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12 ¿Cómo se producen los biofarmacéuticos? — Transcript

by Aída Jimena Velarde Salcedo · 32,025 words · 5,808 segments · language en · Watch on YouTube

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0:10Hola, bienvenidas y bienvenidos a otro
0:12vídeo del curso diseño de biofármacos.
0:15En la sesión anterior eh abordamos
0:18algunas consideraciones, eh ventajas y
0:20desventajas y atributos que tienen las
0:23diferentes eh plataformas biológicas
0:26para la producción de biofármacos,
0:28dándole dándole el enfoque a pues cuáles
0:31son los atributos o que deberían de
0:34tener a nivel eh molecular o de
0:37seguridad eh relacionados con el
0:39producto final y que pues esto va a esto
0:42va a definir pues cuál sería la mejor
0:44plataforma biológica, ya sea una
0:46bacteria, una levadura, una célula de
0:48insecto o una célula de mamífero.
0:51Eh en esta sesión ahora vamos a pasar a
0:55la siguiente etapa, porque esto que
0:56hablamos de la selección y de la
0:58plataforma de producción eh y las
1:01herramientas de modificación genética,
1:03pues estas son indispensables para la
1:06etapa de investigación y desarrollo
1:08cuando se va a decidir el producto. Pero
1:11una vez que ya se ha establecido esto,
1:14pues pasaríamos a la siguiente etapa que
1:17sería la que tiene que ver con todo el
1:19proceso de producción y el que se
1:20pretende eh establecer durante eh pues
1:24la vigencia del ciclo sanitario, del
1:26registro sanitario, perdón, todo el
1:28ciclo de vida del medicamento eh pues
1:30con el producto ya se genera o se sí, se
1:33manufactura eh de forma de forma
1:35continua y a gran escala.
1:38Eh entonces en este tema, en el tema de
1:40esta sesión vamos a hablar de cómo es
1:42que se producen eh los biofármacos.
1:45Principalmente pues a nivel industrial.
1:47Y pues este punto es es muy muy
1:50importante y uno de los eh retos más
1:52complejos que se enfrenta la industria
1:55farmacéutica
1:57ya que eh como ya hemos mencionado a lo
1:58largo del curso, pues las diferencias
2:00entre los fármacos de síntesis química y
2:03los biotecnológicos, pues son muchos y
2:05están principalmente delimitados porque
2:09los biofarmacéuticos,
2:10además de ser biomoléculas
2:13potencialmente inestables, pues son
2:15producidas
2:16a partir de organismos vivos, lo cual
2:19introduce una variabilidad inherente
2:23bastante fuerte
2:25y que pues esto va a influir de manera
2:27directa en los atributos del producto y
2:30que por tanto, si bien no puede ser
2:32controlada al 100%, debe de manejarse de
2:36una manera que no afecte estos atributos
2:38o que se produzca con cierta
2:40consistencia
2:42entonces definir el proceso de
2:44producción una vez que ya se tiene
2:46establecida la plataforma biológica,
2:48pues es un punto importante de los
2:50atributos de calidad
2:52una premisa importante también en la
2:54biotecnología farmacéutica, creo que ya
2:56lo habíamos mencionado en otros vídeos,
2:58es que el proceso va a definir al
3:00producto
3:01esto quiere decir que pues al final un
3:04biofarmacéutico, una proteína
3:06terapéutica, una molécula de ácido
3:08nucleico, no va a ser nada más el
3:10resultado
3:12pues de un proceso, sino aquí pues se
3:14suma
3:15todas estas variables o el
3:17comportamiento de un sistema biológico,
3:19en qué condiciones se encuentra
3:22al momento del proceso de producción
3:24en el en el resultado, entonces si
3:27hablamos ya sea de la insulina, un
3:29anticuerpo monoclonal, todo cada cada
3:32molécula va a tener requerimientos
3:34específicos en términos de pues si
3:36deseamos del sistema de expresión, las
3:38condiciones de cultivo, los tiempos, las
3:41estrategias de purificación, los
3:42posibles contaminantes que puedan estar
3:44presentes
3:45y pues también dependiendo de las
3:47características del producto,
3:49cuál va a ser la estrategia más
3:51eficiente para purificarlo y generar una
3:53formulación efectiva.
3:55Eh, entonces,
3:56pues, por ende, todo el diseño del
3:59bioproceso, tanto etapas upstream y
4:01downstream, impactan directamente en los
4:03atributos críticos eh de calidad, ¿no?
4:06Que tienen que ver con la pureza, la
4:09actividad biológica, su estabilidad y
4:11también por lo relacionado con la
4:13seguridad, pues la
4:14potencial inmunogenicidad que pudiera
4:16presentarse y em también en en en los
4:20costos.
4:22Entonces, eh en esta sesión vamos a
4:24hablar sobre cuáles son algunas de las
4:27técnicas eh pues más eh utilizadas,
4:31tanto de como parte del procesamiento
4:32upstream como downstream.
4:35Eh, y cómo se pudieran eh diseñar
4:39para que cumplan con estos eh
4:42requerimientos de calidad y además
4:44tomando en cuenta eh pues que se debe de
4:46cumplir eh con cierta demanda de
4:48producción, o sea, que generará cierta
4:50cantidad de producto y a
4:53eh de una manera que pues los costos
4:55pues sean eh sean rentables durante todo
4:58el proceso.
5:02Y bueno, antes de definir cuáles van a
5:04ser eh pues todas las etapas
5:05individuales eh del proceso, es
5:07importante eh tomar en cuenta un
5:09concepto eh que se refiere a la
5:12eh la capacidad del proceso.
5:15Eh, esto se refiere a que pues el
5:17proceso que nosotros definamos debe de
5:19ser capaz eh de producir de manera
5:21consistente un biofarmacéutico que
5:24cumpla con todas estas especificaciones
5:26eh de calidad, cantidad y costo a lo
5:29largo de todo el ciclo de vida eh del
5:31medicamento, o sea, desde la etapa de la
5:33concepción, investigación y desarrollo,
5:35el proceso regulatorio,
5:37eh la producción eh de forma continua a
5:40nivel industrial y pues hasta que se
5:42retira del mercado.
5:44Eh, este enfoque eh va a estar
5:46condicionado principalmente en tres
5:48dimensiones, aunque aquí vienen
5:49definidas eh otras.
5:51Eh primero, o sea, que están
5:53relacionados principalmente con la
5:54calidad del producto, eh la cantidad que
5:57se quiere eh producir y pues también el
6:00contexto regulatorio bajo el cual va a
6:03ser eh elaborado, ¿no? También, o sea,
6:06dependiendo si es eh una molécula de
6:07ácido nucleico, una proteína, un
6:10producto de terapia génica, etcétera.
6:13Eh al final eh
6:15el definir el proceso eh implica eh
6:19integrar, decíamos, tanto el
6:20procesamiento upstream y downstream de
6:23manera que eh se complementen. Donde
6:27hay que eh tratar de implementar
6:29estrategias, por ejemplo, de
6:30purificación que sean eh ortogonales y
6:33robustas. Ahorita vamos a hablar un
6:35poquito más de de esos conceptos. Eh a y
6:38que eh donde la calidad se construya
6:40desde el diseño del proceso y no nada
6:42más eh mediante pues un punto un punto
6:45final, ¿no?
6:47Eh si revisamos, o sea, los puntos que
6:49vienen aquí descritos en la diapositiva,
6:51eh desde el punto de vista regulatorio,
6:54decíamos, pues el marco regulatorio va a
6:56definir eh el proceso. No hay que perder
7:00de vista que independientemente de si es
7:01un producto biotecnológico o uno de
7:03síntesis química, eh los medicamentos
7:06deben producirse bajo estándares
7:08estrictos de buenas prácticas de
7:10manufactura, buenas prácticas eh de fab
7:12de fabricación.
7:14Eh de hecho eh existen eh pues normas
7:17oficiales mexicanas que abordan
7:19justamente estos puntos
7:21y enfocados a la producción de
7:23medicamentos y que eh además tienen
7:26indicaciones específicas para cómo
7:28serían las buenas prácticas de
7:29manufactura de un medicamento
7:31biotecnológico. Esto lo vamos a revisar
7:33en la unidad cuatro.
7:34Eh pero en general eh pues tenemos que
7:37establecer
7:39procesos y demostrar
7:41que estos procesos sean reproducibles,
7:44eh controlados,
7:46eh que estén validados, que además
7:49puedan ser eh trazables, o sea, que debe
7:51haber eh documentación que permita eh
7:53pues dar el monitoreo adecuado.
7:55Eh entonces, esto significa que pues no
7:59eh no es nada más que se demuestre que
8:01el proceso funciona, sino eh todos estos
8:05puntos van a demostrar que hay esta
8:07consistencia de lote a lote. Mmm y este
8:10punto es importante en el desde el
8:12contexto eh regulatorio, porque si
8:14nosotros aseguramos o demostramos con
8:17esta confianza eh que nuestro proceso
8:19tiene calidad, las instancias
8:21regulatorias van a tener esta eh
8:25esta seguridad también, esta confianza,
8:27de que
8:30eh digamos que las condiciones o las
8:32indicaciones o las características del
8:34producto para las que se aprobaron
8:36durante el registro sanitario se van a
8:38eh
8:40mantener durante todo el ciclo de vida
8:42del medicamento, o sea, la calidad es la
8:44que va a eh garantizar la consistencia.
8:47Eh
8:48además,
8:51este punto de la eh de la calidad, pues
8:53va a ir cambiando, o sea, los requi- los
8:55requerimientos van a de cómo se
8:57demuestra esta calidad van a ir
8:58cambiando dependiendo, pues, de las
9:00etapas o, digamos, de la magnitud eh de
9:02la producción. Entonces,
9:04o sea, no es lo mismo lo que uno lo que
9:06uno observa a nivel laboratorio o en una
9:08escala piloto allá eh pues en una escala
9:11en una escala mayor. Entonces, el que se
9:12hayan contemplado
9:14la implementación eh de la calidad y que
9:16los atributos del producto se mantengan
9:18con- constantes independientemente de la
9:20etapa, pues, es lo que van a dar esta
9:21confianza para la aprobación eh del
9:24registro eh regulatorio.
9:26Y, pues, también tomando en cuenta la
9:28exigencia, ¿no? Eh por ejemplo, en las
9:29fases eh preclínicas o en las etapas
9:32clínicas tempranas, eh pues, también los
9:34procesos pudieran ser más flexibles, hay
9:36un poquito más de mmm eh pues sí, de
9:38espacio de trabajo a hacer cambios. Pero
9:41ya en las fases avanzadas o en la
9:43producción comercial, una vez que se
9:44aprobó el medicamento, el proceso debe
9:46estar completamente eh caracterizado y
9:48validado. Eh y cambios que se hagan,
9:51pues también tienen implicaciones eh
9:53pues en el eh en el estatus eh
9:55regulatorio, en la aprobación del
9:57registro sanitario.
9:58Ehm
10:00y eso también implica que los cambios en
10:02el proceso,
10:04conforme se va avanzando, se vuelven
10:06cada vez más costosos y difíciles
10:08conforme avanza el desarrollo clínico.
10:10Entonces, por lo tanto, es deseable,
10:13desde etapas tempranas, tener un proceso
10:15robusto y escalable.
10:17Mmm perdón.
10:18Eh pasando al punto de eh la calidad,
10:22ya sabemos que pues el objetivo del
10:24proceso que definamos, pues es
10:26garantizar que el producto cumpla con
10:28estos atributos críticos de calidad, que
10:29estos van a incluir, decíamos, pureza,
10:32también incluyen identidad, potencia
10:34biológica, la estabilidad del producto,
10:36definir el perfil de impurezas, entre
10:38otros puntos.
10:40Y esto eh pues es diferente a cómo se
10:43establece eh con los fármacos de
10:45síntesis química.
10:47En los biofarmacéuticos, la calidad del
10:49producto eh va a depender fuertemente eh
10:52del proceso y las condiciones en las que
10:54se realizan. De nuevo, va a estar
10:56definido por eh el sistema de expresión,
10:59las estrategias de de eh de purificación
11:02y pues cómo se manejan eh las impurezas.
11:05Es decir, eh que el proceso que nosotros
11:07implementemos, principalmente en la
11:09etapa downstream, se debe demostrar que
11:11sea lo suficientemente eficiente para eh
11:15obtener un producto puro, ¿no? O sea, de
11:16que no estén presentes proteínas del
11:19hospedero, eh ADN residual, eh
11:22endotoxinas, en el caso que trabajemos
11:24con sistemas bacterianos,
11:26eh virus, eh es principalmente en
11:29sistemas de mamíferos, proteínas
11:31agregadas, proteínas no funcionales.
11:33Entonces, se debe demostrar que eh pues
11:36la estrategia del diseño del
11:37procesamiento downstream contemple
11:39múltiples eh mecanismos o o técnicas
11:43basadas en diferentes fundamentos para
11:45la separación
11:47eh o eliminación de estas impurezas del
11:49producto terminado.
11:51Eh por ende, este enfoque decíamos que
11:54se basa en el principio eh utilizando
11:56mecanismos ortogonales, es decir, donde
11:59diferentes etapas eliminan contaminantes
12:01mediante sus propiedades distintas, ya
12:03sea por la carga, el tamaño, la
12:05afinidad, la hidrofobicidad, etcétera.
12:08También por esto es importante eh
12:10conocer muy bien eh pues las propiedades
12:13fisicoquímicas y los atributos de eh del
12:15producto.
12:16Además,
12:18el proceso que establezcamos debe ser
12:20capaz de mitigar riesgos asociados con
12:22la variabilidad biológica.
12:25Entonces, aquí debemos eh definir
12:29eh adecuadamente y establecer las
12:31estrategias de control de los que le
12:33llaman los parámetros críticos del
12:35proceso, o sea, va a haber algunas
12:37etapas que sean más importantes que
12:38otras durante el procesamiento que van a
12:40impactar directamente los atributos
12:42críticos de calidad. Estos son los
12:44parámetros críticos de
12:45eh
12:47los parámetros críticos del proceso, por
12:49ejemplo, decir eh en este
12:52en esta etapa de centrifugación o de
12:54filtración es más crítica que un proceso
12:56de diálisis o de ultrafiltración porque
12:58pues se puede perder la mayoría del
12:59producto o porque aquí se elimina un
13:01contaminante importante o porque si esto
13:03no se hace bien puede haber una
13:04agregación, desnaturalización
13:06irreversible de la proteína. Entonces,
13:08eh inde- dependiendo del proceso, pues
13:10se tienen que definir estos puntos.
13:12Eh otro criterio eh para definir el
13:15proceso, pues es la cantidad eh
13:17requerida. Nosotros debemos establecer
13:20tanto una plataforma biológica eh
13:22y un proceso eh de una manera con el
13:25número de pasos suficientes para poder
13:27producir la cantidad eh necesaria de
13:30producto para cubrir la demanda, ¿no?
13:33Eh la de tanto la demanda clínica,
13:35comercial, la dosis del fármaco eh
13:38contemplando la frecuencia de
13:39administración, el tamaño del mercado,
13:42¿no? Entonces, eh
13:44pues esto se tiene que obviamente
13:45definir eh de antemano
13:49y esto al final se va a traducir en cómo
13:51establecemos cuál va a ser el volumen de
13:53producción, o sea, de cada lote, cuál va
13:55a ser la escala de los biorreactores que
13:57vamos a utilizar, el número de lotes que
13:59em requerimos eh producir al año,
14:03etcétera, ¿no?
14:05Entonces, ah
14:07pues sí sí es este punto pues bueno, sí
14:08es importante, ¿no?
14:10Eh un proceso upstream con baja
14:12productividad va a implicar eh mayores
14:14volúmenes a procesar,
14:16mayor carga eh para el procesamiento
14:18downstream y por ende eh incremento de
14:20los eh de los costos. Entonces,
14:23pues se de va uno ligado con otro, no no
14:25se pueden ver por separado.
14:27Eh por otro lado, un procesamiento
14:29downstream con baja recuperación puede
14:31requerir aumentar la producción upstream
14:33para compensar pérdidas.
14:36Eh entonces, pues sí es importante
14:38determinar de cada etapa cuáles son los
14:40rendimientos eh individuales y verlo
14:43también desde una forma de una forma
14:45global para valorar pues cuál es la
14:47mejor combinación o o el el mejor número
14:49de pasos o qué técnicas, ¿no?
14:52Eh otro punto importante es el
14:54rendimiento del proceso. Eh este es un
14:56parámetro que obviamente conte eh
14:58conecta ambas etapas, tanto el upstream
15:00como downstream.
15:02Eh el rendimiento, por ejemplo, upstream
15:04se refiere a la cantidad de producto
15:06generado por unidad de volumen o unidad
15:08de de tiempo, mientras que el
15:11rendimiento en la etapa downstream se
15:12refiere a la fracción del producto
15:14recuperado tras las etapas eh de
15:16purificación.
15:18Eh
15:20y especialmente en el procesamiento
15:22downstream es importante
15:24considerar pues el número de pasos que
15:27van a estar eh involucrados. En general
15:30eh durante el procesamiento upstream
15:31pues casi siempre
15:33o sea
15:34no varía mucho, o sea, como que sí es
15:36muy muy muy general o muy universal el
15:38proceso. Obviamente va a cambiar las
15:41condiciones dependiendo de la plataforma
15:42biológica que se utilice, pero el que es
15:44más variable es el procesamiento
15:46downstream y es como más flexible en
15:48cuanto a
15:49qué eh etapas
15:50o eh
15:52qué tipo de técnicas eh de purificación
15:55o de recuperación utilicemos.
15:58Pero es importante tomar en cuenta que
15:59en la etapa eh downstream, además de, o
16:02sea, hay un costo, ¿no? Es decir,
16:04nosotros podemos, o sea, tiene que poner
16:06una balanza entre
16:09qué tanto producto de calidad o con los
16:12atributos necesarios producimos versus
16:14el rendimiento, o sea,
16:17hay que tomar en cuenta que a mayor
16:18número de pasos va a haber una mayor
16:22probabilidad de pérdidas, mayor
16:24probabilidad de contaminación o de
16:25alguna alteración en la en la calidad.
16:27Entonces,
16:29eh
16:30se debe de llegar de se debe de llegar a
16:33un eh a un equilibrio, unas a
16:35condiciones óptimas donde se equilibren
16:37ambos ambos factores, además de los
16:40costos, ¿no?
16:42Eh entonces, por ende, al momento de
16:44querer integrar
16:46eh
16:47todo el proceso, pues se deben de
16:48contemplar eh todas las etapas, no verlo
16:51de de manera aislada, ¿no? Entonces, se
16:54debe ver de qué manera se alinean las
16:56condiciones de procesamiento upstream
16:58con los requerimientos del procesamiento
17:00eh downstream. Cómo se pueden minimizar
17:03la generación de impurezas eh desde el
17:06origen. Eh y esto, pues de nuevo,
17:08influye mucho en
17:11definir cuál va a ser la plataforma
17:13biológica, en dónde se va eh a acumular
17:16eh la proteína eh en el biorreactor,
17:19¿no? Ya decíamos que no es lo mismo si
17:21se acumula dentro de la célula o fuera,
17:23cuál es más fácil en etapas posteriores
17:25de recuperar, ¿no? Y también depende
17:27mucho de los de los por ejemplo de los
17:29medios de cultivo, de la temperatura, la
17:31agitación, todo el estrés mecánico al
17:33que pudiera exponerse exponerse el
17:36biofarmacéutico.
17:38Em
17:40También hay que ver la cuestión de la
17:43mitigación de riesgos, que esto va a
17:45riesgos relacionados con la calidad del
17:47producto.
17:49Em
17:50Que te decíamos tiene que ver con la
17:51pureza, la potencia, el perfil de
17:54glicosilación. También los riesgos
17:56relacionados con la operación del
17:58proceso.
18:00Em
18:01Que pudiera contemplar posibles fallas
18:03en los equipos.
18:05Variabilidad en las materias primas,
18:07desviaciones en las condiciones de
18:09cultivo.
18:10O sea, también de aquí de nuevo pues
18:12escoger adecuadamente la plataforma
18:14biológica, ¿no? Qué tan caros son los
18:16insumos.
18:17Em qué tanto aguanta el sistema
18:19biológico si hacemos variaciones de
18:21temperatura o de pH, ¿no? Si requiere
18:23condiciones muy estrictas de cultivo. Em
18:26pues los riesgos son mayores y esto
18:27puede implicar más costos derivados del
18:30control, ¿no?
18:32Em riesgos también a nivel regulatorio
18:34derivados de un incumplimiento en la
18:37trazabilidad, el monitoreo, la
18:39validación o el control del proceso.
18:42Em
18:44Entonces Lo vamos a ver más
18:46en la en la última unidad cuando
18:48hablemos del sistema de gestión de
18:49riesgos, pero es importante mencionar
18:51que para definir el proceso
18:54Se debe de tomar un enfoque preventivo,
18:56¿no? Donde los riesgos se identifican
18:58antes de que ocurran.
19:00Em en lugar de corregirse
19:02posteriormente, es decir, siempre se va
19:03a preferir la prevención a la
19:05corrección.
19:07Em
19:08Para esto es importante el análisis de
19:10riesgos.
