2:10:48ventana parcial del sistema, nos va a
2:10:50dar cierta eh cierta información. Y eso
2:10:52lo mediante la integración de de
2:10:54múltiples técnicas que va a ser posible
2:10:56construir una representación completa y
2:10:59también como decíamos robusta y
2:11:01defendible del producto, especialmente
2:11:02para presentarse a las instancias
2:11:04regulatorias.
2:11:06Eh, los medicamentos biotecnológicos,
2:11:08pues ya sabemos que no no son entidades
2:11:10moleculares únicas, o sea, al producirse
2:11:12en un organismo vivo, pues vamos a
2:11:14obtener eh poblaciones que pueden tener
2:11:16variantes estructurales altamente
2:11:18similares, pero no necesariamente
2:11:20idénticas.
2:11:21Ah, por lo tanto, el producto
2:11:25no debe definirse tan solo por su
2:11:27fórmula o por su identidad, sino también
2:11:29pues deben de evaluarse en conjunto pues
2:11:31estos atributos críticos calidad que ya
2:11:33mencionamos, que incluyen identidad,
2:11:35pureza, heterogeneidad de carga,
2:11:37agregación, estructuras de orden
2:11:38superior y la actividad biológica.
2:11:42Ah, de nuevo, pues vamos a mencionar la
2:11:44importancia eh del principio de
2:11:46ortogonalidad,
2:11:47es decir, el uso de técnicas basadas en
2:11:50principios o fundamentos distintos para
2:11:52evaluar un mismo atributo.
2:11:54Ah, como hemos mencionado, pues cada
2:11:56técnica pues tiene sesgos o desventajas
2:11:59diferentes,
2:12:00eh, por lo que la coincidencia entre
2:12:04técnicas aumenta la confianza del
2:12:06resultado, o sea, al decir eh, para
2:12:08determinar el peso molecular de una
2:12:10proteína, pues podemos complementar con
2:12:12cromatografía de exclusión molecular,
2:12:14electroforesis eh y espectrometría de
2:12:16masas y si todas esas, pues, dan
2:12:18resultados muy semejantes, pues, podemos
2:12:20tener la confianza de que, pues, es el
2:12:21peso molecular del producto, ¿no?
2:12:25Eh, también que, pues, no toda la
2:12:26información, eh, analítica que se va
2:12:29obteniendo, pues, tiene el mismo nivel
2:12:30de de relevancia funcional.
2:12:33Eh,
2:12:34y, pues, por ende, puede establecerse
2:12:36una jerarquía en cuanto a la información
2:12:38que se puede obtener.
2:12:40Eh, el nivel más bajo, pues, está la
2:12:42estructura primaria,
2:12:44eh, y de ahí, pues, nos podríamos ir
2:12:46subiendo hasta, eh, la actividad
2:12:48biológica.
2:12:49Eh, entonces, por ejemplo, un fármaco,
2:12:51pues, puede cumplir con criterios
2:12:53estructurales, pero, pues, al momento de
2:12:55ver la actividad fisiológica, pues, que
2:12:57pues, que falle.
2:12:59Eh, y esto, pues, solamente se va a
2:13:00detectar con los bioensayos, ¿no?
2:13:02Entonces, ah, pues, es importante hacer
2:13:04esta integración de toda, eh, de esta
2:13:06información. La integración analítica es
2:13:09acumulativa y jerárquica y no, eh,
2:13:12una no excluye a la otra.
2:13:15Pero, pues, también, eh,
2:13:18eh, pues, también depende, ¿no? En qué
2:13:20punto en el estado de de producción, del
2:13:22monitoreo, del proceso de aprobación de
2:13:24un medicamento, pues, que vayan a cobrar
2:13:26más relevancia una técnica que otra.
2:13:29Es decir,
2:13:30la integración de estas técnicas va a
2:13:32evolucionar a lo largo del ciclo de vida
2:13:35del fármaco.
2:13:37En etapas tempranas de investigación y
2:13:38desarrollo, pues, se van a utilizar
2:13:40técnicas de muy alta resolución y muy
2:13:42complejas, como decíamos, eh,
2:13:44cromatografía, espectrometría de masas,
2:13:47resonancia magnética, para entender al
2:13:50el producto en profundidad.
2:13:52Pero, ya una vez que se ha aprobado el
2:13:54medicamento, eh, pues, se pueden
2:13:57priorizar, eh, otras técnicas que
2:14:00permitan, eh, evaluar el mismo atributo,
2:14:03tal vez con menos detalle, pero que
2:14:05permitan este monitoreo y la
2:14:07optimización, eh, la optimización del
2:14:08proceso.
2:14:10Am, también es importante mencionar que
2:14:13eh, como parte del control de calidad
2:14:16Pues se van a seleccionar técnicas que
2:14:18vayan a ser robustas, reproducibles y
2:14:20que sean validadas
2:14:24Entonces pues también de ahí la
2:14:25pertinencia de la selección de una o
2:14:27varias técnicas o en qué etapas
2:14:31Y bueno,
2:14:33ya por último
2:14:35Pues las agencias regulatorias no
2:14:37evalúan técnicas individuales eh
2:14:40Sino más bien evalúan en la consistencia
2:14:43global de la evidencia especialmente
2:14:45para la obtención del registro
2:14:46sanitario, entonces se tiene que armar
2:14:48un muy buen expediente como parte de la
2:14:51caracterización
2:14:53Entonces al final
2:14:55también podemos aplicar el concepto de
2:14:57la totalidad de la evidencia
2:14:59Que esto implica que la calidad de un
2:15:01biofarmacéutico se demuestra mediante un
2:15:03conjunto integrado de datos, no datos
2:15:05aislados
2:15:07Esto también pues tiene implicaciones
2:15:09importantes como decíamos en el
2:15:10desarrollo de los de los biosimilares
2:15:13que eh
2:15:14Que vamos a vamos a abordar en la unidad
2:15:18cuatro

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