19:11Em la gestión de estos, del cual uno
19:14puede hacer uso de análisis
19:16causa-efecto, diseños de experimentos en
19:18diferentes eh en diferentes escalas. Y
19:21esto de hecho es una es un requerimiento
19:22regulatorio, ¿no? Que se tenga con eh
19:25se tenga definido este sistema eh
19:28de de evaluación, análisis eh gestión,
19:32control de riesgos y revisión.
19:36Em
19:37por ejemplo, en la etapa upstream, los
19:39riesgos van a estar asociados a la
19:41biología del sistema, ¿no?
19:43Eh esto puede incluir, decíamos, pues el
19:45control del ambiente de cultivo, pH,
19:48temperatura, el oxígeno disuelto, los
19:50sistemas de alimentación de nutrientes,
19:53el uso de sensores o la automatización
19:56eh para reducir la variabilidad o el
19:57error humano,
19:59eh y evitar todas estas eh condiciones
20:02que pueden eh desviar la calidad los
20:04atributos de calidad del eh del producto
20:06que se obtenga.
20:08Eh favorecer
20:10la selección de plataformas eh
20:12biológicas que sean más robustas, es
20:13decir, líneas celulares, por ejemplo,
20:15que sean más estables, eh que tengan eh
20:18medios de cultivo que minimicen la eh la
20:20variabilidad eh metabólica, que sean más
20:22fáciles, más sencillos de controlar y de
20:24producir. Eh esto, por ejemplo, es como
20:27si recordamos la parte de eh el cultivo
20:29eh los requerimientos eh de nutrientes
20:32de las células de mamífero que muchos
20:34necesitan suplementación eh con sueros
20:37animales y que pues también el estado
20:39del animal del que se obtiene el suero
20:41va a influir en el resultado. O sea,
20:42obviamente, pues
20:44esto pues obliga a la industria
20:45farmacéutica a buscar alternativas eh
20:48libres de compuestos animales, pues para
20:50reducir justamente esta esta
20:51variabilidad o también el control de la
20:53contaminación.
20:55Eh evitar o prevenir la contaminación eh
20:57ya sea de microorganismos o de
20:59partículas virales,
21:01pues también implica eh cómo va a estar
21:04eh la disposición eh
21:06o sea, tanto la localización, toda la
21:08parte de logística, ¿no? Dónde está
21:09ubicada cada etapa, que entonces se
21:11tiene que mover de un espacio a otro, el
21:13uso de sistemas cerrados, eh
21:16eh que no permitan eh la entrada de
21:18microorganismos, procesos de limpieza
21:20validados y de esterilización.
21:23Eh este, por ejemplo, es un eh esto
21:24cuestión de los eh de la contaminación,
21:27pues es uno de los riesgos eh más
21:28críticos, porque también decíamos
21:31eh
21:34pues la mayoría de los de farmacéuticos
21:36son productos estériles, entonces pues
21:37con más razón se debe de eh
21:41se debe asegurar esta esterilidad, ¿no?
21:43En la etapa downstream, los riesgos van
21:45a estar asociados con la remoción
21:47eficiente de las impurezas impurezas y
21:50la consistencia eh del proceso de
21:52purificación.
21:54De aquí vuelvo a este punto eh de
21:56utilizar eh diseños o métodos
21:58ortogonales, es decir, diseñar
22:01secuencias de purificación donde cada
22:03etapa elimine impurezas mediante
22:06mecanismos distintos.
22:09Eh
22:10decíamos que pues por la carga, por la
22:12afinidad, por el peso, la solubilidad,
22:16eh utilizar estos enfoques eh para
22:18empezar reduce la dependencia de una
22:21sola etapa.
22:23Eh y además aumenta la robustez eh
22:25global del proceso y da esa seguridad de
22:27que de verdad ya se tomaron todas las
22:29medidas posibles para que el producto
22:32pues tenga la pureza suficiente, ¿no?
22:35Eh pero pues también de nuevo con un
22:36equilibrio eh en los costos.
22:40Eh entonces, por ejemplo, para eliminar
22:42partículas virales de un sistema de
22:43células de mamífero, se pueden u-
22:46incorporar, perdón, eh múltiples etapas
22:48de remoción o de inactivación viral, ya
22:51sea filtración, algún tratamiento
22:52químico, una cromatografía eh
22:55específica. Entonces, esto también nos
22:57va a dar esa seguridad de que si alguna
22:58etapa falla
23:00parcialmente,
23:02sabemos que
23:04hay etapas posteriores que pueden
23:05compensar eh pues estas eh pues estas
23:08pérdidas, nuestras fallas de del
23:10control.
23:12Eh también hay que considerar eh pues el
23:16tipo de equipos que se vayan a utilizar,
23:18la escala, qué tan fácilmente
23:20controlables eh son o o sea que se
23:22puedan monitorear, eh que sean también
23:24de eh de mantener. Eh por ejemplo, el
23:27pH, o sea, parámetros como el pH, eh la
23:30conductividad, el flujo en la en las
23:33columnas cromatográficas, pues deben de
23:35mantenerse en rangos estrictos para
23:37evitar pérdida de resolución o
23:39capacidad. Entonces, esto es algo que
23:40también se tiene que eh estandarizar y
23:42validar y demostrar esa vali esta esa
23:45validación previamente.
23:48Eh
23:50y bueno, como también ya habíamos
23:52mencionado, pues todos estos em
23:55estos atributos de calidad, pues se
23:57deben eh de mantener durante el todo el
23:59ciclo de vida. Decíamos que
24:01eh el ciclo de vida del producto, pues
24:04contempla pues la etapa de investigación
24:06y desarrollo, que es aquí donde pues se
24:09define cuál es la viabilidad técnica. Eh
24:12y aquí es en esta etapa donde se define
24:14cuál va a ser el proceso, cuáles van a
24:16ser las especificaciones o atributos
24:18importantes eh del producto y ya se debe
24:22desde esta etapa se debe de ir
24:23contemplando
24:24a okay, yo puedo proponer esta este
24:26proceso, pero tengo ya que ir viendo más
24:29allá de pues si es escalable o si es
24:30rentable, ¿no?
24:32Eh en las etapas eh preclínicas y
24:35clínicas, pues lo que se ahí es donde
24:37justamente ya se empieza a evaluar eh la
24:39consistencia durante el proceso de
24:41escalamiento.
24:42Eh
24:44y en la producción comercial, pues se
24:46pueden eh o sea, se debe de asegurar que
24:49pues los costos y la robustez eh sea
24:51suficiente pues para que el producto se
24:53sea eh sea bla sea viable, perdón.
24:59Eh, entonces esto implica que el definir
25:02el di el diseño del proceso debe
25:03anticipar necesidades futuras,
25:06especialmente en términos de
25:07escalabilidad y de adaptabilidad.
25:12Y bueno, en en esta tabla eh se muestra
25:15esta tabla eh la la copié del libro de
25:18Gunter Jaxis que tiene pues un enfoque
25:20más de eh pues ingeniería en cuanto a
25:23las etapas del diseño del proceso.
25:25Eh, aquí bueno, definen cuáles son eh
25:28los objetivos principales tanto del
25:29procesamiento upstream y downstream.
25:32Eh, como ya eh ya deben de saber, pues
25:34el procesamiento upstream pues está
25:36relacionado principalmente con la
25:38biosíntesis o la obtención eh pues del
25:40producto, que en este caso va a ser el
25:41principio activo, la biomolécula,
25:44proteína recombinante, molécula de ácido
25:46nucleico que va eh a conformar el
25:48medicamento. Mientras que el
25:50procesamiento downstream está enfocado
25:53eh principalmente en recuperar o separar
25:56el producto eh o el API, que se acuerdan
25:59que nos referimos a eh pues al principio
26:01activo,
26:03eh de la matriz eh biológica,
26:06recuperarla y eventualmente eh
26:08purificarla, ¿no?
26:10Entonces, eh por ende, bueno, aquí
26:12obviamente conservando, decíamos, el can
26:15para, o sea, establecer los sistemas que
26:18permitan en el procesamiento downstream
26:20producir la suficiente el suficiente eh
26:23principio activo para eh para cubrir la
26:25demanda,
26:27eh precisamente posteriormente en el
26:29procesamiento downstream recuperarlo,
26:32manteniendo los atributos eh críticos de
26:34calidad y eh
26:37junto con eh la cali eh o sea, la
26:39calidad junto con la cantidad, ¿no?
26:42Eh, entonces, pues para cumplir todos
26:44estos eh estos objetivos, pues decíamos
26:46que todos los métodos y herramientas que
26:48se utilicen eh tanto para la separación
26:50para la purificación, obtención y el
26:52análisis deben ser eh escalables. Esto
26:56eh va a implicar, por ejemplo, en el
26:57procesamiento upstream que utilicemos
26:59células que sean capaces de sintetizar
27:02el producto con las modificaciones
27:04postraduccionales o los atributos
27:06estructurales que necesitamos. De aquí
27:08decíamos esta parte modular de si eh o
27:11sea, el que el decir que ciertas
27:12proteínas no se pueden producir, por
27:14ejemplo, eh en bacterias o en levaduras
27:16porque van a ser monoimunogénicas, o
27:18sea, que casi siempre se utilizan
27:20plataformas de plataformas de mamífero.
27:23Además eh que
27:25esa plataforma tenga eh pues la
27:27infraestructura o la forma de trabajo
27:30adecuada para que se produzcan de manera
27:33eh consistente durante todo el ciclo de
27:35vida, o sea, que este puede ser,
27:36decíamos, desde la etapa de
27:37investigación y desarrollo hasta que se
27:39retire el producto del mercado, pues
27:40pueden pasar años, si no es que décadas.
27:43Entonces, ¿cómo vamos a eh asegurar, por
27:46ejemplo, eh al resguardo eh de la línea
27:50celular recombinante, ¿no? O sea, el
27:52manejo apropiado de los bancos
27:53celulares. Eh ¿cómo se va a estar
27:55monitoreando que la modificación
27:57genética siga a lo largo de los lotes,
27:58¿no?
28:00Eh y pues además, pues establecer
28:02estrategias de cultivo de optimización
28:04apropiadas del biorreactor para producir
28:06el el principio activo en las cantidades
28:08suficientes, ¿no?
28:10Eh en la etapa downstream también, pues
28:12eh todo esto de esto va a implicar que
28:15se implementen métodos que permitan
28:17extraer y separar la proteína eh pues de
28:21pues de posibles eh contaminantes
28:24que tienen que ver, o sea, contaminantes
28:26relacionados tanto eh con el proceso, o
28:29sea, la plataforma biológica, también
28:30relacionadas eh separar
28:33eh
28:34impurezas relacionadas con el producto,
28:36o sea, productos, perdón, proteínas, por
28:38ejemplo, que tengan propiedades
28:39fisicoquímicas eh similares o variantes
28:42eh de de eh pues sí, variantes de la
28:46proteína, isoformas, etcétera, ¿no?
28:49Estable, utilizar métodos que permitan
28:52eh remover todo el material particulado
28:56y otras eh impurezas eh que puedan
28:59interferir en etapas eh eh posteriores,
29:02¿no?
29:08Y bueno, otro punto importante eh para
29:10definir eh el proceso, decíamos pues
29:12también van a ser eh los costos de
29:15producción y esto va a estar íntimamente
29:18relacionado con eh
29:21pues la demanda, ¿no? O sea, en
29:24en general eh yo pues sí podemos decir
29:26que eh a nivel industrial se deben
29:29implementar medidas que permitan que eh
29:31pues el producto sea eh rentable. Aquí,
29:34por ejemplo, en esta
29:35en esta figura se hace un estimado, ¿no?
29:38De cuánto cuesta eh el producto por
29:42unidad, eh unidad de producto
29:44dependiendo de el grado de productividad
29:47del lote.
29:48Eh
29:49o bueno, el grado en general de
29:50producción al año, ¿no? Entonces,
29:52podemos ver que eh los costos van
29:54disminuyendo mientras una se, mientras
29:57se tenga una mayor producción.
30:00Y aquí podemos ver pues que en muchos de
30:01estos eh productos, especialmente en los
30:05anticuerpos monoclonales, pues esto, o
30:07sea, los que estén en esta área van a
30:08ser eh muchísimo más rentables, ¿no?
30:11Pero tiene mucho que que ver también con
30:12la eh
30:15pues con la aplicación, cuál es el
30:16mercado, ¿no? Si nos vamos, por ejemplo,
30:18aquí en dónde están los costos
30:20de, por ejemplo, el factor 8
30:21recombinante, que es para tratar
30:23desórdenes eh de la coagulación como la
30:26hemofilia, pues decíamos que esta es una
30:29enfermedad que no tiene tanta incidencia
30:31eh en la población, entonces, pues en
30:34esos casos pues no va a ser necesario
30:36generar
30:37eh
30:38tanta cantidad eh de producto al año.
30:40Mientras que si nos vamos acá, pues
30:42tenemos muchos de los muchos anticuerpos
30:44eh monoclonales que se utilizan, por
30:46ejemplo, para enfermedades eh para el
30:48cáncer o enfermedades eh crónicas o
30:51enfermedades inflamatorias o
30:53autoinmunes. Eh que pues estos están
30:56dirigidos eh pues a una a una población
30:59mayor, entonces pues sí se puede
31:01reducir los costos eh lo suficiente o
31:03bueno, como tienen más demanda, eh
31:06optimizar eh de manera que pues los los
31:09costos sean eh sean menores, ¿no? Aquí,
31:11por ejemplo, viene eh incluidas las eh
31:14las insulinas que pues también son eh un
31:16producto que tiene mucha demanda, ¿no?
31:18Entonces, pues lo ideal sería que
31:20estuviéramos más en esta zona, pero pues
31:22hay que ser conscientes que hay algunos
31:23fármacos que que pues tal vez tal vez no
31:25cumplan con estos requerimientos, pero
31:28pues debe de llevarse un equilibrio,
31:30¿no? Donde pues sí sea si sea rentable.
31:36Entonces, eh en esta tabla, por ejemplo,
31:39se representan cuáles suelen ser eh pues
31:41los requerimientos de producción eh
31:43anuales de diferentes eh tipos de de
31:46producto, ¿no?
31:48Eh
31:50aquí, como decíamos, factores de
31:52coagulación, eh eritropoyetina,
31:55interferones que van a estar dadas para
31:57pues enfermedades muy muy específicas.
32:00Eh pues tal vez no sea necesario cubrir
32:04tanta tanta demanda, por ejemplo, aquí
32:05estamos hablando de 5 kg al año versus
32:08otros productos que necesitamos, o sea,
32:10ya en el orden eh de toneladas, ¿no?
32:12Como las insulinas, eh algunas
32:15inmunoglobulinas, es decir, eh
32:16anticuerpos eh anticuerpos monoclonales.
32:19Y pues de ahí viene derivada cuáles
32:21pudieran ser eh cuáles pudieran ser las
32:24eh las ganancias.
32:30Y bueno, en esta figura eh se representa
32:33cuál es el impacto que tiene el número
32:36de pasos involucrados en el
32:38procesamiento downstream, cuál es el
32:40impacto que tiene eh con los eh
32:43rendimientos o la cantidad de producto
32:45que se puede recuperar. Ya había
32:47mencionado que pues a mayor número de
32:49etapas eh pues hay una mayor
32:52probabilidad eh probabilidad de
32:54pérdidas, ¿no? De eh del de la cantidad
32:57de producto que se puede recuperar y
32:58esto pues se ve evidenciado en esta
33:01eh en esta gráfica. Obviamente pues hay
33:03al hay un punto de variación va a
33:05depender mucho eh del producto que
33:06estemos purificando
33:08y cuáles son las estrategias que eh que
33:10se utilizan, pero en general sí
33:12podríamos decir que eh pues a
33:14mayor número, o sea, que estamos
33:16hablando de podemos ver pérdidas de este
33:18más de eh el 50%. Entonces se tiene que
33:21valorar es este equilibrio, ¿no? Entre
33:24si estos rendimientos, por ejemplo, esta
33:26cantidad de pérdida eh aún así pues
33:29alcanza para cubrir la demanda, pero con
33:31esto alcanzamos a generar un producto
33:33con los atributos de calidad necesaria,
33:34pues es algo que se pueda sopesar o que
33:37sea algo que sea algo rentable, pero si
33:39no tuviéramos que irnos a un menor
33:41número de pasos y establecer, o sea,
33:44pues de manera más crítica cuáles serían
33:46los pasos eh cruciales o los pasos más
33:48importantes para obtener el producto
33:50purificado.
33:54Eh esta figura básicamente lo que busca
33:56es eh explicar esta parte de eh la
33:59integración eh del proceso, ¿no? O sea,
34:02decíamos que tanto el procesamiento
34:04upstream como el downstream no se deben
34:06de ver eh de manera aislada, que uno va
34:08a influir eh o sea, o sea, va de forma
34:11eh secuencial y cada paso influye al
34:13paso siguiente, ¿no?
34:15Eh para empezar es eh también un punto
34:18importante tiene que ver eh con el
34:21qué tan bien eh caracterizado o qué
34:24tanto conocimiento ya se tiene
34:25registrado tanto del producto como de
34:27los posibles eh procesos. Aquí, por
34:30ejemplo, la indicación médica y los
34:32mecanismos de acción eh del
34:33biofarmacéutico van a definir cuáles van
34:37a ser los atributos críticos de calidad,
34:39no sea el conocer muy bien cómo se
34:41cuáles son las propiedades
34:41fisicoquímicas del producto va a definir
34:45cuáles van a ser las
34:47los procesos más viables para su
34:49producción.
34:51Aquí por ejemplo pues se menciona de
34:53nuevo esto que aquí integra el
34:54procesamiento upstream con el
34:55downstream, esto pues puede implicar
34:59anticiparse no cuáles pudieran ser los
35:01riesgos asociados en el procesamiento
35:04downstream que pudieran evitarse desde
35:05el procesamiento upstream,
35:08tratar de considerar pasos de
35:10purificación muchos más sencillos,
35:14universales incluso que en el caso que
35:16pudiéramos darle cierta
35:18flexibilidad.
35:21Algo más algo más genérico de lo que se
35:23tenga pues que ya esté pues técnicas que
35:27estén más validadas, no sea no tratar de
35:29no meter. Soluciones
35:32o pasos de producción tan tan
35:34específicos no porque eso también podría
35:36generar un problema.
35:38A futuro no por ejemplo al momento de.
35:42Pues de enfrentarse con pues con algunos
35:44retos no.
35:45Utilizar espacios de diseño
35:48que sean robustos y que sean fáciles de
35:50entender, tratar
35:52de simplificar la forma en la que se
35:53monitorean los lotes etcétera, o sea hay
35:56muchas formas en las que pues.
36:00Em.
36:01Pues se pueden prevenir.
36:03O pueden ayudar al espacio al espacio de
36:05diseño no.
36:07Aquí también la parte del análisis y la
36:10gestión de riesgos, tener bien
36:12caracterizado cuál es va a ser el perfil
36:14de impurezas, saber cuál es qué es lo
36:16que puede estar ahí presente, qué
36:17estrategia vas a implementar para
36:20eliminarlo.
36:21Definir y optimizar la secuencia y pasos
36:26a seguir, etcétera.
36:31En esta tabla eh se resumen cuáles son
36:35eh los los objetivos claves tanto en la
36:37etapa upstream y downstream.
36:40Eh decíamos que
36:44la etapa upstream pues se encarga
36:45principalmente eh de la biosíntesis,
36:47entonces pues aquí es donde tenemos eh
36:50todos estos puntos relacionados eh con
36:52el cultivo. Decíamos que pues el
36:54objetivo es
36:56generar eh pues el biofarmacéutico, el
36:58principio activo en la cantidad
37:00suficiente y con los atributos
37:02necesarios en términos pues en eh pues
37:04la proteína bien plegada, con las
37:06modificaciones eh postraduccionales eh
37:09adecuadas, o sea, que sea lo más eh
37:11parecido, o sea, pues ahí al producto
37:13que queremos obtener. Aquí vienen
37:15resumidas cuáles son algunas eh pues de
37:17las técnicas, bueno, en este caso
37:18plataformas biológicas eh que más se
37:20utilizan, decíamos de plataformas de
37:22mamífero a eh levaduras y
37:26y bacterias.
37:27Y pues se mencionan pues algunos retos,
37:29cosas que se deben eh o sea, que deben
37:31tomar en cuenta a la hora de definir
37:33las etapas de esta perdón, los los
37:35los pasos de esta etapa, ¿no?
37:37Eh
37:39una síntesis robusta, que de buenos
37:41rendimientos,
37:42simplificando pues tiempos de cultivos
37:45eh menores y también de una manera que
37:47se pueda eh simplificar el procesamiento
37:49downstream y esto tiene mucho que ver
37:51con el hecho de que se pueda, o sea, de
37:53la eh principio activo va a estar dentro
37:55o fuera de la célula, ¿no?
37:57Eh en el procesamiento eh downstream
37:59decíamos que podríamos eh dividirlo en
38:02etapa en la etapa de recuperación y en
38:04la de purificación y a su vez estas se
38:06dividen en subetapas, ¿no? La de
38:08recuperación pues tiene que ver con eh
38:11aislar el producto eh del material eh
38:14biológico que tendría que ver con la
38:16recuperación, o sea, la colecta
38:18eh o harvest y eh la clarificación. Eh
38:22entonces para esto se pueden utilizar eh
38:24técnicas pues más sencillas,
38:26generalmente técnicas en
38:28en su mayoría físicas como eh la
38:31centrifugación o la filtración. Eh se
38:33pero también se puede utilizar
38:34precipitación, eh floculación con eh
38:37pues el objetivo de aislar pues los eh
38:41material particulado, restos celulares
38:44eh que van a
38:46eh permitir preparar eh la muestra en el
38:50sistema en el que está embebido eh esta
38:52muestra pues para etapas más finas eh de
38:54la de la purificación.
38:56Eh aquí pues los retos principales es
38:59pues no tener pérdidas en cuanto a
39:01cantidad, mantener eh la actividad
39:04biológica
39:05eh y minimizar la generación eh de
39:08impurezas eh relacionadas eh con el
39:12producto, es decir, que pues la proteína
39:13pues por ejemplo se empiece a
39:15eh
39:17a desplegar o
39:19sí, o sea, que
39:21que se desnaturaliza, etcétera, ¿no?
39:23Eh luego tenemos la etapa de
39:25purificación que pues involucra eh
39:28procesos de captura, remoción, pulido.
39:30Captura pues tiene que ver
39:31principalmente con eh
39:33técnicas cromatográficas, aunque pues no
39:36es la única etapa en la que se utiliza
39:37cromatografía como podemos ver aquí.
39:39Eh
39:41remoción de contaminantes, por ejemplo,
39:43partículas virales y también tiene que
39:45ver etapas eh de formulación, ¿no? Eh la
39:48liofilización, la adición de
39:49excipientes, esterilización, etcétera.
39:52Entonces pues también aquí algunos eh
39:54puntos eh importantes pues les decíamos
39:56remover
39:58eh contaminantes que tengan propiedades
40:00fisicoquímicas muy parecidas eh a las
40:03del producto eh y siempre pues tratando
40:06de conservar eh los rendimientos y la
40:10actividad biológica del pues del
40:12producto que estamos purificando.
40:16Y bueno, en esta tabla muestran eh se re
40:19se mencionan algunas eh algunas
40:22impurezas que pueden estar presentes
40:25durante el bioproceso y que al final
40:28pues no queremos que estén presentes en
40:30nuestro producto terminado. Eh ya
40:32habíamos mencionado que puede haber
40:34impurezas relacionadas con el producto e
40:36impurezas relacionadas con el proceso.
40:39Entonces, las que tienen que ver eh con
40:41el producto pues van a tener desde la
40:43etapa eh upstream pues van tienen que
40:46ver con eh pues aquellos eh insumos
40:49necesarios para el cultivo, o sea, los
40:51componentes del medio de cultivo,
40:53proteínas eh
40:55de o sea, proteínas derivadas eh del
40:58hospedero, de la plataforma biológica,
41:00endotoxinas, restos como de la pared
41:03celular, eh ADN, otros ácidos nucleicos,
41:06hm partículas eh pues virales que
41:09pudieran estar eh presentes como un
41:11producto de eh contaminación.
41:15También podríamos hablar de em
41:20resinas eh cromatográficas que pueda
41:22haber fugas, también esto es esto es un
41:24punto importante eh de cómo se debe de
41:26estar eh monitoreando eh el proceso y
41:28garantizar el mantenimiento apropiado eh
41:31apropiado de los equipos. Eh las
41:34columnas cromatográficas también tienen
41:35una vida eh finita y llega un punto en
41:38el que pues la resina puede estarse eh
41:40liberando, o sea, la fase estacionaria
41:41se empieza como a disgregar
41:44y se libera eh en el producto, ¿no? En
41:46la fase móvil, entonces eh pues es algo
41:48que también se tiene eh que monitorear.
41:52Y por tanto también por otro lado,
41:53perdón, las impurezas relacionadas con
41:55el producto pues tengan que ver,
41:57decíamos, con
41:58eh agregados, o sea, de la misma
42:01proteína, proteína mal plegada,
42:03variantes desaminadas, productos de
42:05oxidación,
42:06eh productos de degradación. Entonces,
42:08aquí estas también son importantes eh
42:11porque, decíamos, son justamente estas
42:12impurezas las que suelen tener
42:14propiedades fisicoquímicas muy
42:16similares, pues, a las del producto, a
42:17las del producto, ¿no? Entonces,
42:20¿qué medidas o qué técnicas, eh, de, eh,
42:22de separación podemos implementar, pues,
42:24que nos permitan discriminar de, de
42:27estas, eh, de estas impurezas? Porque al
42:28final, por ejemplo, estos los agregados
42:31de proteína,
42:32pues, pueden ser, eh, pueden ser
42:33inmunogénicos o pueden estar, eh,
42:36sobreestimando la cantidad hm, de
42:39producto biológicamente activo que
42:40tengamos. Entonces, em,
42:43pues, sí, es algo que también, eh, pues,
42:45no se debe de perder de vista
42:47durante, eh, pues, el proceso de
42:49purificación.
42:53En esta tabla, eh, se listan algunos
42:55riesgos asociados durante, eh,
42:57procesamiento, eh, downstream, cuáles,
42:59eh, pues, suelen ser los, eh, los más
43:01comunes.
43:02Eh, aquí, pues, eh, relacionados,
43:04principalmente, eh, con el perfil de
43:06impurezas o contaminantes que puedan
43:08estar presentes en nuestro producto
43:10terminado y, pues, qué, eh, bueno, ¿cuál
43:12es el riesgo?
43:14Eh,
43:15es decir, pues, las consecuencias que
43:17tienen que ver, por ejemplo, eh, pues,
43:20con la variabilidad del producto,
43:22pérdida, eh,
43:25o sea, en cuanto a rendimientos, pero
43:27también están enfocadas, principalmente,
43:29en la seguridad, ¿no? Por ejemplo, eh,
43:31infección, perdón, contaminación, eh, de
43:33los medios de cultivo con micoplasma,
43:35principalmente, en, en medios de
43:37mamífero, pues, tiene que ver con
43:39riesgos de seguridad, eh, para el
43:42paciente, ¿no? Igual lo mismo de, eh, de
43:45contaminación viral,
43:46eh, o la presencia, eh, de endotoxinas,
43:49¿no?
43:50Y viene, pues, algunas estrategias, eh,
43:52de mitiga, de mitigación que se pueden
43:54implementar y que, pues, tienen que ver
43:56así de cuáles son las técnicas, eh,
43:59más confiables, pues, para evitar esto,
44:02¿no? Podemos irnos desde diferentes, eh,
44:04tipos de cromatografía,
44:06eh, el uso de filtros,
44:09eh, etcétera, ¿no? Y aquí vienen por
44:11prioridades, eh, viene de, o sea, desde
44:13la más, eh, pues la preocupación más
44:15grande, como la, pues las menos, eh,
44:18importantes, ¿no?
44:19Eh, entonces, pues también dependiendo
44:21de cuál pudiera ser, pues hay que, hay,
44:23habrá algunas, em,
44:25técnicas que sea necesario, eh,
44:27implementar para evitar esto. Entonces,
44:29volvemos de nuevo a esta parte de
44:31utilizar, eh, diseños, o bueno, técnicas
44:34ortogonales, o sea, que, eh,
44:37de muchas maneras, eh, utilizando
44:39diferentes técnicas nos aseguremos de
44:41que, pues, estemos removiendo esta serie
44:42de,
44:43eh, de contaminantes.
44:48Okay, entonces, ya que hemos mencionado,
44:49eh, pues, las consideraciones, eh, todo
44:52lo que hay que tomar en cuenta para
44:54definir cuál va a ser, eh, todo, eh, el
44:57bioproceso para la generación,
44:59producción, eh, de un, eh, de un
45:01biofarmacéutico, eh, pues, ahora vamos a
45:04ver cuáles, pues, son las técnicas que
45:05se puedan utilizar o cuál suele ser, em,
45:08cuáles suelen ser las configuraciones,
45:10eh, más comunes.
45:12Em, de aquí, retomando un poquito la
45:14pregunta, eh, de al inicio del video
45:16sobre, pues, si existe, eh, pues, algún,
45:20em, algún procedimiento, pues, universal
45:23o único, eh, para la producción de los
45:25biofarmacéuticos. Obviamente, la
45:27respuesta es no, depende mucho, como ya
45:28decíamos, pues, el, em,
45:32Yo aquí podría decir que tanto el
45:34proceso va a definir el producto, como
45:36también el producto va a definir el
45:38proceso.
45:39Eh, el proceso define al producto
45:40porque, pues, todo lo que implementemos
45:42va a tener consecuencias en el producto
45:43terminado, pero también la selección de
45:45las técnicas, eh, que utilicemos, pues,
45:48van a ser, eh, van a estar delimitadas,
45:51pues, por el producto que queramos,
45:53queramos generar. O sea, tan sencillo
45:54como que si queremos una proteína
45:55glicosilada, necesitamos una plataforma,
45:58probablemente, de mamífero, entonces,
45:59pues, de ahí todas las consideraciones
46:01para el procesamiento,
46:03para el procesamiento upstream, ¿no? Y
46:04esto em, a a su vez influye en el
46:06procesamiento downstream.
46:08Pero eh es o sea, al final no podemos, o
46:11sea, cada proceso es único, depende pues
46:13o sea, eh debe de hacerse pues digamos
46:15un análisis o de una definición eh caso
46:18por caso,
46:20pero pues sí podríamos eh encontrar eh
46:23puntos en común
46:25eh o enfoques en generales, ¿no? Para
46:29pues poder definir eh el proceso.
46:32Aquí eh en la figura que se muestra en
46:34la diapositiva, pues viene un esquema
46:36muy muy general,
46:39eh pero de nuevo, pues esto puede esto
46:41puede cambiar, ¿no?
46:44Eh aquí eh en esta figura, pues están
46:46integradas
46:47tanto eh las etapas upstream como eh
46:51como downstream. La etapa upstream, pues
46:53sería pues hasta acá,
46:56donde termina eh la producción en el
46:57biorreactor y pues tiene que ver con
46:59todo el manejo del material biológico,
47:02eh pues el cultivo, los inóculos, el
47:04escalamiento
47:06y eventualmente pues la la generación
47:08del producto. Y vamos a tener como
47:10resultado nuestro producto en una eh
47:12matriz biológica, ya sea en un caldo de
47:14cultivo o dentro de las células.
47:16Aquí terminaría el procesamiento
47:18upstream y eh continúa el downstream,
47:20que tiene que ver, decíamos, con las
47:22etapas involucradas en la recuperación y
47:25en la purificación.
47:27Y esto pues va desde el cell harvesting
47:29o la colecta,
47:31eh
47:33algunas eh técnicas o como viene aquí,
47:36pasos de purificación de baja
47:38resolución, donde pues se van a enfocar
47:40principalmente en remover eh material
47:43soluble del insoluble. Eh aquí también,
47:46creo que ya lo había mencionado eh
47:47alguna vez, pues en medida de lo posible
47:50se debería eh es más fácil eh es más
47:52práctico también eh para o sea, para
47:55manejar que nuestro eh producto esté se
47:59encuentre de manera soluble, es más
48:00fácil, hay menos pérdidas, es más fácil
48:02de controlar, aunque pues esto no quita
48:04que pueda haber alguna etapa donde se
48:05juegue justamente con la solubilidad y
48:07que puede pudiera haber algún paso, por
48:09ejemplo, eh de floculación o de
48:11precipitación.
48:13Pero en general, eh pues tratar de
48:14mantener el producto de forma de forma
48:16soluble. Entonces, las primeras etapas
48:18de procesamiento downstream tendrían que
48:19ver con la remoción de material
48:21particulado y después pasaríamos a a la
48:25etapa eh pues de purificación de alta
48:27resolución, donde casi siempre se
48:30utilizan eh de dos a tres técnicas
48:32cromatográficas. Por ejemplo, aquí
48:33mencionan una como una cromatografía y
48:36luego una cromatografía eh de pulido.
48:38Ahorita vamos a hablar también eh más
48:39específico de estas etapas. Eh pero
48:41también, como ya habíamos mencionado,
48:43también hay etapas que tienen que ver
48:44para eh la inactivación y remoción eh de
48:47partículas virales,
48:50eh la concentración eh del producto,
48:53técnicas de filtración y estas, por
48:55ejemplo, estas etapas que tienen que ver
48:57con la formulación. Y esto también hay
48:58que considerar si el producto va a ser
49:01eh liofilizado o va a estar eh pues, o
49:05sea, se va a formular eh como un
49:07producto eh soluble. Entonces, esto
49:09también pues impacta en el número de
49:10pasos que van a estar presentes.
49:13¿Sí? Y todo esto nos va a llevar a
49:15obtener el producto terminado.
49:18Eh más o menos ese sería un esquema
49:19general,
49:21pero por ejemplo, eh técnicas
49:22cromatográficas pues puede haber de
49:23diferentes tipos, aquí no nos
49:25especifica, también puede haber más de
49:26una eh un tipo de cromatografía, tanto
49:29de forma general como de cromatografía
49:31eh de pulido.
49:33También eh técnicas de filtración se
49:36pueden utilizar varias
49:38a lo largo de todo el procesamiento eh
49:41downstream.
49:42Eh aquí lo a lo que quiero llegar con
49:44esto es que eh pues el orden o el número
49:47de pasos pues de nuevo va a depender eh
49:50pues del producto, del perfil de
49:51contaminantes que pudieran estar
49:52presentes, si el producto
49:55sale de la etapa downstream en el caldo
49:58de cultivo o está dentro de las células.
50:01Aquí, por ejemplo, es obviamente si está
50:02dentro de las células, pues hay que
50:03incluir pasos de lisis celular.
50:07Entonces, de manera muy general
50:08podríamos clasificarlo así, pero en
50:10realidad pues el proceso
50:12va a variar. Entonces, esto es lo que
50:15vamos a ver en
50:16vamos a ir viendo a lo largo de las
50:18diapositivas.
50:22Entonces, el procesamiento upstream
50:24comprende todas las operaciones
50:26necesarias para la generación del
50:28biofarmacéutico a partir de un a partir
50:31de un sistema biológico. Esta etapa va a
50:35abarcar desde, bueno, la selección del
50:38sistema de expresión, o sea, lo que
50:40veíamos en en el video anterior, pero
50:43esto más bien tiene que ver con la etapa
50:44de investigación y desarrollo, pero
50:45desde ahí comienza, o sea,
50:48esa concepción pues influye en el
50:49procesamiento upstream, ¿no? Hasta la y
50:52termina el procesamiento upstream hasta
50:54la producción del producto en el
50:56biorreactor
50:58bajo condiciones controladas.
51:01El objetivo general o el más importante
51:03del procesamiento upstream decíamos que
51:05es maximizar la producción de la
51:07biomolécula, obtener la mayor cantidad
51:09pues del del bioproducto, o sea,
51:11producto posible, manteniendo al mismo
51:14tiempo eh
51:15la calidad del producto, o sea, que esté
51:18que sea biológicamente activo
51:20y también mantener la viabilidad
51:23celular, o sea, que las células estén
51:25vivas durante el proceso porque pues
51:27recordemos que cuando las células mueren
51:29pues se pueden liberar proteasas en el
51:31medio de cultivo, pues hay un estrés que
51:33pues también va
51:34eh puede influir
51:37pues en el producto terminado, ¿no?
51:39Eh aquí también hay que tomar en cuenta
51:41que conciliar todas estas cuestiones de
51:44rendimientos, viabilidad celular y
51:45calidad pues suelen ser eh pues
51:48competitivos entre sí.
51:50Eh esto pues nos va a obligar a
51:51establecer condiciones óptimas que
51:53equilibren todos estos puntos, ¿no? El
51:55crecimiento celular, la productividad y
51:57la estabilidad. Se debe de pues mantener
52:00en una en una balanza.
52:02Em
52:04aquí pues también recordemos que la
52:05calidad del producto va a definirse en
52:08gran medida en esta etapa, no en el
52:11procesamiento downstream.
52:12Es decir, que las decisiones que tomemos
52:14en la etapa upstream
52:16eh
52:18las oportunidades de mejora que pudiera
52:20haber en esta etapa y los riesgos a a la
52:23calidad del biofarmacéutico
52:25eh suelen eh
52:29organizarse
52:31eh pues a nivel eh por ejemplo
52:34a nivel celular
52:37a nivel de la expresión del producto
52:41y a nivel de las condiciones de cultivo.
52:45Entonces, cada eh nivel, que es los que
52:47viene expresado aquí en la en la figura,
52:50cada etapa, o sea, cada uno de estos
52:52niveles va a introducir fuentes eh de
52:54variabilidad
52:56y pues por lo tanto también
52:57oportunidades eh pues de control eh o de
53:00monito- de monitoreo que van y a
53:02impactar directamente en los atributos
53:06eh de calidad del producto terminado.
53:09Por ejemplo, eh a nivel celular, la
53:12calidad eh del biofarmacéutico vemos
53:15pues que va a comenzar con la selección
53:17y caracterización en la plataforma de eh
53:20expresión.
53:21Em
53:23ya decíamos que
53:27en cuanto a
53:29la selección de la plataforma biológica
53:31también hay que tomar en cuenta pues
53:34que se seleccione adecuadamente, por
53:36ejemplo, las clonas que estén más
53:38estables y bien caracterizadas.
53:41Eh también influye eh cómo se
53:44establezcan bancos celulares robustos,
53:47ahorita lo vamos a mencionar, o sea,
53:49cómo vamos a asegurar que ya una vez que
53:51generamos una línea celular que genera
53:54el producto que nosotros queremos, cómo
53:56lo vamos a mantener a lo largo de todo
53:58el ciclo de vida del producto, o sea,
53:59que sea consistente a lo largo de los
54:01lotes, y obviamente el banco celular
54:02influye mucho en esto.
54:04Porque reduce la variabilidad y facilita
54:08también el cumplimiento regulatorio, o
54:10sea, que nosotros podamos asegurar que
54:11deben tener los mismos atributos eh pues
54:13nos ayuda a mantener el registro
54:15sanitario.
54:16Una mala selección eh de la línea
54:18celular puede eh implicar o introducir
54:22riesgos difíciles de corregir eh
54:24posteriormente.
54:25Porque si obtenemos seleccionamos una
54:28línea
54:30eh celular que no sea estable, pues por
54:32más etapas o estrategias downstream que
54:34queramos implementar, pues nada de eso
54:36va a corregir eh por ejemplo, pues si
54:38tenemos mucha variabilidad o mucha
54:40heterogeneidad en la en la producción a
54:42nivel upstream, ¿no?
54:45Eh, también pues si pasamos a la etapa
54:47de la eh
54:48bueno, al nivel de de la expresión,
54:51deseamos que pues queremos cumplir con
54:53los requerimientos de cantidad, pero
54:55pues también de calidad. Eh, por
54:57ejemplo, el promotor, el número de
54:59copias del gen, la estabilidad del
55:01vector, si la proteína una vez que se
55:04exprese va a estar dentro o fuera de la
55:06célula, todo eso va a influir eh pues en
55:08la tasa de producción, ¿no? O sea,
55:09también el hecho de que
55:11ese producto se va a generar de manera
55:13constitutiva o va a ser inducible, o
55:15sea, se puede controlar en qué momento
55:17se produce, esto también nos puede eh
55:19pues ayudar a pues optimizar recursos,
55:21¿no? Y a una etapa darle em
55:25darle énfasis a generar la suficiente
55:27cantidad eh pues de materia biológica,
55:30es decir, de de las células que estén
55:32presentes y ya luego inducir la
55:33expresión, o pues es irrelevante o no, o
55:36sea, cómo se puede
55:39mejorar la carga metabólica sobre una
55:41célula y la calidad del producto
55:42generado, o sea, tampoco se trata de
55:44tener a la célula trabaje y trabaje y
55:45trabaje y que esté estresada y que por
55:47ejemplo, digamos, es una bacteria, pues
55:49que produzca, que, o sea, que eh
55:52genere agregados y se vaya a cuerpos de
55:54inclusión, ¿no?
55:56Eh
55:57una sobre acción, sobre expresión
55:58excesiva puede saturar eh la maquinaria
56:01de la maquinaria de plegamiento
56:03generando proteínas mal plegadas o
56:05agregadas, ¿no?
56:06Eh esto también eh va a incrementar la
56:09carga de impurezas
56:11eh relacionadas con el producto que pues
56:13a veces son difíciles de de remover,
56:15¿no? Pues lo decíamos, porque tienen
56:16propiedades fisicoquímicas muy similares
56:18a las del producto.
56:20Eh entonces, pues sí, eh se debe de
56:22balancear muy bien la pro la
56:24productividad eh o la cantidad con eh la
56:27calidad evitando condiciones que
56:29comprometan eh pues la integridad
56:31estructural del biofarmacéutico.
56:33Mmm las condiciones de cultivo,
56:35obviamente, pues también eh influyen y
56:38esto pues sí podríamos decir que es eh
56:40este es un nivel más dinámico, pero
56:43también más fácilmente controlable.
56:46O sea, que se puedan detectar, se puedan
56:47manejar mejor.
56:48Eh porque por ejemplo, a nivel celular
56:50eh pues a veces hay cosas que pues así
56:52es la plataforma biológica, ¿no? Tiene
56:54esa variabilidad inherente, ¿no? Pero en
56:56las condiciones de cultivo se pueden
56:57controlar mejor.
56:59Eh se puede controlar el pH, la
57:00temperatura, el oxígeno disuelto, la
57:02composición del medio, la estrategia de
57:04alimentación del biorreactor
57:07obviamente va a influir en cómo se
57:08comportan las células.
57:11Mmm además, el metabolismo determina
57:14tanto la cantidad de producto eh como la
57:16calidad.
57:17Eh entonces, pues también en este nivel
57:21hay oportunidades
57:22de optimización mediante control de
57:24variables críticas del proceso.
57:27Este
57:30entonces em
57:32aquí pues en este nivel, perdón,
57:34podríamos, eh, pues, señalar
57:37eh, pues, las de se llaman las
57:38estrategias de eh, de alimentación, los
57:42medios de cultivo, puede haber que haya
57:43uno mejor que otro, las temperaturas,
57:46etcétera. También la estrategia, eh, del
57:49escalamiento o el tren de siembra
57:51pues, te va a tener un impacto en el
57:53producto final.
57:56Otro punto que hay que considerar son
57:58los materiales, eh, y equipos que van a
58:00estar, van a entrar en contacto con, eh,
58:02el proceso. Eh, estos deben de ser, eh,
58:05biocompatibles. Idealmente, eh, que no
58:08reaccionen con la materia prima ni con,
58:11pues, todos los intermediarios y que,
58:13además, sean capaces de resistir, eh,
58:15procesos de limpieza y esterilización.
58:18Eh, en sistemas tradicionales, por
58:20ejemplo, pues, el el material inoxidable
58:22es el material, eh, que más se utiliza,
58:25porque, pues, este es más fácil, eh
58:28pues, de esterilizar, eh, y de limpiar,
58:30que esto también es un punto importante.
58:32Todas las estrategias, eh los métodos de
58:34limpieza también son procesos en los que
58:37debe de estar documentada y asegurada la
58:39calidad, debe de estar estandarizado,
58:41eh, validado y debe ser monitoreado.
58:44Eh, en los últimos años también ha ido,
58:47eh
58:48surgiendo más, eh, el uso de sistemas de
58:51un solo uso basados, pues, en plásticos,
58:53es decir, eh, biorreactores, eh,
58:55desechables. De hecho, aquí en la en la
58:57figura se muestra, pues, eh, en la parte
59:00izquierda, pues, tenemos un biorreactor,
59:02eh, de acero inoxidable, eh,
59:03tradicional, mientras que aquí tenemos
59:05como el esqueleto que se utiliza para,
59:07eh, biorreactores desechables, que si se
59:09fijan, pues, aquí está toda la
59:10estructura montada, o sea, pues, para el
59:11monitoreo eh, pero aquí viene esta parte
59:14que está hueca, ¿no? Que es aquí donde
59:16se introducen, pues, estas botellotas o
59:18bolsas de plástico eh, que van a entrar
59:21en contacto, eh, con el, eh, con el
59:23producto. ¿Por qué esto, Esto ejemplo,
59:25es particularmente relevante en sistemas
59:28eh de mamífero como podemos ver eh aquí
59:31en la figura que aquí se utilizan eh
59:33bolsas desechables.
59:35Eh por el tipo de contaminantes, la
59:37forma en la que hm
59:39se manejan los medios de cultivos, a los
59:41medios de cultivo de mamíferos son más
59:42delicados que los de una bacteria o una
59:45levadura. Eh también pues las
59:47estrategias de limpieza suelen ser eh
59:49más rigurosas porque puede haber la los
59:51contaminantes que puedan estar presentes
59:53en el ma eh en estos equipos
59:56cuando se utilizan eh células de
59:58mamífero, pues son contaminantes más
1:00:00riesgosos e incluso pues también eh pues
1:00:01para el manejo del personal.
1:00:03Eh entonces hm llega un punto en el que
1:00:07a veces sí resulta más rentable depender
1:00:09eh o sea tener material desechable de un
1:00:11solo uso, ahorrar por ejemplo eh en agua
1:00:14eh o quitarnos esta parte eh pues de
1:00:18toda esta eh validación y monitoreo de
1:00:21los sistemas de limpieza cuando ya
1:00:23tenemos eh un producto desechable.
1:00:25Ambos tienen pues pros y contras, ¿no?
1:00:27También eh el hecho de utilizar
1:00:29productos desechables pues estamos
1:00:30hablando de eh pues el consumo eh
1:00:33excesivo de plásticos que se requiere
1:00:36pues una infraestructura o espacios pues
1:00:38pues para su almacenamiento adecuado, eh
1:00:40la dependencia en muchos casos pues de
1:00:43ciertos eh proveedores porque pues por
1:00:45ejemplo estos estos eh estas carcasas o
1:00:49estos biorreactores o estos este estos
1:00:51equipos para biorreactores desechables
1:00:52pues generalmente pues no para que
1:00:55compres precisamente con esa marca, ¿no?
1:00:57Eh también aquí puede haber pues esta
1:00:59cuestión pues del monopolio, de los
1:01:00costos, etcétera, pero últimamente yo lo
1:01:03he visto, bueno, se menciona mucho en en
1:01:05sistemas de mamífero se utilizan estos
1:01:07eh sistemas desechables principalmente
1:01:09por las cuestiones de seguridad y de
1:01:11limpieza.
1:01:12Eh
1:01:14también hay que tomar en cuenta
1:01:16eh la organización y la localización de
1:01:19dónde van a estar todos estos equipos eh
1:01:21para pues el tanto de procesamiento
1:01:22upstream como el downstream.
1:01:24Eh, hay que tomar en cuenta que el
1:01:25diseño,
1:01:27o sea, la logística debe de evitar, por
1:01:29ejemplo, zonas muertas, eh,
1:01:31principalmente en el biorreactor,
1:01:33eh, de la acumulación, eh, del producto
1:01:35o evitar también, pues, una
1:01:38configuración
1:01:39donde pudiera haber contaminación
1:01:40cruzada.
1:01:42Esto puede puede implicar, pues, que en
1:01:43las instalaciones haya, eh, superficies
1:01:45lisas,
1:01:47conexiones, eh, sanitarias y geométricas
1:01:50que favorezcan el flujo continuo y una
1:01:51limpieza, eh, eficiente.
1:01:54De manera muy general, o sea, hablando
1:01:55de las instalaciones.
1:01:57Ahora, si hablamos del biorreactor,
1:01:59pues, recordemos que los biorreactores
1:02:01tienen la función de proporcionar un
1:02:02entorno controlado donde las células
1:02:05puedan crecer y producir, eh, el
1:02:06biofarmacéutico.
1:02:08Entonces, estos deben de permitir la
1:02:09transferencia eficiente de oxígeno, la
1:02:12mezcla homogénea del producto, eh,
1:02:14obviamente, en niveles, pues, que sean
1:02:15tolerables, eh, para las células, donde
1:02:17aquí depende la plataforma biológica que
1:02:19se utilice.
1:02:20Debe de haber un monitoreo y control de
1:02:22la temperatura, del pH y también de la
1:02:25eliminación, eh, del CO2.
1:02:29Para esto, pues, se utilizan, eh,
1:02:30sistemas
1:02:32de agitación, aireación, control térmico
1:02:34y, pues, diversos diversos sensores.
1:02:38Eh, además, el biorreactor o el diseño,
1:02:41eh, debe, eh,
1:02:44también, por ejemplo, del protocolo de
1:02:45fermentación,
1:02:46de alimentación y de eliminación de
1:02:48desechos, pues, debe asegurar una
1:02:50transferencia adecuada de masa,
1:02:51minimizar el estrés mecánico y esto, de
1:02:54nuevo, es especialmente relevante en
1:02:56cultivos de células de mamífero, que son
1:02:58bastante delicadas, son bastante
1:02:59sensibles al estrés mecánico.
1:03:02Eh,
1:03:04entonces,
1:03:05pues, sí, obviamente, la selección del
1:03:06biorreactor va a depender de la
1:03:07plataforma biológica. De aquí, pues,
1:03:09tenemos los biorreactores más
1:03:11utilizados, tenemos, eh, los de tanque
1:03:13agitado,
1:03:14estos permiten un alto grado de control
1:03:16y son adecuados para una amplia variedad
1:03:18de sistemas celulares, son versátiles y
1:03:20son escalables, pues hay en diferentes
1:03:22diferentes tamaños, diferentes formatos,
1:03:24está
1:03:2510,000, 20,000 L.
1:03:27Eh decíamos que tenemos, o sea, que
1:03:30estos serían estos que están aquí, ¿no?
1:03:32Luego tenemos las plataformas
1:03:34desechables donde se utilizan bolsas
1:03:35desechables en lugar de recipientes de
1:03:37acero inoxidable. Esto reduce costos de
1:03:40limpieza, de esterilización, también
1:03:43permite mayor flexibilidad operativa y
1:03:45hay un menor riesgo de contaminación
1:03:47cruzada.
1:03:49Eh sin embargo, decíamos que pues a
1:03:51escala hay limitaciones, por ejemplo, a
1:03:53escala muy grande pues hay riesgos
1:03:55asociados con desprendimiento del
1:03:56material de cultivo en de estos
1:03:58plásticos,
1:04:00eh que también pues es algo que se
1:04:01tendría que monitorear, sería un
1:04:03contaminante adicional, ¿no?
1:04:05Eh tenemos también eh biorreactores que
1:04:08independientemente
1:04:10eh
1:04:12Bueno, aquí por ejemplo, estos que son
1:04:14em también serían como desechables,
1:04:16serían los de tipo rocking, eh que
1:04:19funcionan eh o sea, de agitación
1:04:21oscilatoria
1:04:23eh en una bolsa eh flexible, por
1:04:26ejemplo, este tipo eh de biorreactores
1:04:28son comunes en etapas de desarrollo o
1:04:31producción a escala a escala pequeña
1:04:34como parte de el escalamiento.
1:04:36Ah también hay que considerar si el
1:04:39formato de, o sea, si nuestra plataforma
1:04:42biológica eh pues necesita de una matriz
1:04:46extracelular eh
1:04:48sí, o de un sustrato eh para crecer. Eh
1:04:51esto es principalmente relevante para
1:04:53células de mamífero, decíamos que pueden
1:04:55crecer en suspensión como eh adheridas a
1:04:59a una matriz
1:05:01porque por otro lado las eh los cultivos
1:05:04microbianos, células o levaduras pues
1:05:05casi siempre pues pueden crecer en
1:05:07suspensión, pero si nos vamos a células
1:05:09de mamífero eh pues a veces sí eh
1:05:12solamente, pues podría crecer en el
1:05:14formato adherente. Entonces, esto
1:05:15también pues implica, o sea, no digo que
1:05:17no se pueda,
1:05:18sino que pues los biorreactores son
1:05:19diferentes.
1:05:20Eh, aquí, por ejemplo, eh,
1:05:23podemos utilizar eh, plataformas donde
1:05:26se utilicen micro, microacarreadores,
1:05:29eh, por ejemplo, como algunas perlas,
1:05:31botellas rodantes
1:05:33o reactores eh, de lecho empacado, que
1:05:36son tuberías que cuentan con la matriz,
1:05:38a las cuales pues se les hace pasar eh,
1:05:41el medio de cultivo y dentro eh, de esa
1:05:44matriz eh, porosa principalmente, eh,
1:05:47pues ahí crecen las células.
1:05:49Eh, entonces pues aquí pues esto es un
1:05:51formato, es un formato diferente y es el
1:05:53que se muestra eh, aquí en la figura.
1:05:55Esta es de lecho, de lecho empacado, que
1:05:57pues también se puede, ¿no?
1:05:59Eh, en cuanto al sistema de manejo de
1:06:01gases eh, y de y de líquidos, pues
1:06:03también pues no hay que olvidar pues que
1:06:05se debe de suministrar
1:06:07eh, gases como oxígeno, se debe de
1:06:09eliminar el CO2
1:06:11mediante eh, pues sistemas de dispersión
1:06:14de gas, eh, sistemas de control de flujo
1:06:16de aire, eh, u oxígeno, válvulas,
1:06:19medidores de flujo, etcétera.
1:06:21Eh, entonces pues ahí en el eh,
1:06:24el diseño que se utiliza debe de
1:06:26garantizar una transferencia adecuada de
1:06:28oxígeno sin generar, por ejemplo,
1:06:29burbujas excesivas que puedan dañar a
1:06:31las células o que haya genere mucha
1:06:33turbulencia.
1:06:35En cuanto a la dispensación de líquidos,
1:06:37pues esto pues tiene que ver con
1:06:39sistemas que permitan la alimentación
1:06:41eh, de los de los nutrientes, o sea, del
1:06:43medio de cultivo o la adición eh, de
1:06:45soluciones de control para, por ejemplo,
1:06:47ácidos o bases para controlar el pH y
1:06:50eh, pues también para eh, que permitan
1:06:53también el muestreo o la eliminación de
1:06:55los desechos.
1:06:56Estos sistemas también pues hay que
1:06:58tomar en cuenta eh, bueno, obviamente
1:07:00deben de ser eh, pues precisos,
1:07:03estériles y que eviten eh, la
1:07:05contaminación de
1:07:07pues del biorreactor durante durante el
1:07:09cultivo.
1:07:10Todo esto pues se integra eh en
1:07:13diferentes sistemas de eh de control y
1:07:15automatización
1:07:16para pues mantener las variables dentro
1:07:18de rangos definidos,
1:07:20eh monitorearlo adecuadamente y
1:07:22implementar estrategias eh por ejemplo
1:07:24de alimentación en sistemas eh de lote
1:07:26alimentado o de perfusión,
1:07:28eh o sea que estos estos equipos de
1:07:30automatización y control pues van a
1:07:31permitir pues dar la pauta en qué
1:07:33momento hay que inyectar eh más medio o
1:07:36no, eh dependiendo pues de las
1:07:38condiciones de cada de cada sistema
1:07:39biológico, ¿no?
1:07:41Permiten registrar datos en tiempo real
1:07:42y detectar desviaciones del proceso,
1:07:45lo cual pues nos permite eh o sea
1:07:46mantener este control eh permite pues
1:07:49garantizar la consistencia del producto
1:07:51entre lotes.
1:07:52Eh tenemos pues eh sistemas como PLC, o
1:07:55sea los eh controladores eh
1:07:57programables, los SCADA e interfaces eh
1:08:01hombre-máquina, ¿no?
1:08:03Eh entonces decíamos pero que el control
1:08:07automatizado permite eh la
1:08:10reproducibilidad,
1:08:11eh la el monitoreo y la validación.
1:08:14Entonces también por ende se cumplen con
1:08:16muchos requisitos eh regulatorios
1:08:18utilizando estos sistemas.
1:08:20Mmm también hay que tomar en cuenta eh
1:08:22equipos auxiliares eh por ejemplo pues
1:08:25los sistemas eh de preparación de
1:08:26medios, los sistemas de esterilización y
1:08:28limpieza que de nuevo pues también estos
1:08:30deben de estar eh validados, ser
1:08:32monitoreados, los sistemas eh de
1:08:34almacenamiento eh de la materia prima
1:08:37eh y los equipos de eh del tren de
1:08:40siembra, o sea que tiene que ver con el
1:08:41escalamiento.
1:08:46Y bueno, vamos a hablar primero, o sea
1:08:47de la primera mmm etapa del
1:08:49procesamiento upstream,
1:08:51eh que son los bancos celulares. Eh
1:08:54decíamos que el punto de partida de
1:08:56cualquier eh procesamiento
1:08:58biofarmacéutico pues es la obtención de
1:09:01una eh, línea celular genéticamente
1:09:04modificada o un sistema de expresión
1:09:05estable que produzca el biofarmacéutico,
1:09:08la biomolécula de interés de manera
1:09:10consistente y con los, eh, atributos,
1:09:12eh, pues deseados para cumplir con la
1:09:14demanda.
1:09:15Eh, sin embargo, eh, deseamos pues ya
1:09:18una vez que tenemos esta línea
1:09:20productora, es necesario establecer un
1:09:22sistema de almacenamiento y control
1:09:25que garantice, deseamos, la
1:09:26reproducibilidad, eh, a lo largo del
1:09:29tiempo, durante todo el ciclo de vida
1:09:30del producto. Eh, este sistema, eh, de
1:09:33almacenamiento pues se basa
1:09:35principalmente en la generación, eh, de
1:09:36bancos celulares.
1:09:38Un banco celular
1:09:40eh, se entiende como esta colección de
1:09:42células que han sido cuidadosamente
1:09:44caracterizadas, almacenadas en
1:09:47condiciones, eh, criogénicas,
1:09:48principalmente, eh, nitrógeno líquido y
1:09:51que sirven como una fuente estandarizada
1:09:53para iniciar cada proceso productivo. Es
1:09:56decir, ya una vez que definimos de, esto
1:09:58es, es, esta clona, estas células son
1:10:01las que van a generar el producto que yo
1:10:02quiero,
1:10:03pues hay que propagarlo,
1:10:06congelarlo y almacenarlo, de manera que,
1:10:09pues, podamos darnos, eh, pues, abasto
1:10:11durante todo el ciclo de vida, durante
1:10:13todos los lotes que pretendemos que el
1:10:14producto esté en el mercado.
1:10:17Esto asegura que cada lote de producción
1:10:19se origine a partir del mismo material
1:10:21biológico al que fue aprobado.
1:10:24Eh, porque por ende va a conservar,
1:10:28en medida de lo posible, o al menos
1:10:29desde la etapa, o sea, de las
1:10:30consideraciones biológicas, eh, va a dar
1:10:33el producto que nosotros queremos, para
1:10:35el cual se obtuvo el registro sanitario.
1:10:37Por lo, y por ende también contribuyendo
1:10:39muchísimo a la minimización de la
1:10:42variabilidad entre lotes.
1:10:44Eh, hay muchas estrategias, eh, de
1:10:47banqueo celular,
1:10:49pero principalmente se maneja, eh, este
1:10:53sistema de two tier o de dos niveles,
1:10:56eh, donde se trabaja con un banco
1:10:58celular maestro y un banco celular de
1:11:01trabajo.
1:11:03Eh el banco celular maestro representa
1:11:05es este banco primario generado a partir
1:11:08de la clona eh seleccionada y que ya
1:11:10está caracterizada.
1:11:12Este banco se produce bajo condiciones
1:11:14controladas eh y se divide en múltiples
1:11:17viales y se almacena eh en nitrógeno
1:11:20líquido.
1:11:21Que digamos, si nosotros tenemos aquí eh
1:11:24la clona o las células pues que producen
1:11:26lo que nosotros queremos, pues
1:11:27simplemente
1:11:28por poner un ejemplo,
1:11:30eh vamos a generar un cultivo, digamos
1:11:35de 20 L,
1:11:37y vamos a separarlo en alícuotas para
1:11:39congelar eh de 1 mL, de que tuviéramos,
1:11:43o sea, de 20 L, 20,000 alícuotas, ¿sí?
1:11:47Eh 20,000 alícuotas de 1 mL, obviamente
1:11:49en un material eh criogénico que puede
1:11:51ser, por ejemplo, eh glicerol o DMSO,
1:11:53pues para que no eh pues se generen
1:11:56cristales durante el proceso de
1:11:57congelación y no se mueran las células.
1:11:59Eh se almacenan eh en nitrógeno líquido
1:12:02y eh
1:12:04este banco celular maestro, de ahí va a
1:12:07derivar el banco eh celular de trabajo.
1:12:11El banco celular de trabajo se va a
1:12:13utilizar directamente en la producción,
1:12:15es que es decir, que nosotros
1:12:17cada lote
1:12:19que generemos va a venir del banco eh
1:12:21celular de trabajo.
1:12:24Esto evita el uso repetido del banco
1:12:25celular maestro y preserva su integridad
1:12:28a largo plazo.
1:12:31Eh
1:12:33aquí eh digamos,
1:12:37de nuevo, nosotros tenemos nuestra
1:12:39nuestro cultivo donde viene pues nuestra
1:12:41línea celular que queremos eh preservar,
1:12:44la alicuotamos en 20,000 viales del
1:12:47banco celular maestro
1:12:49y vamos a empezar con la producción,
1:12:51entonces nosotros tomamos el primer vial
1:12:54y de ahí supongamos que lo llevamos a
1:12:56cultivo de otros 20 litros
1:12:58y volvemos a hacer esas esas alícuotas
1:13:00de 1 ml, entonces
1:13:02vamos, o sea, de partir de un banco, un
1:13:04vial del banco celular maestro, vamos a
1:13:06obtener otros 20.000 viales del banco
1:13:09celular de trabajo, entonces de aquí
1:13:11cada lote va a venir de un banco celular
1:13:13de trabajo
1:13:15¿sí? Entonces aquí la estrategia de
1:13:17banqueo de en estos dos niveles es que
1:13:19hasta que no se acaben estos 20.000
1:13:22lotes, o no generemos estos 20.000 lotes
1:13:24que vinieron del banco celular de
1:13:26maestro 1, no vamos a tomar el banco
1:13:29celular maestro 2, entonces pues 20.000
1:13:31por 20.000, ahí saquen las cuentas, este
1:13:33imagínense el número de lotes que
1:13:35pudiéramos eh obtener. Obviamente esto
1:13:37es nada más como un ejercicio eh pues
1:13:39didáctico, es nada más como para de
1:13:41números, ¿no? Aquí no necesariamente se
1:13:43van a producir 20 litros y las alícuotas
1:13:45van a ser de 1 ml, esto pues depende de
1:13:47cada de cada
1:13:49proceso en particular, pero pues así más
1:13:51o menos funciona eh funciona esa
1:13:53estrategia
1:13:55eh
1:13:57entonces
1:13:58pues es así, justamente es la es la
1:13:59manera en la que se puede eh asegurar
1:14:03una
1:14:05dotación ilimitada de la línea celular
1:14:08para la cual nos dieron la aprobación y
1:14:10el registro sanitario
1:14:14una vez establecido el banco celular, el
1:14:16siguiente paso en el proceso de
1:14:17producción es expandir eh las células
1:14:20hasta alcanzar una la cantidad pues de
1:14:23biomasa necesaria para inocular en el
1:14:25biorreactor de de producción, es todo, o
1:14:28sea, es lo que sigue es el escalamiento
1:14:31este proceso de escalamiento se conoce
1:14:33como el tren de siembra
1:14:35el cual consiste en una serie de etapas
1:14:37de cultivo progresivo donde el volumen y
1:14:39la biomasa aumentan eh gradualmente
1:14:42típicamente esta etapa se inicia con la,
1:14:46ay perdón, con la desconge,
1:14:47descongelación del banco celular
1:14:49maestro, seguido eh por cultivos a
1:14:52pequeña escala, eh por ejemplo, que
1:14:55puede ser a nivel de un matraz eh
1:14:57agitado, y posteriormente se va
1:14:59transfiriendo a biorreactores pues de
1:15:00volumen eh creciente, ¿no? Que puede ir,
1:15:03por ejemplo, aquí viene representado de
1:15:055 L, 20 L, 20,000 hasta llegar a la
1:15:08producción en la inoculación de el
1:15:10biorreactor final eh a 5,000.
1:15:13Eh en cada etapa de les de o cada
1:15:16inoculación de de cada biorreactor o de
1:15:18cada cultivo, pues se deben de mantener
1:15:20las condiciones que aseguren una alta
1:15:22viabilidad celular,
1:15:24también que permitan la adaptación de
1:15:26las células del medio de cultivo, o sea,
1:15:28de pasar del estado de congelación a
1:15:30trabajar eh pues en un sistema ya, por
1:15:32ejemplo, con agitación, una producción
1:15:34continua.
1:15:35Eh va a asegurar también eh la
1:15:38consistencia metabólica.
1:15:41Y pues también depende de la
1:15:43eh
1:15:46Entonces, en las etapas en las que se
1:15:48vaya haciendo cada transferencia, ¿no?
1:15:50Eh el escalamiento del tren de siembra
1:15:53debe diseñarse de manera que pues evite
1:15:55estrés celular, cambios o cambios en el
1:15:58comportamiento del cultivo.
1:16:00Eh algunos factores eh como la densidad
1:16:03celular inicial, o sea, la biomasa que
1:16:05se inocula, el tiempo de cultivo, las
1:16:07condiciones ambientales, pues deben de
1:16:09mantenerse también aquí eh en los en los
1:16:12rangos óptimos para asegurar eh la
1:16:14consistencia.
1:16:16Eh también con la etapa eh del
1:16:18escalamiento o el tren de siembra es va
1:16:21a ser una etapa de alineación entre las
1:16:23condiciones de laboratorio y las
1:16:25condiciones
1:16:26eh industriales. Entonces, también es
1:16:28aquí en esta etapa de escalamiento donde
1:16:30suelen eh observarse o presentarse
1:16:33algunas eh limitantes, por ejemplo, como
1:16:36la transferencia de oxígeno o cambia
1:16:38cambios en los eh patrones de mezcla,
1:16:40¿no? Dependiendo de las estrategias de
1:16:42agitación eh que se que se utiliza.
1:16:46Entonces, aquí en esta diapositiva se
1:16:48muestran eh diferentes estrategias eh
1:16:50hipotéticas de escalamiento.
1:16:53Eh por ejemplo, esta sería como una eh
1:16:56pues muy genérica y y lineal.
1:16:59Eh
1:17:00pero pueden utilizarse varias
1:17:01estrategias para cumplir eh la demanda,
1:17:03para alimentar los biorreactores de
1:17:05producción.
1:17:07Eh aquí podríamos hablar de
1:17:10eh
1:17:12mhm
1:17:15por ejemplo,
1:17:17eh
1:17:18tener varios eh bancos, descongelar
1:17:21varios bancos celulares de trabajo
1:17:23eh en paralelo
1:17:25y hacer como un escalamiento lineal para
1:17:27poder alimentar
1:17:29a tres biorreactores de cierto volumen o
1:17:32por ejemplo, aquí donde se trabaja de
1:17:35con un banco con un solo banco celular
1:17:37maestro y va a llegar un punto en el
1:17:39tren de siembra podemos ir expandiendo,
1:17:41alimentando, vamos a aumentar el número
1:17:44de eh biorreactores
1:17:46se vayan alimentando para llegar a
1:17:49cumplir con la misma cantidad de biomasa
1:17:50para inocular estos tres biorreactores
1:17:53eh de producción.
1:17:54Sí, por ejemplo, aquí en esta vienen
1:17:571 2 3 4 5 6 pasos para alimentar tres
1:18:00biorreactores, mientras que aquí vienen
1:18:021 2 3 4, pues más o menos
1:18:04también son los mismos pasos. Ah, ya o
1:18:06sea, hay hay diferentes eh estrategias.
1:18:08En algunas de estas sí se puede reducir
1:18:10el número de pasos o también depende del
1:18:12número de litros de que necesite para
1:18:15para para cubrir, para cubrir la
1:18:17demanda.
1:18:20Eh entonces,
1:18:23mhm
1:18:24pues aquí eh un punto importante
1:18:28es eh tener lograr este lograr este
1:18:31equilibrio de la
1:18:33eh de la transferencia de masa,
1:18:37eh las condiciones de mezcla
1:18:40y eh el daño celular.
1:18:43Entonces, también eh
1:18:47criterios que nos pueden eh criterios de
1:18:50escalamiento que podemos utilizar como
1:18:52para definir cuál es la estrategia más
1:18:54apropiada, pues es aquella que nos
1:18:55permita mantener el coeficiente de
1:18:57transferencia de oxígeno, mantener la
1:18:59potencia por unidad de volumen,
1:19:00controlar el estrés mecánico o el
1:19:03esfuerzo de cizalla
1:19:04y pues reproducir las condiciones
1:19:06metabólicas eh adecuadas.
1:19:09Eh aquí también un punto crítico que
1:19:11ocurre durante el escalamiento es la
1:19:13aparición de gradientes en grandes
1:19:16volúmenes,
1:19:17eh donde o sea a mientras
1:19:20manejemos un mayor volumen, se pueden
1:19:23dar eh gradientes en eh pues en los
1:19:25nutrientes o en los eh requerimientos
1:19:28pues del cultivo, ¿no? Por ejemplo,
1:19:30puede haber zonas
1:19:31con menor concentración eh de oxígeno,
1:19:33de nutrientes eh creadas, es decir, que
1:19:35los sistemas de mezclado pues a mayor
1:19:37volumen va a ser más difícil mantenerlos
1:19:39eh homogéneos. Obviamente, estos
1:19:41gradientes van a influir en el
1:19:43metabolismo celular y en la calidad del
1:19:45producto. Entonces,
1:19:46eh pues aquí hay que tomar en cuenta
1:19:48esto durante se hace durante mientras se
1:19:50hace el escalamiento.
1:19:56Eh
1:19:57una vez alcanzada la biomasa necesaria
1:19:59en el tren de siembra, decíamos que el
1:20:01cultivo eh se va a transferir a ya al
1:20:03biorreactor de producción.
1:20:05Eh en esta etapa, pues es importante eh
1:20:08definir el modo de operación, o sea,
1:20:10cuál va a ser el protocolo de
1:20:11fermentación.
1:20:13Obviamente, este protocolo va a tener un
1:20:14impacto directo en la productividad y en
1:20:16la calidad eh del producto eh obtenido.
1:20:19Aquí ah
1:20:22por ejemplo, tenemos eh los tres más
1:20:25comunes que son los eh el lote eh o
1:20:28sistema cerrado, el lote alimentado,
1:20:31perfusión
1:20:32y una fermentación continua. Bueno, que
1:20:34bueno, este de fermentación continua eh
1:20:38pues es muy parecido a al protocolo de
1:20:40perfusión, pero este pues no tiene
1:20:42tanto, o sea, el monitoreo, no tiene
1:20:44estos sistemas de eh de monitoreo de las
1:20:46condiciones.
1:20:47Y no se utiliza tanto en la industria
1:20:48farmacéutica.
1:20:50Casi siempre el el lote lote alimentado
1:20:52y de perfusión son los que más se
1:20:54utilizan.
1:20:56Eh entonces el el método de lote o
1:20:58cultivo batch, decíamos pues que es el
1:20:59método más simple. Aquí pues este se
1:21:01caracteriza porque todos los nutrientes
1:21:04se agregan al inicio eh de la
1:21:06inoculación eh del biorreactor y pues no
1:21:08se realizan ah adiciones posteriores.
1:21:12Eh esto pues el cultivo va a ir
1:21:14creciendo y evolucionando hasta que los
1:21:16nutrientes se agotan y se empiezan a
1:21:18acumular eh pues metabolitos
1:21:20inhibitorios.
1:21:22Eh este
1:21:24pues la ventaja que tiene este es este
1:21:26modo de cultivo pues es que es fácil de
1:21:27implementar, pero pues o pues la
1:21:30cantidad eh de biomasa eh que se puede
1:21:32obtener, o sea, los en términos de
1:21:34productividad, pues o sea, la cantidad
1:21:36que se puede generar pues es es mucho
1:21:38menor.
1:21:39Em
1:21:41después tenemos los fed batch o lote
1:21:44alimentado,
1:21:45eh este consiste en la adición
1:21:47controlada de nutrientes durante el
1:21:49cultivo, es decir, o sea, es un sistema
1:21:51hm donde no hay salidas, pero sí hay
1:21:53entradas, ¿no?
1:21:55Eh
1:21:56tiene obviamente también este es un
1:21:58cultivo
1:22:00finito,
1:22:01eh pero permite eh es el hecho de que se
1:22:04vaya ah adicionando gradualmente los
1:22:07nutrientes durante el cultivo, pues
1:22:08permite extender más la fase productiva
1:22:11y evitar también la acumulación
1:22:14de productos tóxicos. Esto permite tener
1:22:16un mejor control eh del metabolismo de
1:22:19las células y una mayor eh productividad
1:22:21que con el lote cerrado.
1:22:24Luego tenemos los modos de de perfusión.
1:22:28Eh, que aquí pues en este pues hay tanto
1:22:31entrada como salida, es decir, que se va
1:22:33agregando eh medio fresco, se van a
1:22:36adicionando nutrientes eh de manera
1:22:37continua mientras se va eh retirando
1:22:40también, así como eh entran nutrientes
1:22:42van saliendo eh pues medio medio usado.
1:22:47Entonces pues aquí te permite eh tener
1:22:50más controlados eh los niveles eh pues
1:22:53de metabolitos que pudieran eh en algún
1:22:55punto inhibir el crecimiento de cultivo.
1:22:58Entonces permite mantener condiciones
1:22:59más estables, alcanzar eh densidades
1:23:02celulares más altas, pero pues también
1:23:04requiere eh de un mayor eh monitoreo.
1:23:07Hm, es a nivel operativo es más complejo
1:23:09y requiere eh requiere más control.
1:23:12Eh, entonces pues al final, de hecho
1:23:13aquí en la tabla eh pues se mencionan eh
1:23:15pues tanto ventajas y desventajas eh del
1:23:18sistema de perfusión.
1:23:19Eh, yo me atrevería a decir que yo creo
1:23:21que los más utilizados, el más utilizado
1:23:23en la industria farmacéutica es el fed
1:23:25batch,
1:23:26pero eh sí se ha ido migrando poco a
1:23:29poco, sí se ha ido explorando esta
1:23:32eh esta opción de migrar al sistema eh
1:23:35al sistema de perfusión. Por eso la
1:23:37relevancia de de de esta tabla.
1:23:40Ah, al final el método del modo de
1:23:42operación o del modo de cultivo va a
1:23:43depender pues del producto,
1:23:46eh la plataforma biológica y pues de
1:23:48requerimientos del proceso y pues
1:23:49también la demanda.
1:23:51Eh, por ejemplo, en anticuerpos
1:23:53monoclonales el el cultivo fed batch es
1:23:57el más estándar debido a este balance
1:23:58entre productividad y control
1:24:01y pues también la robustez, eh la
1:24:02robustez que permite.
1:24:07Y bueno, eh ahora vamos a hablar del
1:24:09procesamiento downstream. Este pues ya
1:24:11dijimos que comprende todas las
1:24:12operaciones necesarias para recuperar,
1:24:16purificar el fármaco y pues también aquí
1:24:18pues agregué la parte de la formulación,
1:24:20como lo veíamos en en este esquema
1:24:22general de trabajo.
1:24:24Eh, una vez que sale eh el material
1:24:26generado en la etapa en la etapa
1:24:28upstream,
1:24:30en esta etapa predomina eh
1:24:34un problema entre, bueno, un balance
1:24:36entre entre pues la separación adecuada,
1:24:38la purificación de alta precisión, en la
1:24:40que se deben de eliminar eh múltiples
1:24:43impurezas sin eh comprometer la
1:24:45integridad eh del producto terminado.
1:24:48Se ha estimado que el procesamiento
1:24:50downstream contribuye al entre un 60 y
1:24:5380% del costo total de producción debido
1:24:57eh a la complejidad de las operaciones o
1:24:59del número y el tipo de operaciones que
1:25:01se pueden eh utilizar,
1:25:03la necesidad eh de múltiples etapas y el
1:25:06uso de tecnologías altamente
1:25:07especializadas.
1:25:09Entonces, recordemos que el objetivo del
1:25:12procesamiento downstream es tanto aislar
1:25:15el producto,
1:25:16pero hacerlo eh mientras que se mantiene
1:25:20eh los requerimientos eh de pureza,
1:25:23seguridad, cantidad, escalabilidad y aún
1:25:27así también cumpliendo eh con los
1:25:28aspectos hm regulatorios.
1:25:32Entonces,
1:25:33eh hay que tomar en cuenta para definir
1:25:35el procesamiento downstream
1:25:37cómo está dada eh la naturaleza del
1:25:40producto.
1:25:41Y aquí pues influyen eh pues diferentes
1:25:43eh parámetros que ya hemos ido
1:25:45mencionando, ¿no?
1:25:46Eh, por ejemplo, hablando de la
1:25:48complejidad estructural del eh el
1:25:50producto, eh pues hablamos
1:25:51principalmente de proteínas
1:25:53terapéuticas, ya hemos dicho esto que
1:25:55pues son estructu- biomoléculas
1:25:58que tienen eh estructuras
1:26:00tridimensionales complejas,
1:26:02cuyas características o cuya estructura
1:26:05va a definir
1:26:06eh la función, la actividad biológica,
1:26:09eh pero pues también por ende van a
1:26:11condicionar eh pues cómo se va a llevar
1:26:14a cabo la eh la purificación.
1:26:18Decíamos, eh, por ejemplo,
1:26:20variaciones en el perfil de
1:26:22glicosilación
1:26:24puede alterar la carga superficial,
1:26:26la solubilidad o hidrofobicidad del
1:26:28producto,
1:26:30generando, por ejemplo, variantes que
1:26:31podían ser difíciles de
1:26:33de separar.
1:26:34Además, recordemos que las proteínas son
1:26:36altamente sensibles a, pues, a estrés,
1:26:39eh, físico y químico,
1:26:41como cambios en pH, temperatura, fuerza
1:26:43iónica,
1:26:44eh,
1:26:46que, pues, también, eh, pues, hay que
1:26:47considerar esto al momento de definir el
1:26:49proceso, eh, de purificación. Debe ser
1:26:51un proceso tanto, de purificación, tanto
1:26:53selectivo,
1:26:55pero suave, es decir, que no vaya a
1:26:56desnaturalizar, eh, a la proteína. Y,
1:26:58además, o sea, suave para que pueda, eh,
1:27:01preservar la actividad biológica.
1:27:03Porque, ¿qué chiste tiene recuperar
1:27:04kilos y kilos de producto si el producto
1:27:06no es funcional?
1:27:09Eh, también hay que hablar, pues, de
1:27:10las, la naturaleza, eh, de las
1:27:12impurezas, ¿no?
1:27:14Eh, podemos, decíamos, eh,
1:27:17te- tener impurezas relacionadas, por
1:27:19ejemplo, con el hospedero,
1:27:21que pueden ser lípidos, ADN residual,
1:27:23eh, metabolitos, eh, lipopolisacáridos,
1:27:27eh, o incluso, eh, proteínas
1:27:31de la plata- provenientes de la
1:27:32plataforma biológica, que tengan
1:27:34propiedades similares a las del
1:27:35producto, que se parezcan mucho en
1:27:37propiedades fisicoquímicas. Entonces,
1:27:39podemos implementar
1:27:40técnicas que nos permitan discernir y
1:27:42separarlas adecuadamente.
1:27:45Eh, también decíamos, eh,
1:27:48establecer técnicas de purificación, y
1:27:49aquí es donde usualmente se utilizan
1:27:51estas de alta resolución
1:27:53para poder, eh,
1:27:55remover, eh, isoformas,
1:27:58eh, proteínas parcialmente degradadas,
1:28:00agregados o proteína mal plegada.
1:28:03Porque, pues, ya sabemos que todos
1:28:05estos, si bien podemos estar hablando
1:28:07del producto, de la proteína de interés,
1:28:09eh, pues, no no va a ser, eh, funcional
1:28:11o puede afectar la eh la seguridad del
1:28:14producto.
1:28:15Eh y estas pues obviamente como tienen
1:28:17propiedades físico como derivan del
1:28:18producto, pues son las que tienen las
1:28:19propiedades físico fisicoquímicas más
1:28:21similares, entonces son las más
1:28:22difíciles de eh de eliminar.
1:28:26Eh entonces es importante establecer
1:28:28esas medidas pues para identificarlas y
1:28:30para asegurarnos que se se estén
1:28:32eliminando.
1:28:33Pueden también hay que implementar
1:28:35técnicas que permitan remover eh
1:28:36contaminantes críticos, como virus,
1:28:39endotoxinas, eh agentes adventicios, o
1:28:41sea, contaminantes relacionados con el
1:28:43proceso.
1:28:44Esta, la eliminación de estos
1:28:46contaminantes eh es obligatoria eh a
1:28:49nivel de regulatorio, de hecho incluso
1:28:51eh pues existen ni eh niveles permitidos
1:28:55eh y protocolos establecidos por ejemplo
1:28:58en las farmacopeas para remover algunos
1:29:00de esos contaminantes.
1:29:01Eh entonces eh pues también se puede uno
1:29:04hacer apoyar de eh de estos documentos
1:29:06para establecer estas estrategias.
1:29:10También hay que tomar en cuenta eh la
1:29:11concentración del producto, ya decíamos
1:29:14que en el procesamiento downstream es
1:29:15donde suele haber eh pues donde hay más
1:29:17pérdidas.
1:29:18Eh
1:29:21hay que también tomar en cuenta eh por
1:29:23ejemplo que las em que muchas de estas
1:29:25técnicas que se utilizan eh
1:29:28vamos a tener el producto en volúmenes
1:29:30muy grandes pero en muy baja
1:29:32concentración.
1:29:33Eh especialmente cuando se utiliza el
1:29:35técnicas cromatográficas, las la
1:29:37cromatografía puede permitir la
1:29:39purificación de muchas biomoléculas de
1:29:41manera muy muy selectiva, o sea, va con
1:29:43de muy alta resolución, pero tiende eh a
1:29:46diluir, a diluir mucho las proteínas,
1:29:48entonces eh
1:29:51van a ver que luego en muchos procesos
1:29:53eh casi siempre seguido de una
1:29:55cromatografía viene un proceso eh de
1:29:57ultrafiltración para eh para concentrar
1:30:00el producto como lo hicimos en el
1:30:01laboratorio. Em también por ejemplo eh
1:30:04la el esto de el manejo de grandes
1:30:07volúmenes
1:30:09Eh
1:30:10Pues también dificulta, eh, pues tanto
1:30:13la recuperación del producto como pues
1:30:14la operabilidad.
1:30:16Entonces esto es algo que también se
1:30:18tiene que tomar en cuenta.
1:30:20También hay que considerar la
1:30:21interdependencia eh, entre etapas.
1:30:24De nuevo que, pues no se, no se debe de
1:30:26ver, eh, las etapas de purificación, eh,
1:30:30como pasos, eh, independientes. Hay una
1:30:32interdependencia entre todas las
1:30:33operaciones unitarias que se
1:30:35establezcan.
1:30:36También desde el punto de vista, eh,
1:30:38regulatorio, pues el procesamiento debe
1:30:41ser, el procesamiento downstream debe de
1:30:43ser eficaz
1:30:45Pero además, demostrablemente robusto.
1:30:48Eh, aquí recordemos que la robustez
1:30:52Eh, se refiere a Al menos enfocado en el
1:30:55procesamiento dancing, que se utilicen
1:30:57procesos de purificación
1:30:59Eh
1:31:01Que, es decir, la selección de métodos
1:31:03que mantengan un desempeño confiable y
1:31:05consistente ante variaciones pequeñas
1:31:09Eh, entre sus parámetros operativos.
1:31:13Esto quiere decir Que los rendimientos o
1:31:15el producto que se obtenga a partir del
1:31:17proceso no se altera ni pierde calidad
1:31:19si algo cambia eh, ligeramente durante
1:31:22la La operación. Entonces, el hecho de
1:31:24que esto, esta robustez deba de ser, eh,
1:31:28demostrable
1:31:29Implica la validación del, por ejemplo,
1:31:31de la capacidad de remoción de
1:31:32impurezas, hacer, eh, estudios de
1:31:35aclaramiento o remoción viral Eh, y pues
1:31:38el control de consistencia, eh, entre
1:31:40lotes.
1:31:41Todo esto, eh, son evidencias que
1:31:43requieren, eh, las agencias regulatorias
1:31:45como la Cofepris.
1:31:49Este, para obtener, eh, el registro
1:31:51sanitario.
1:31:53Eh, y bueno, si pasamos a la parte de
1:31:55los parámetros de desempeño que viene
1:31:57aquí, eh, vamos a ir viendo, hm
1:32:01Que conforme vayamos avanzando eh en el
1:32:04procesamiento
1:32:05downstream o lo que queramos obtener en
1:32:07diferentes etapas, pues se debe de tomar
1:32:09en cuenta estos estos parámetros, ¿no?
1:32:12Resolución,
1:32:13capacidad, velocidad eh y recuperación.
1:32:17Entonces,
1:32:19eh
1:32:20se debe
1:32:22eh de optimizar el desempeño del
1:32:25bioproceso que definamos considerando
1:32:27estos
1:32:28estos eh parámetros. Aunque hay que
1:32:30tomar en cuenta
1:32:32que
1:32:33si vemos las definiciones, en muchos
1:32:35casos eh
1:32:38pues a veces hay que, o sea, no se puede
1:32:39tener en control en una etapa
1:32:42esos cuatro parámetros al mismo tiempo,
1:32:44sino que en unos se le va a dar más
1:32:45prioridad a cierto tipo de parámetros y
1:32:47en otros eh a otros. Ahorita ahorita lo
1:32:50lo mencionamos.
1:32:52Ehm.
1:32:53Entonces, por ejemplo, la resolución
1:32:56se refiere a la capacidad de una técnica
1:32:59de separación para distinguir eh del
1:33:02producto de interés y de las impurezas.
1:33:04Les podemos hablar, por ejemplo, de la
1:33:06selectividad, ¿no?
1:33:08Ehm.
1:33:10Este parámetro es relevante debido a la
1:33:12alta similitud que puede haber entre el
1:33:15producto y muchas de sus impurezas,
1:33:16particularmente, como decíamos, las
1:33:18impurezas relacionadas con el producto.
1:33:21Entonces, eh una técnica de alta
1:33:24resolución
1:33:26eh implica que pequeñas diferencias en
1:33:27propiedades como carga, el tamaño o la
1:33:30hidrofobicidad pueden ser explotadas
1:33:32para lograr eh su separación.
1:33:37Sin embargo, eh estas técnicas de alta
1:33:39resolución suenen suelen ser lentas
1:33:43y no tienen una eh capacidad eh
1:33:45volumétrica muy buena. Entonces,
1:33:48por esto vamos a ver que
1:33:50la resolución o
1:33:53técnicas que utilicen, o sea, que que
1:33:54sean de alta resolución, se reserva para
1:33:56las etapas finales de purificación,
1:33:58donde ya se han removido la mayor
1:34:00cantidad de impurezas y los volúmenes ya
1:34:03van a ser menores.
1:34:05Luego tenemos la capacidad.
1:34:06Esta describe la cantidad de material
1:34:08que puede ser procesado en cada en cada
1:34:12operación unitaria, ya sea en términos
1:34:14de volumen o de masa.
1:34:16Este, por ejemplo, va a ser crítico en
1:34:18las etapas iniciales, donde se donde se
1:34:20van se manejan pues los volúmenes más
1:34:23grandes y con baja concentración del
1:34:25producto.
1:34:26La una técnica con una alta capacidad
1:34:30permite procesar grandes cantidades de
1:34:32material en menos tiempo y con menor
1:34:34infraestructura.
1:34:36Lo cual obviamente va a influir
1:34:37directamente en los costos del proceso.
1:34:41Sin embargo, casi siempre cuando
1:34:43mientras vamos aumentando la capacidad,
1:34:45generalmente se sacrifica la resolución.
1:34:48Entonces, por eso la resolución se
1:34:50utiliza en etapas finales y capacidad en
1:34:52etapas en etapas
1:34:54perdón, iniciales.
1:34:57Luego tenemos la velocidad. Esto
1:34:58obviamente se refiere al tiempo
1:34:59requerido para llevar a cabo una
1:35:01operación.
1:35:02En la industria, pues obviamente este
1:35:05parámetro pues se va a traducir en
1:35:07productividad.
1:35:09Sí, es decir, la cantidad de producto
1:35:10que puede generarse por unidad de
1:35:12tiempo.
1:35:13Procesos más rápidos permiten reducir
1:35:15tiempos del ciclo.
1:35:17Por ende, incrementar la capacidad de
1:35:19procesamiento y disminuir costos
1:35:22operativos. Entonces, casi siempre, o
1:35:24sea, en etapas iniciales vamos a ver
1:35:25capacidad junto con velocidad.
1:35:28Obviamente, la velocidad va a entrar en
1:35:30conflicto con la resolución.
1:35:33Entonces, de nuevo, pues esto la
1:35:35velocidad se utiliza más en etapas
1:35:37tempranas.
1:35:39Luego tenemos la recuperación, que sería
1:35:42prácticamente el rendimiento.
1:35:44Se refiere a la fracción de producto
1:35:46inicial que se conserva a lo largo del
1:35:48proceso de purificación.
1:35:51Este obviamente pues también es un punto
1:35:53crítico desde el punto de vista
1:35:54económico
1:35:55porque decíamos que pues las pérdidas
1:35:57van a ser acumulables en cada etapa.
1:36:00Eh, y esto pues puede resultar en una
1:36:03reducción significativa de del
1:36:05rendimiento global, que llevarlo a que
1:36:07ya no sea rentable.
1:36:10Eh,
1:36:12entonces, ah, también pues aquí la hm
1:36:16la recuperación
1:36:18hm
1:36:20pues más que lo que se pueda controlar,
1:36:22hm pues es algo que hay que ir tomando
1:36:24en cuenta y que va sumando durante todas
1:36:25las etapas.
1:36:27Eh,
1:36:29entonces esto implica a la hora del
1:36:32diseño del proceso seleccionar
1:36:33condiciones que sean lo suficientemente
1:36:34selectivas para eliminar impurezas, pero
1:36:37lo lo suficientemente suaves para
1:36:39preservar eh la cantidad del producto y
1:36:41mejorar estos rendimientos.
1:36:44Obviamente también la eh la recuperación
1:36:46o el rendimiento va a estar influenciada
1:36:47por la estabilidad del producto, la
1:36:49afinidad que pueda tener eh por ciertas
1:36:52matrices cromatográficas y pues por con
1:36:54las condiciones de operación.
1:36:56Eh, entonces vamos a vamos a ver cuáles
1:36:58eh son las hm
1:37:00como que las etapas generales en las que
1:37:02se puede dividir el procesamiento
1:37:03downstream, las técnicas eh más
1:37:05utilizadas
1:37:07en cierta etapa, pero de nuevo haciendo
1:37:08la aclaración de que, por ejemplo, eh
1:37:11pues uno puede utilizar un tipo de
1:37:13cromatografía, por decir una de
1:37:15intercambio iónico puede utilizarse
1:37:16tanto en etapas iniciales o como de
1:37:18purificación intermedia, como también en
1:37:21las de alta hm resolución. Y vamos a ir
1:37:24también a recalcando en cada etapa,
1:37:26pues, eh
1:37:28qué parámetros de desempeño son los más
1:37:31importantes.
1:37:32Pero pues tomando en cuenta, como ya
1:37:33mencionamos, que en etapas iniciales se
1:37:35va a preferir
1:37:36eh la capacidad y la velocidad versus a
1:37:39la resolución y los rendimientos que se
1:37:41pueden obtener en las etapas finales.
1:37:46Entonces, el procesamiento downstream
1:37:48puede entenderse como una secuencia
1:37:51organizada de pasos u operaciones con el
1:37:54propósito de transformar eh un sistema
1:37:56biológico completo que se va a provenir
1:37:59eh pues del biorreactor
1:38:00y convertirlo a un producto
1:38:02biofarmacéutico que sea puro, seguro y
1:38:05estable.
1:38:06Mmm, pueden eh como ya mencionamos, eh
1:38:08pueden existir eh pues múltiples eh
1:38:11configuraciones o diseños de procesos
1:38:13posibles.
1:38:15Eh pero eh pues sí podríamos decir que
1:38:17la mayoría de los procesos industriales
1:38:19para la producción de biofarmacéuticos
1:38:21siguen una estructura, podríamos decir
1:38:24común,
1:38:25que inicia eh con la recuperación del
1:38:27producto,
1:38:29em
1:38:31continúa con un paso eh de clarificación
1:38:34y culmina con una serie eh de etapas eh
1:38:37de purificación de baja y alta
1:38:39resolución, eh que usualmente siguen una
1:38:43estrategia eh que se llama CIPP, de por
1:38:47el acrónimo en inglés de capture,
1:38:49intermediate purification y polishing,
1:38:52es decir, captura, purificación
1:38:54intermedia y el pulido, pulido o
1:38:56refinamiento.
1:38:58Em
1:38:59la etapa eh de recuperación eh o
1:39:03colecta, esta pues es eh la etapa
1:39:07inicial o la del punto de entrada del
1:39:09procesamiento downstream y es este punto
1:39:11intermedio, ¿no? O sea, lo que lo
1:39:13conecta con el procesamiento upstream.
1:39:16Esta tiene eh como función principal
1:39:18separar el producto del sistema
1:39:20biológico en el que fue generado y
1:39:22acondicionarlo para su procesamiento
1:39:24posterior.
1:39:26Eh en si, y esto obviamente pues va a
1:39:28depender em de pues dónde esté acumulado
1:39:31el producto en el biorreactor.
1:39:34Em cuando el producto se secreta en
1:39:36medio de cultivo, es decir, eh pues
1:39:38tiene una presencia extracelular, eh
1:39:41pues el objetivo va a ser recuperar el
1:39:43sobrenadante que contiene el caldo de
1:39:45cultivo removiendo las células intactas.
1:39:48Eh, y todo eh, pues partículas sólidas,
1:39:51material particulado.
1:39:52Por otro lado, cuando el producto es
1:39:54está dentro de la célula, pues debe
1:39:57incluirse en una etapa adicional eh,
1:40:00pues donde se haya una ruptura celular.
1:40:04Eh, lo que pues en consecuencia va a
1:40:06incrementar la complejidad eh, del
1:40:08proceso, ya que pues así como se libera
1:40:10la proteína, se liberan una gran
1:40:11cantidad de impurezas, pero pues a veces
1:40:14eh, pues no hay otra opción, ¿no?
1:40:17Es algo nada más que hay que considerar.
1:40:19Luego tenemos la etapa de clarificación.
1:40:21Eh, esta tiene como objetivo principal
1:40:24eliminar eh, partículas finas, restos
1:40:27celulares y otros sólidos suspendidos
1:40:29que no fueron removidos completamente en
1:40:31la etapa eh, de recuperación.
1:40:34Esta etapa es importante porque eh, pues
1:40:37como hemos mencionado en etapas
1:40:38posteriores eh, casi o sea, lo que se
1:40:41busca
1:40:42es tener eh, el producto eh, de manera
1:40:45soluble, dado que pues se van a utilizar
1:40:48pasos cromatográficos, ¿no?
1:40:50Entonces no debe de haber material
1:40:51particulado.
1:40:53Eh, entonces
1:40:55eh,
1:40:56por ejemplo, eh, pues este material
1:40:57particulado puede obstruir eh, las
1:41:00columnas, puede también reducir eh, la
1:41:02la capacidad eh, de retención de pues
1:41:06eh, de manera más rápida en en las eh,
1:41:09etapas posteriores de eh, de filtración.
1:41:13Ah,
1:41:14entonces la selección de las técnicas
1:41:16que se puedan utilizar en la etapa de
1:41:18clarificación, pues va a depender de la
1:41:19carga de la carga de sólidos, también de
1:41:22la viscosidad del medio y pues de qué
1:41:24tan sensible sea el producto pues a
1:41:26condiciones muy eh, muy agresivas de
1:41:27separación.
1:41:30Luego tenemos la etapa de captura,
1:41:32eh, que esta es la primera operación
1:41:36como tal de purificación Y tiene como
1:41:39objetivo, pues como su nombre lo dice,
1:41:40aislar, capturar el producto de la mayor
1:41:43parte de las impurezas presentes en pues
1:41:46en en en en todo el sistema.
1:41:48En esta etapa se prioriza la capacidad y
1:41:51la velocidad, como ya habíamos
1:41:53mencionado,
1:41:54ya que el sistema todavía tiene una alta
1:41:56carga de contaminantes y el producto se
1:41:58encuentra relativamente diluido.
1:42:01Em
1:42:02Esta etapa de captura es importante
1:42:04porque reduce significativamente la
1:42:06complejidad eh del sistema, o sea, de
1:42:09qué tanto qué tantos componentes vayan a
1:42:11estar presentes y eh pues puede ayudar a
1:42:15concentrar eh el producto o incluso a
1:42:18cambiar eh la solución en la que se
1:42:20encuentra disuelto.
1:42:22Luego seguimos con la etapa de
1:42:23purificación intermedia,
1:42:25que en esta eh pues se eliminan
1:42:28impurezas que no fueron obviamente
1:42:29removidas en la etapa anterior, que
1:42:32estas pueden incluir eh proteínas del
1:42:34hospedero, ADN residual o variantes del
1:42:36producto.
1:42:37Aquí ya nos estamos acercando a este
1:42:39punto donde eh pues tratamos de eliminar
1:42:42em productos con propiedades
1:42:44fisicoquímicas similares,
1:42:46eh perdón, contaminantes con propiedades
1:42:48fisicoquímicas similares a las del
1:42:49producto.
1:42:50Aquí ya se empieza a mover un poquito la
1:42:53balanza en estos parámetros y se le da
1:42:55una preferencia entre capacidad y
1:42:58resolución. Aquí ya no se busca tanto la
1:43:00velocidad, em
1:43:03por lo tanto eh
1:43:05pues requiere eh un mayor control de las
1:43:07condiciones de de operación.
1:43:10Luego tenemos la etapa de pulido, que
1:43:12esta representa pues el nivel más alto
1:43:14de selectividad dentro del procesamiento
1:43:16downstream eh y por ende se deja para
1:43:19las etapas finales. Aquí eh se eliminan
1:43:21impurezas eh residuales a nivel trazas
1:43:24en condicio- en concentraciones muy
1:43:26bajas
1:43:26y que pueden incluir eh
1:43:29pues decíamos contaminantes relacionados
1:43:31con el producto, como agregados
1:43:33isoformas o algún otro contaminante
1:43:35crítico que pudiera estar ahí o que
1:43:36venga, por ejemplo, de etapas de etapas
1:43:38previas, ¿no?
1:43:40En esta etapa se va a priorizar la
1:43:42resolución sobre la capacidad eh ya que
1:43:45los volúmenes de trabajo pues van a ser
1:43:47menores y el producto se encuentra más
1:43:49eh más concentrado.
1:43:52Eh una vez terminada esta etapa, pues lo
1:43:55que se obtiene en la mayor, o sea, lo
1:43:56que se busca obtener pues es tener un
1:43:58producto que cumpla con los estándares
1:44:00de pureza y calidad requeridos para su
1:44:03uso terapéutico.
1:44:04Y y bueno, aquí en estas tablas, en
1:44:07estas figuras, perdón, si se fijan, eh
1:44:09pues están resumiendo eh estas etapas.
1:44:12Eh la primera, eh la fi la figura de la
1:44:16izquierda pues habla de estas etapas eh
1:44:18de preparación antes de este proceso de
1:44:21eh de purificación se IPP, ¿no?
1:44:24Am, donde pues se fijan en las primeras
1:44:27etapas am
1:44:30pues se le da una mayor preferencia eh a
1:44:32la robustez, mientras que en las etapas
1:44:34finales, ya las de captura, purificación
1:44:36intermedia y pulido se le da eh mayor em
1:44:40relevancia a obtener un producto em
1:44:43purificado.
1:44:44Y bueno, aquí se resaltan en rojo pues
1:44:47algunos puntos em importantes al momento
1:44:50de decidir en los métodos eh que se van
1:44:53a utilizar para cumplir con estos
1:44:54objetivos.
1:44:56Eh y esto pues también tiene que ver, o
1:44:58sea, van a estar definidos pues por lo
1:45:00establecido eh en la etapa downstream. Y
1:45:02aquí de nuevo parte este punto
1:45:04importante de utilizar em métodos
1:45:08métodos ortogonales.
1:45:11Aquí del lado derecho se muestra eh pues
1:45:14una
1:45:16em
1:45:17pues una serie de etapas muy estándar, o
1:45:20sea, muy sí, muy genérica sobre cómo
1:45:22pudiera estar diseñado el proceso y cómo
1:45:25en estas últimas etapas tenemos la parte
1:45:27de la captura, aquí viene la remoción
1:45:30pero podemos llamarlo la purificación
1:45:31intermedia y el pulido. Y entonces si
1:45:33fijan aquí hay
1:45:35puntos intermedios
1:45:37eh que pues también ayu- van ayudando a
1:45:40a
1:45:42al sistema o donde el sistema en el que
1:45:44está disuelto el producto para irlo
1:45:46preparando para las etapas posteriores
1:45:48de purificación.
1:45:51Okay, entonces decíamos que la primera
1:45:53etapa es etapa recuperación o harvest o
1:45:56la colecta. En este eh el material de
1:45:59entrada decíamos pues es el caldo eh de
1:46:01cultivo que va a contener pues células
1:46:03viables o también eh células muertas,
1:46:05fragmentos celulares, proteínas del
1:46:08hospedero, metabolitos y otros productos
1:46:10eh
1:46:11otros productos junto con ellos el
1:46:13producto de interés, lo que queremos
1:46:14purificar, en este caso proteína
1:46:15recombinante, una molécula de ácido
1:46:17nucleico.
1:46:19Eh
1:46:20Aquí hm lo que implica esta etapa
1:46:23decíamos principalmente es separar una
1:46:25fase sólida de un y una fase líquida sin
1:46:29comprometer eh la calidad del producto.
1:46:33Eh
1:46:36Eh aquí pues también hay que tomar en
1:46:38cuenta eh pues de dónde de dónde vienen
1:46:41las células, no es lo mismo si viene eh
1:46:43de un caldo de cultivo de células de
1:46:44mamífero o así como viene eh de un
1:46:47sistema eh microbiano. Eh por ejemplo en
1:46:51el en caso de células de mamífero el
1:46:53sobrenadante, o sea que bueno aquí en
1:46:54este sistema principalmente se busca y
1:46:56es posible eh dirigir eh la secreción
1:46:59del producto al medio de cultivo, pero
1:47:01pues esto también va a estar eh inmerso
1:47:03en medio de cultivo, recordemos que
1:47:04estaría suplementado con hm aminoácidos,
1:47:08eh vitaminas, eh otros meta- eh factores
1:47:11de crecimiento, eh sueros animales que
1:47:13pues también contienen otras proteínas,
1:47:15¿no?
1:47:16Entonces eh
1:47:19aquí eh por la carga de impurezas es
1:47:21bastante grande, o sea, no, o sea,
1:47:25eh, pues casi comparable con lo que si
1:47:26fuera un lisado celular.
1:47:29Ah,
1:47:30aquí, en el, por otro lado, en el caso
1:47:32de los sistemas microbianos, la
1:47:34complejidad de lo que recuperaremos
1:47:37aumenta más o es más compleja cuando el
1:47:39producto es, eh, intracelular, porque
1:47:41debemos de agregar esta etapa de lisis.
1:47:45Eh, pero bueno,
1:47:46eh, independientemente de dónde se
1:47:48encuentre el producto, que obviamente es
1:47:50algo que hay que tomar en cuenta para
1:47:51decidir, eh, pues la porción que vamos a
1:47:53recuperar del caldo de cultivo, eh, de
1:47:56manera, eh, general, pues en esta etapa
1:47:58se suelen utilizar dos tipos de
1:48:00técnicas, que son, eh, métodos físicos.
1:48:03Eh, una es la centrifugación y varios,
1:48:06eh, formatos pueden utilizarse de, eh,
1:48:08de filtración.
1:48:10Aquí, bueno, la centrifugación, pues, el
1:48:13fundamento de esta técnica, pues,
1:48:14consiste en acelerar,
1:48:16eh, o favorecer la sedimentación de
1:48:19partículas de mayor tamaño, partículas
1:48:21sólidas, mediante la aplicación de
1:48:23fuerza centrífuga.
1:48:25Entonces, aquí, pues, nuestro producto,
1:48:27nuestro caldo de cultivo, pues,
1:48:28decíamos, es una suspensión que
1:48:30contiene, eh, células vivas, células
1:48:32muertas, restos celulares.
1:48:34Eh, entonces, al someter esta suspensión
1:48:37a fuerzas de aceleración,
1:48:40eh, pues, las partículas de mayor
1:48:41densidad, pues, se van a desplazar, eh,
1:48:44radialmente y se van a separar de la
1:48:46fase líquida, ¿no?
1:48:49Eh,
1:48:51la eficiencia de la separación, pues, va
1:48:52a depender, principalmente, eh, pues,
1:48:56del tamaño de las partículas que estén
1:48:57inversas en la mezcla,
1:48:59la diferencia de densidad entre la, las
1:49:02partículas y el medio, la viscosidad,
1:49:05eh, los, eh, los tiempos de residencia
1:49:07dentro del equipo, eh,
1:49:09y obviamente, pues, también, eh, la
1:49:12velocidad, ¿no? Cuanto mayor sea la
1:49:14velocidad, eh, de centrifugación, más
1:49:16eficiente va a ser la separación.
1:49:19Sin embargo, hay que tomar en cuenta que
1:49:22aquí debe de haber un equilibrio
1:49:24en esta etapa de separación con la
1:49:26centrifugación porque la
1:49:30si la fuerza centrífuga es muy grande,
1:49:33pues se pudieran lizar las células eh
1:49:36pues de una forma no prevista, ¿no?
1:49:39Entonces, pues aquí no tendríamos
1:49:40o sea, se debe de cuidar que las
1:49:42velocidades no sean tan fuertes para que
1:49:44no se lisen las células y se liberen más
1:49:45contaminantes al medio o que pudiéramos
1:49:47perder el producto a la hora de
1:49:48recuperar el el precipitado, ¿no?
1:49:52También por otro lado, acuérdense que
1:49:54pues la centrifugación pues también esta
1:49:56fuerza pues genera pues genera un
1:50:00aumento de temperatura del sistema y
1:50:02esto pudiera
1:50:04fomentar las reacciones de degradación
1:50:06de la proteína o desnaturalizarla,
1:50:07entonces también
1:50:09en muchos casos se requiere un control
1:50:11de temperatura en esta etapa.
1:50:14En cuanto a los tipos de centrífugas que
1:50:15se puedan utilizar
1:50:17eh
1:50:19un formato muy estándar a nivel
1:50:21industrial son las centrífugas de discos
1:50:23que estas están diseñadas para trabajar
1:50:25de manera continua y para procesar
1:50:28caudales o volúmenes elevados.
1:50:31Entonces, esta configuración de discos
1:50:34eh bueno, pues en el interior de la
1:50:36centrífuga va a haber una serie de
1:50:38discos cónicos
1:50:39que van a estar así como por niveles
1:50:42y esto lo que va a hacer es que aumenta
1:50:44el área efectiva
1:50:45de sedimentación de manera que se puedan
1:50:48separar pues un mayor número de sólidos
1:50:50pequeños en tiempos cortos.
1:50:53Entonces, el caldo de cultivo eh va a
1:50:55entrar al rotor eh que viene por aquí
1:50:59abajo, como es el flujo, nomás que lo
1:51:02tapa justamente la cámara.
1:51:05Y se va a ir distribuyendo eh entre los
1:51:07discos que van a estar apilados,
1:51:09entonces las partículas pues se van a ir
1:51:11sedimentando hacia la periferia
1:51:13y el líquido clarificado
1:51:16o el que viene aquí marcado el centrate,
1:51:18el concentrado
1:51:21va a fluir hacia la salida, ¿no?
1:51:22Entonces los sólidos eh pues conforme va
1:51:25se va eh descargando digamos el efluente
1:51:29pues se va a ir recuperando
1:51:31eh el efluente de forma de forma
1:51:33continua. Obviamente pues hasta que
1:51:34llegue un punto en el que el equipo se
1:51:36satura, ¿no?
1:51:37Pero pues también estos tienen
1:51:39sistemas que permiten eh cierto escape
1:51:42del material particulado de manera que
1:51:43dure más tiempo.
1:51:45Eh luego también tenemos eh la
1:51:47centrifugación por descarga continua por
1:51:49boquillas.
1:51:50Estos este proceso de centrifugación se
1:51:52utiliza eh en sistemas con una alta
1:51:55carga de sólidos
1:51:57eh
1:51:58y eh o sea, es decir, donde tenemos eh
1:52:01caldos de cultivo con una alta densidad
1:52:03celular que pudiera ser por ejemplo para
1:52:05sistemas eh microbianos, ¿no?
1:52:08Mmm en general para la centrifugación
1:52:10pues tenemos eh pues variables o puntos
1:52:12que van a influir en los rendimientos o
1:52:14en los eh con la eficiencia del proceso.
1:52:17Eh uno de ellos es la carga de los
1:52:18sólidos
1:52:20eh obviamente pues si tenemos eh una
1:52:22carga de sólidos bastante grande pues
1:52:24las la descarga eh pues debe hacerse de
1:52:26forma más frecuente
1:52:28eh
1:52:29lo cual eh
1:52:32pues pudiera dificultar todo este
1:52:33proceso de de automatización, ¿no?
1:52:36Eh esto también puede influir eh en cómo
1:52:39se va a regular el flujo de alimentación
1:52:42o puede ser necesario diluir el caldo de
1:52:44cultivo o adoptar equipos de de descarga
1:52:47continua, ¿no?
1:52:48Otro punto eh es la densidad celular y
1:52:51pues también tiene que ver eh con este
1:52:53eh material material particulado, la
1:52:55cantidad también de sobrenadante que
1:52:57podamos recuperar.
1:53:00Ehm
1:53:01también eh la viabilidad celular esto lo
1:53:04tenemos eh por ejemplo de cuando las
1:53:07mhm células son muy delicadas a ciertas
1:53:09fuerzas, eh, a las fuerzas de
1:53:10centrifugación, digamos, por ejemplo,
1:53:12sistemas que células que no tienen, eh,
1:53:15pared, entonces no pueden aguantar
1:53:16aguantar velocidades muy grandes,
1:53:17entonces al esto pues también limita las
1:53:20velocidades que se pueden alcanzar y por
1:53:22ende, eh, pues el rendimiento de la
1:53:24centrifugación.
1:53:26Eh,
1:53:31luego, eh, pasamos a las a las
1:53:33filtraciones que en esta etapa las que
1:53:35más se utilizan son la, eh, la
1:53:37filtración eh, profunda
1:53:40y la filtración, eh, tangencial, que
1:53:43básicamente la diferencia entre uno y
1:53:45otro es, eh, con respecto al filtro,
1:53:47cómo hacia dónde va, hm, el flujo del
1:53:50efluente, ¿no?
1:53:51Eh, la filtración, eh, la filtración
1:53:53profunda pues básicamente va, digamos
1:53:55que si este es el filtro, el flujo va
1:53:57perpendicular, mientras que, eh, la
1:53:59centrifugación, eh, tangencial pues va
1:54:02paralela a la
1:54:04a al filtro, ¿no?
1:54:06Eh,
1:54:09estas, eh,
1:54:11estos filtros, por ejemplo, para la eh,
1:54:14la filtración profunda
1:54:16eh, su- suelen utilizarse materiales
1:54:18como celulosa, diatomeas o polímeros
1:54:20sintéticos.
1:54:22Y y bueno, a medida que el flujo va
1:54:24fluyendo, las partículas son retenidas
1:54:26tanto en la superficie, o sea, en esta
1:54:28parte, como dentro, eh, o en la
1:54:30profundidad de a través del propofiltro,
1:54:32por eso se llama, eh, filtración
1:54:34profunda.
1:54:35Eh, aquí pues cómo se va, eh, a retener
1:54:39el material particulado, pues tiene que
1:54:41ver por una, eh, interacción, eh,
1:54:44física, eh, por tamaño, o sea, el tamaño
1:54:47del poro, por absorción electroestática
1:54:50eh, de aquí también pues que hay que
1:54:52seleccionar adecuadamente, eh, los
1:54:54materiales de los que van a estar
1:54:55compuestos estos estos filtros y pues el
1:54:57atrapamiento dentro de la matriz, eh,
1:55:00porosa.
1:55:02Eh, esta la filtración en profundidad es
1:55:05una se utiliza mucho en las etapas de
1:55:07clarificación eh primaria cuando no se
1:55:09utiliza eh centrifugación o se puede
1:55:12utilizar también como una etapa de
1:55:14clarificación secundaria, o sea, que no
1:55:16necesariamente se va a utilizar para lo
1:55:17que le está sino más bien para la
1:55:18clarificación.
1:55:21Eh,
1:55:24aquí pues también eh pues variables
1:55:27críticas que van a influir pues es la
1:55:29carga eh de sólidos
1:55:31eh porque pues obviamente aquí eh pues
1:55:33sí tenemos un em a diferencia de la
1:55:35centrifugación pues tenemos eh pues una
1:55:38limitante eh pues finita del espacio,
1:55:40¿no?
1:55:41Eh, los filtros obviamente eh pues
1:55:44tienden a taparse, entonces a mayor eh
1:55:46cantidad de partículas que estén
1:55:47presentes pues menor va a ser la vida
1:55:49útil del filtro y que sea eh pues
1:55:52necesario eh estarlos cambiando eh
1:55:54frecuentemente, ¿no?
1:55:56Em, también pues la naturaleza eh de las
1:55:59partículas, de qué tamaño son,
1:56:02la carga eh superficial que puedan
1:56:04llegar a tener y qué tan eh flexibles o
1:56:07rígidas puedan ser.
1:56:09Eh, yo por ejemplo lo he visto eh con
1:56:11algunas proteínas luego a veces influye
1:56:13eh el estado, ¿no? O sea, si está
1:56:15plegada o si está completamente
1:56:16desnaturalizada.
1:56:18Eh, yo he visto casos en los que
1:56:21eh pues por filtración,
1:56:23independientemente del formato del
1:56:24flujo,
1:56:26eh si la proteína está desnaturalizada y
1:56:27la tenemos así como un espagueti, pues
1:56:30sí, o sea, si tenemos digamos como en
1:56:32una porción de una proteína lineal eh
1:56:34que es lo suficientemente fina para
1:56:36pasar por el tamaño del poro, pues
1:56:38independientemente de qué tan larga se
1:56:39puede perder a a diferencia que si
1:56:41estuviera completamente plegada eh o
1:56:43sea, con una conformación eh pues más
1:56:45densa,
1:56:47esa sí pudiera quedar atrapada, ¿no?
1:56:50Eh, entonces pues eso también influye,
1:56:53la viscosidad del fluido,
1:56:55eh los fluidos más viscosos pues van a
1:56:56reducir la velocidad de la filtración y
1:56:59también pueden favorecer la acumulación
1:57:00de material dentro del filtro. El flujo
1:57:03y la presión.
1:57:04Un flujo muy alto eh puede compactar el
1:57:08medio filtrante o forzar el paso de las
1:57:10partículas.
1:57:11Eh.
1:57:13Mientras que eh condiciones muy eh muy
1:57:16suaves o con poca presión, un flujo muy
1:57:17bajo, puede re eh resultar en tiempos eh
1:57:20de proceso eh pues poco eficientes, o
1:57:22sea, que sea muy largo. Entonces, aquí
1:57:24también debe de encontrarse un
1:57:26equilibrio. También a presiones muy
1:57:27altas, pues también se puede se pueden
1:57:29romper los filtros, ¿no?
1:57:31Luego tenemos la microfiltra Bueno, la
1:57:34filtración tangen tangencial.
1:57:36Eh esta, pues se utilizan Se llama mic
1:57:40Aquí lo tengo resaltado como
1:57:41microfiltración, pero esto pues va a
1:57:42estar dado eh más que por el flujo, sino
1:57:45por el tamaño de los poros.
1:57:46Esta eh en la filtración tangen
1:57:48tangencial, perdón, casi siempre se
1:57:50utilizan eh rangos de {punto} 1 {punto}
1:57:521 {punto} 65 micras.
1:57:56Eh.
1:57:57Y se utiliza, de nuevo, el efluente va
1:58:00sobre un eh
1:58:03sobre un gradiente de presión y
1:58:05justamente es esa presión que va
1:58:06paralela a la membrana lo que permite eh
1:58:09que pues el producto o el filtrado la
1:58:11atraviese.
1:58:12Eh.
1:58:14Obviamente, lo que va a atravesar la
1:58:16membrana van a ser las partículas eh de
1:58:18menor tamaño y van a quedar retenidas,
1:58:20pues células y agregados.
1:58:23Eh.
1:58:25El flujo tangencial reduce la
1:58:27acumulación de partículas sobre la
1:58:29superficie de la membrana. Es decir, que
1:58:31pues es más difícil eh que se tapen
1:58:33estas eh estos filtros, a diferencia de
1:58:35la filtración profunda.
1:58:37Eh.
1:58:40Entonces, esto permite mantener eh pues
1:58:42el flujo del efluente eh por más tiempo,
1:58:44¿no?
1:58:46Entonces, aquí el transporte va a estar
1:58:48gobernado por un equilibrio entre el
1:58:50flujo convectivo hacia la membrana,
1:58:52fuerzas de arrastre tangencial y la
1:58:53difusión de las las partículas.
1:58:57Esta técnica de filtración tangencial se
1:58:59puede utilizar como un método
1:59:00alternativo a la centrifugación de
1:59:02manera eh pues muy similar a la
1:59:04filtración en profundidad.
1:59:07Eh
1:59:08también se puede utilizar en etapas
1:59:09posteriores a la purificación, eh por
1:59:12ejemplo, para ayudar a clarificar eh el
1:59:15producto el flujo del efluente antes de
1:59:17entrar a una columna cromatográfica.
1:59:21Eh
1:59:24Aquí pues también una un punto
1:59:26importante eh para la configuración eh
1:59:29del proceso de la microfiltración
1:59:30tangencial pues es que se necesita eh un
1:59:33sistema de bombeo eh que permita eh
1:59:36recircular, o sea, y que haya aquí un
1:59:38circuito de alimentación y de
1:59:39recuperación y control de presión.
1:59:42Mmm variables críticas, pues yo creo que
1:59:44eso es muy similar, yo creo que son las
1:59:46mismas.
1:59:49Eh que con la bueno, casi las mismas que
1:59:51con la filtración en profundidad,
1:59:53obviamente la carga de los sólidos, eh
1:59:55la viscosidad del fluido,
1:59:57eh la presión y en este caso eh pues el
2:00:00flujo o o la velocidad tangencial van a
2:00:04eh van a influir.
2:00:10La lisis celular es un paso, una
2:00:13operación unitaria importante en
2:00:15aquellos bioprocesos donde el producto
2:00:17de interés está dentro de la célula y
2:00:20pues es necesario hacerla, ¿no? Después
2:00:22eh de la colecta o la recuperación eh
2:00:26pues de la del producto de esa
2:00:29separación después del caldo de cultivo,
2:00:31eh si el producto se se acumula dentro
2:00:34de las células de las células es
2:00:35necesario hacer la lisis.
2:00:37Entonces, pues la lisis tiene como
2:00:38objetivo liberar el producto
2:00:40intracelular de forma eficiente,
2:00:42pero sin comprometer la integridad
2:00:44estructural eh del producto y no generar
2:00:47una carga, eh, excesiva excesiva de
2:00:49impurezas difíciles de remover.
2:00:52Esto, pues, también es importante a
2:00:53considerar, o sea, de cómo podemos
2:00:55generar una lisis lo más efectiva
2:00:56posible, que no, hm, desnaturalice o
2:01:00altere la integridad, eh, del producto,
2:01:02digamos, de la proteína terapéutica,
2:01:04eh, y que, además, eh, no mes no
2:01:06introduzca nuevos componentes que tengan
2:01:09que ser, eh, removidos en etapas
2:01:11posteriores. Esto cuando, especialmente
2:01:12cuando utilizamos, eh, pues, métodos
2:01:15químicos para lisis celular.
2:01:18Eh,
2:01:21entonces, ah,
2:01:25aquí, eh, para esto, pues, se pueden
2:01:27utilizar, eh, diferentes, eh, tipos de
2:01:30métodos o, incluso, una mezcla entre
2:01:33estos.
2:01:34Tenemos los métodos mecánicos y físicos,
2:01:36métodos químicos y, también, los
2:01:38métodos, eh, enzimáticos.
2:01:40Eh,
2:01:41cada uno tiene, eh, sus ventajas y sus
2:01:44desventajas.
2:01:45Les digo que, incluso, pues, se puede
2:01:47utilizar, eh, una mezcla de varios de
2:01:48estos métodos para hacer la, eh, la
2:01:50lisis eh, más eficiente, pero, pues, sí
2:01:53hay que tener en cuenta, eh,
2:01:55pues, qué variables están introduciendo
2:01:57aquí, ¿no? O sea, eh,
2:01:59eh, por ejemplo, algo que tienen los
2:02:01métodos, eh, físicos es que,
2:02:04eh, pues, generan mucho estrés, eh,
2:02:07tienen este potencial de desnaturalizar
2:02:10a las proteínas o favorecer su
2:02:11degradación,
2:02:13eh, aunque suelen ser baratos. Eh, por
2:02:15otro lado, los métodos químicos, eh,
2:02:18suelen ser, eh, más efectivos, pero,
2:02:21pues, sí introducen muchos, eh,
2:02:22contaminan contaminantes que tienen que
2:02:24remover después.
2:02:26Entonces, no hay un, o sea, no es como
2:02:28que haya un método ideal, también, pues,
2:02:29va a depender, eh, del sistema.
2:02:31Eh, por ejemplo, acá nosotros en el
2:02:32laboratorio, eh, creo que sí lo
2:02:34mencionábamos, eh, nosotros utilizamos
2:02:36un método, eh,
2:02:38físico-mecánico utili- utilizando, eh,
2:02:41ondas ultrasónicas.
2:02:43Eh,
2:02:45y nosotros tratamos que el el medio en
2:02:47el que se lisaban pues no fuera eh un
2:02:49medio
2:02:51tan agresivo, o sea, que tuviera tantos
2:02:53componentes como eh sales o detergentes.
2:02:56Eh aquí estábamos digamos que
2:02:58sacrificando los posibles rendimientos
2:03:00por no introducir etapas posteriores de
2:03:02purificación, porque teníamos pues la el
2:03:04número de sesiones de laboratorio pues
2:03:06limitadas, entonces no podíamos agregar
2:03:07tantos pasos a la purificación.
2:03:11Entonces, bueno, los métodos mecánicos
2:03:13eh
2:03:15eh yo creo que son pues de los que más
2:03:17eh se utilizan a nivel industrial,
2:03:20particularmente en sistemas microbianos
2:03:21también, porque luego son eh rápidos y
2:03:24baratos.
2:03:25El principio general eh se basa en la
2:03:27aplicación digamos, decíamos, de fuerzas
2:03:29físicas lo suficientemente intensas para
2:03:31superar la resistencia pues de la
2:03:34estructura o de la membrana a la pared
2:03:36celular
2:03:38y liberando el producto intracelular en
2:03:40un medio en un medio líquido.
2:03:42Entonces, la lisis
2:03:45implica la combinación de varios
2:03:46mecanismos al mismo tiempo.
2:03:49Tenemos estrés mecánico o estrés eh de
2:03:51cizalla, donde hay una deformación de la
2:03:54membrana,
2:03:55por ejemplo, por gradientes de
2:03:56velocidad,
2:03:58eh también eh mecanismos, por ejemplo,
2:04:01de impactos o colisiones contra
2:04:03superficies eh o partículas,
2:04:05cavitación, la que esto implica la
2:04:07formación y colapso eh de burbujas que
2:04:09pueden llegar a romper las eh las
2:04:12células,
2:04:13expansión y descompresión rápida,
2:04:16eh
2:04:17al final mmm se pueden, les digo, se
2:04:20pueden utilizar eh varios métodos.
2:04:21Tenemos desde, y depende también en cómo
2:04:23esté el sistema, ¿no? Podemos irnos a
2:04:26eh una lisis utilizando eh perlas de
2:04:29vidrio o incluso, bueno, lo menciono de
2:04:32que pues tal vez esto no se aplique a
2:04:34nivel industrial, pero pues tener eh
2:04:35homogeneizadores de tejidos, que sea
2:04:37básicamente pues una licua como una
2:04:39licuadora.
2:04:40Eh
2:04:41tenemos, decíamos, eh
2:04:44eh ondas ultrasónicas,
2:04:46entre otras, ¿no?
2:04:48Eh entonces
2:04:50cada meca, o sea, cada técnica que se
2:04:52utilice eh pues va a va a generar la
2:04:54ruptura mediante pues mecanismos eh en
2:04:58mecanismos específicos.
2:05:00Eh aquí pues los que vienen señalados eh
2:05:02en la diapositiva, estos tres pues son
2:05:04los que más se utilizan a nivel
2:05:05industrial.
2:05:07En la homogeneización a alta presión eh
2:05:09la suspensión de células se somete a
2:05:10presiones elevadas y se fuerza a pasar a
2:05:13través de una válvula muy estrecha
2:05:15para que haya una eh aceleración extrema
2:05:18del fluido, una caída súbita de la
2:05:20presión y una y por ende una generación
2:05:23de una turbulencia intensa.
2:05:25Esto va a producir una fuerza eh de
2:05:28estrés mecánico y cavitación para romper
2:05:30eh la célula.
2:05:33Eh en esta técnica pues algo que puede
2:05:36eh influir en la eficiencia del proceso
2:05:38pues es la presión de operación, o sea,
2:05:39a mayor eh presión va a haber un mayor
2:05:41grado de ruptura celular, pero también
2:05:44hay que cuidar que esa presión no sea
2:05:45tan elevada como que para que pueda
2:05:47desnaturalizar las proteínas.
2:05:49Eh el número de pases o de ciclos que se
2:05:52utilice,
2:05:53a mayor número de pases, mayor
2:05:55liberación de producto, pero de nuevo eh
2:05:57también hay que tomar en cuenta
2:05:59que pues esto también puede fomentar eh
2:06:01una generación de impurezas mucho más
2:06:03finas que luego pues sean más difíciles
2:06:05de de remover.
2:06:06Ah la temperatura, pues al final este es
2:06:08un estrés mecánico eh
2:06:12también pues por esta fricción genera eh
2:06:14calentamiento, lo cual pues altera la
2:06:16estabilidad del producto.
2:06:18Luego tenemos el molino de perlas. Aquí
2:06:20en la suspensión de células se mezclan
2:06:22con partículas eh sólidas pues que van a
2:06:24ser perlas de vidrio que usualmente eh
2:06:26de vidrio que van a ser agitadas a alta
2:06:28velocidad.
2:06:30Por ende eh la lisis va a ocurrir debido
2:06:33a colisiones directas, las fuerzas de
2:06:35fricción de fricción y la compresión
2:06:36mecánica de las células ante las
2:06:39ante las perlas.
2:06:41Eh, este método se utiliza en células
2:06:44que tienen paredes celulares rígidas.
2:06:47Eh,
2:06:50sin embargo, este se utiliza menos
2:06:53eh, ah, para la producción de
2:06:55biofarmacéuticos porque, pues, genera
2:06:58mucho calor y, además, eh, pues, es es
2:07:01necesario, eh, separar posteriormente
2:07:03las perlas, eh, del producto.
2:07:06Además, eh, el desgaste de las perlas
2:07:08puede eh, introducir partículas
2:07:10adicionales al sistema y, pues,
2:07:12representar un riesgo de contaminación.
2:07:16Luego tenemos el ultrasonido. Eh, este
2:07:18método, pues, como lo hicimos en el
2:07:20laboratorio, está basado en la
2:07:21generación de ondas, eh, de alta
2:07:23frecuencia que van a inducir la
2:07:25cavitación en el medio líquido. El
2:07:28colapso de estas burbujas va a generar
2:07:30un microambiente de alta energía que es
2:07:31capaz, eh, de romper a las células.
2:07:34Eh, aquí, lamentablemente,
2:07:37eh, esta técnica está más limitada a
2:07:40nivel industrial, pues, porque, eh,
2:07:42pues, imagínense, o sea, eh, la cuestión
2:07:45aquí, lo que lo limita es los la
2:07:47dificultad o nivel necesario para para
2:07:51el escalamiento. O sea, imagínense de
2:07:53qué tamaño tienen que ser estos sistemas
2:07:55de de generación de ondas, eh,
2:07:57ultrasónicas.
2:07:59O sea, controlar esto en grandes
2:08:01volúmenes, pues, es más difícil.
2:08:03Mmm, hay que tomar en cuenta también que
2:08:05el ultrasonido, pues, también genera,
2:08:07eh, calentamiento, lo cual aumenta el
2:08:09riesgo de degradación.
2:08:11Ahm,
2:08:13ahora si pasamos a los métodos químicos,
2:08:15esta estos métodos, pues, se basan en la
2:08:18desestabilización de la membrana celular
2:08:20mediante la adición de, eh, agentes que
2:08:23van a alterar, pues, el entorno
2:08:24físico-químico.
2:08:26Ehm,
2:08:28generalmente se utiliza eh una mezcla
2:08:31entre varios de estos eh de estos
2:08:33componentes
2:08:34eh
2:08:36y ofrecen una lisis eh más controlada,
2:08:39incluso pues como dice aquí, podríamos
2:08:40hacerla incluso selectiva.
2:08:43Sin embargo, eh pues la gran desventaja
2:08:46que representa esto en en los
2:08:48biofarmacéuticos pues es que eh
2:08:53es que casi siempre el se sacrifica el
2:08:57rendimiento de la purificación con la
2:08:59estabilidad del producto. O sea, los
2:09:01estos detergentes, cambios en la fuerza
2:09:03iónica o la presencia de agentes
2:09:05caotrópicos o solventes, pues tienden a
2:09:07desnaturalizar
2:09:09eh a las proteínas que están presentes.
2:09:10Entonces, sí podemos recuperar mucha
2:09:12proteína, pero pues no en un estado
2:09:13óptimo.
2:09:15Además, decíamos pues que todos estos
2:09:16componentes pues se tienen que remover
2:09:18en etapas posteriores.
2:09:21Pero bueno, de manera general pues sí
2:09:22podríamos hablar de estos, ¿no? Eh, los
2:09:24detergentes pues ya sabemos que son
2:09:26moléculas eh anfipáticas que tienen pues
2:09:28porciones polares y no polares que
2:09:30interactúan con la bicapa lipídica y la
2:09:33desorganizan.
2:09:35Eh, a concentraciones suficientes los
2:09:37detergentes también pueden llegar a
2:09:39solubilizar completamente eh las
2:09:41membranas, ¿no? Entonces, es bastante eh
2:09:43bastante eficiente.
2:09:45Eh,
2:09:48aquí eh pues se menciona
2:09:51que los detergentes pues pueden generar
2:09:52una lisis en condiciones pues
2:09:54relativamente suaves, o sea, no son tan
2:09:57agresivas para la proteína, pero pues
2:09:59también depende del tipo de detergente
2:10:00que estemos utilizando porque pueden eh
2:10:04interactuar con el producto de interés,
2:10:06¿no? Y más si estamos hablando, por
2:10:07ejemplo, de una proteína que pueda tener
2:10:09regiones hidrofóbicas expuestas.
2:10:12O pues también tenemos eh detergentes
2:10:14pues tanto neutros como aniónicos o
2:10:16catiónicos, entonces esto también puede
2:10:17influir.
2:10:19Pues tenemos los cambios de pH.
2:10:21Eh, cambios de pH a valores muy ácidos o
2:10:24muy básicos pueden desestabilizar
2:10:26también eh, la membrana
2:10:28eh, provocando eh, la ruptura de las
2:10:30células.
2:10:32Esto implica la alteración del estado de
2:10:34ionización de los grupos eh, funcionales
2:10:37tanto de lípidos pero también de
2:10:38proteínas.
2:10:40Eh, aquí pues obviamente esto tampoco es
2:10:43un método muy deseable porque eh, muchas
2:10:46proteínas son sensibles a cambios
2:10:47extremos de pH
2:10:49y pues de nuevo pues una
2:10:50desnaturalización o una posible
2:10:53agregación o degradación química.
2:10:55Luego tenemos el choque osmótico.
2:10:58Esta lisis se basa eh, pues en exponer a
2:11:01las células a un entorno donde hay un
2:11:04desequilibrio de la de la presión
2:11:05osmótica, es decir eh, pues en medios
2:11:08eh, hipertónicos o hipotónicos, ¿no?
2:11:11Eh, por ejemplo colocar en las células
2:11:13en un medio hipotónico provoca la
2:11:16entrada de agua
2:11:18eh, lo que genera un aumento de presión
2:11:20interna que puede llevar a la ruptura de
2:11:21la membrana.
2:11:23Eh, este método pues es ah,
2:11:26relativamente
2:11:28eh, pues eso no es tan agresivo como los
2:11:30cambios de pH.
2:11:32Eh, sin embargo pues su eficacia depende
2:11:34del eh, pues del tipo del tipo celular,
2:11:37obviamente pues eh, células que son
2:11:39mucho más que tienen paredes muy rígidas
2:11:41pues son más resistentes a este tipo de
2:11:42lisis.
2:11:44También tenemos el uso de agentes
2:11:46caotrópicos y solventes como la urea, la
2:11:49tiourea o la guanidina
2:11:52que estos van a desestabilizar la
2:11:53estructura eh, de las tanto de membranas
2:11:56como también eh, de las proteínas al
2:11:58interferir con las interacciones
2:12:00hidrofóbicas y los puentes de hidrógeno.
2:12:03Eh, también ah, de manera similar pues
2:12:06pueden actuar algunos solventes eh,
2:12:07orgánicos pues para ayudar a disolver a
2:12:10disolver la membrana.
2:12:12Eh, aquí bueno pues también tenemos la
2:12:13desventaja que esto puede eh, pues
2:12:16desnaturalizar, desnaturalizar el
2:12:18producto.
2:12:20Luego tenemos los métodos enzimáticos,
2:12:24que, eh, estos pues se usan, eh, pues de
2:12:27manera muy, muy selectiva para degradar
2:12:29ciertos componentes, eh, estructurales
2:12:32de la célula,
2:12:33por ejemplo, la pared, ¿no?
2:12:35Eh,
2:12:37en, es, por ejemplo, en sistemas
2:12:39bacterianos se utiliza, eh, mucho la, la
2:12:41lisozima, que estaba a hidrolizar
2:12:44agentes, perdón, eh, enlaces,
2:12:47eh, en los peptidoglicanos para
2:12:49debilitar la pared.
2:12:51En levaduras, eh, se pueden utilizar
2:12:54mezclas de glucanasas, eh, manasas y
2:12:57otras proteasas.
2:12:59Eh,
2:13:01y esto, por ejemplo, si se, si se mezcla
2:13:04con alguno de estos otros métodos, eh,
2:13:06mecánicos o químicos, pues puede a,
2:13:09ayudarla a incrementarle a, la
2:13:11eficiencia del proceso.
2:13:13Eh,
2:13:15aquí una ventaja que tienen los métodos
2:13:17enzimáticos, pues como también son
2:13:19proteínas, pues es que operan en
2:13:21condiciones, eh, más gentiles de pH y
2:13:24temperatura para favorecer la
2:13:26estabilidad de las proteínas
2:13:28terapéuticas o del producto que
2:13:29queremos, eh, recuperar.
2:13:31Sin embargo, eh, pues tenemos el, eh, el
2:13:34punto también que, pues trabajan en
2:13:36condiciones muy específicas, ¿no?
2:13:38Eh,
2:13:40eh, por ejemplo, decíamos de pH, de
2:13:42temperatura o la presencia de de algún
2:13:45cofactor,
2:13:47pues para que la reacción, eh, sea
2:13:48eficiente.
2:13:49También pues los tiempos de reacción, o
2:13:51sea, pues requiere de, eh, de cierto
2:13:53tiempo, generalmente pues tiempos más
2:13:55prolongados que los que se obtendrían
2:13:56nada más con un método mecánico, un
2:13:58método químico, entonces esto también,
2:14:00acuérdense que pues, eh,
2:14:02los tiempos pues van a influir en los
2:14:03costos del proceso.
2:14:05Eh,
2:14:07además, eh, hay que estandarizar pues
2:14:10la, con, la,
2:14:11la concentración, o sea, la relación eh
2:14:13del, de la enzima con el con el
2:14:16sustrato.
2:14:18Eh y pues que al final la escalabilidad
2:14:22de estos sistemas
2:14:23pues también requiere el uso de
2:14:26pues podríamos decir de biorreactores,
2:14:28donde no se va a estar controlando eh
2:14:30de manera tan específica como si fuera
2:14:32un cultivo celular, pero eh pues sí se
2:14:36van a controlar todos estos todos estos
2:14:38parámetros.
2:14:40Am, ahí em les digo que al final pues se
2:14:43tiene que encontrar un punto de
2:14:45equilibrio donde em
2:14:49pues tengamos esta cuestión de pues de
2:14:51la velocidad, los rendimientos y que
2:14:53también no sea un método tan tan
2:14:55agresivo. En ese sentido yo creo que los
2:14:58métodos mecánicos pues son de podrían
2:15:00ser de los más preferidos a nivel
2:15:01industrial.
2:15:05Eh otro punto importante que pudiera ser
2:15:08necesario incluir en el procesamiento
2:15:11downstream, especialmente obviamente
2:15:14cuando hablamos de sistemas eh
2:15:15bacterianos, es cuando eh pues se forman
2:15:18o la proteína eh se eh
2:15:22se acumula en cuerpos de inclusión.
2:15:24Eh los cuerpos de inclusión pues son
2:15:26agregados intracelulares densos, pues de
2:15:29que generalmente van a contener altas
2:15:31concentraciones de la proteína
2:15:32recombinante
2:15:34y que se forman cuando la proteína se
2:15:36sintetiza a una velocidad que supera la
2:15:38capacidad de plegamiento correcto o
2:15:40cuando eh la la célula bacteriana no
2:15:44tiene eh pues los sistemas eh apropiados
2:15:46para garantizar este plegamiento.
2:15:50Eh eso también va a estar influenciado
2:15:52por la temperatura de cultivo, la
2:15:54composición del medio y por la propia
2:15:56naturaleza de la proteína.
2:15:59Em
2:16:01en general pues el hecho de que el
2:16:02producto se encuentre en cuerpos de
2:16:04inclusión
2:16:05va a cambiar la estrategia del
2:16:07procesamiento downstream y deben de
2:16:09incluirse etapas adicionales.
2:16:13Que están marcadas aquí, que eh viene, o
2:16:15sea, que recuperarlos, solubilizarlos y
2:16:17replegarlos. Y aquí vale la pena aclarar
2:16:20que parte de la recuperación incluye una
2:16:22etapa de lavado.
2:16:24Eh en la etapa de recuperación
2:16:27eh
2:16:29los cuerpos de inclusión pues ya sabemos
2:16:30que son pues complejos de proteína eh
2:16:33agregada.
2:16:34Eh pues es material eh particulado.
2:16:38Em tiene un rango pues de tamaño del
2:16:41submicrométrico a micrométrico.
2:16:43Eh por lo tanto son más densos que la de
2:16:45que la del medio acuoso. Entonces esto
2:16:47permite
2:16:48que se sedimenten con relativa facilidad
2:16:50bajo ciertas condiciones eh de
2:16:52centrifugación, digamos como en un punto
2:16:53intermedio eh para separarlos de pues de
2:16:57res otros restos celulares.
2:16:59Em Aquí pues, o sea, esto es una ventaja
2:17:02porque nos permite recuperar con cierta
2:17:04facilidad los cuerpos de inclusión que
2:17:06van a tener una alta concentración de
2:17:07proteína.
2:17:09Sin embargo, pues decíamos que esto pues
2:17:11también puede incluir otros
2:17:12contaminantes, fragmentos de membrana,
2:17:14otros restos celulares, lípidos, o
2:17:16material coloidal, pero pues
2:17:17principalmente pues proteína mal
2:17:19plegada.
2:17:21Por eso esta parte de que se agregue
2:17:22esta etapa de
2:17:24de replegamiento.
2:17:26Em Para para la recuperación eh la
2:17:30operación más común pues es la
2:17:31centrifugación.
2:17:33Em donde se recupera eh la pastilla
2:17:36celular
2:17:37y permite pues esta primera etapa de
2:17:39enriquecimiento.
2:17:42Em En algunos casos eh se puede agregar
2:17:45una etapa eh de filtración.
2:17:48Cuando por ejemplo se quiere eliminar eh
2:17:50fracciones más finas o mejorar el
2:17:52producto clarificado.
2:17:54Luego seguiría una etapa de lavado de
2:17:56los cuerpos de inclusión.
2:17:58Eh para remover pues ciertas eh ciertas
2:18:01impurezas. Usualmente utilizando eh
2:18:05soluciones am eh con sales, agentes
2:18:08quelantes o detergentes muy suaves en
2:18:10concentraciones muy bajas para ayudar a
2:18:11remover pues todas estas eh
2:18:15impurezas, ¿no?
2:18:17Es el eh buscamos eliminar eh
2:18:19contaminantes sin solubilizar
2:18:21completamente la proteína.
2:18:23Eh
2:18:26Luego eh pasamos a la
2:18:29a la etapa de solubilización.
2:18:32Eh ya una vez que se ha retirado eh pues
2:18:34el resto de los contaminantes,
2:18:36eh
2:18:38ah pues hay que solubilizar esos cuerpos
2:18:40de inclusión. Entonces, para esto
2:18:42eh pues se utilizan eh
2:18:47agentes desnaturalizantes.
2:18:51Eh
2:18:54por ejemplo, con el uso de eh
2:18:57urea,
2:18:58eh la guanidina, o sea, deseamos agentes
2:19:00eh agentes caotrópicos.
2:19:03Puede aumentarse eh la concentración en
2:19:06la concentración de detergentes y de
2:19:08algunos eh de algunos sales, de algunas
2:19:11sales, perdón.
2:19:12Eh agentes reductores para que se rompan
2:19:14los puentes disulfuro, por ejemplo, el
2:19:16DTT eh o el 2-mercaptoetanol.
2:19:19Pero eh ojo,
2:19:21pues estos son componentes que se tienen
2:19:22eh que se tienen que remover.
2:19:26Eh
2:19:29Luego tenemos, o sea, aquí pues en este
2:19:31caso vamos a recuperar ahora sí en una
2:19:33fracción soluble
2:19:34eh la proteína, pero eh pues
2:19:37desnaturalizada y deseamos con
2:19:39componentes que no queremos que estén
2:19:40presentes. Entonces, la etapa siguiente
2:19:42pues es la de eh replegamiento, ¿no?
2:19:45Donde
2:19:46tratamos pues de recuperar esa
2:19:48estructura eh tridimensional eh nativa.
2:19:52Ojo, esto va a depender eh del producto
2:19:56y que pues las condiciones permitan este
2:19:58replegamiento, que esa desnaturalización
2:20:00sea reversible.
2:20:02Eh
2:20:04entonces
2:20:05el reto aquí pues es favorecer además el
2:20:08plegamiento eh el plegamiento correcto.
2:20:12Mmm esto se hace eh usualmente de
2:20:14mediante la eliminación controlada de
2:20:16los agentes desnaturalizantes.
2:20:18Mmm un ejemplo muy sencillo, una técnica
2:20:21muy sencilla de estas pues sería una
2:20:23dilución
2:20:25eh
2:20:26dilución por ejemplo eh en agua para
2:20:28reducir las las concentraciones pues
2:20:31estos agentes desnaturalizantes, pero
2:20:33con la desventaja que pues también esto
2:20:34va a reducir la concentración eh del
2:20:38producto o el que se tenga que trabajar
2:20:40con volúmenes muy grandes.
2:20:42Mmm otra técnica que se puede utilizar
2:20:44en el replegamiento eh que yo creo que
2:20:46esta es la más favorable es la diálisis
2:20:49donde eh la proteína se expone de manera
2:20:51gradual a condiciones eh de menor
2:20:53concentración del agente
2:20:54desnaturalizante, o sea, esa es sería
2:20:56como una
2:20:57eh dilución eh controlada donde se
2:21:00utilizan eh membranas semipermeables que
2:21:02también de un poro específico que van a
2:21:04permitir este intercambio o esta
2:21:06dilución de estos agentes eh
2:21:08desnaturalizantes de menor tamaño que la
2:21:10proteína, pero van a mantener atrapada
2:21:12eh a la proteína.
2:21:15Eh también se pueden utilizar eh pues
2:21:17alguna incluso algún tipo de eh
2:21:20de cromatografía.
2:21:22Entonces eh pues un punto que hay que
2:21:26ver
2:21:27eh
2:21:28pues cuál es el impacto que tiene todo
2:21:30esto en el rendimiento eh en global.
2:21:33Aquí pero o sea, decíamos tenemos la
2:21:35ventaja que el hecho que la proteína
2:21:36esté en cuerpos de inclusión pues nos
2:21:38permite eh pues recuperar una gran
2:21:41cantidad de proteína.
2:21:43Sin embargo, puede haber pérdidas
2:21:44importantes durante la solubilización y
2:21:47el replegamiento. O como decíamos eh en
2:21:50algunos casos la desnaturalización puede
2:21:52ser irreversible. Entonces, pues hay que
2:21:55tomar, eh, hay que tomar esto en cuenta,
2:21:57¿no? Además, eh, pues el uso de, eh, la
2:22:00separación a través de cuerp, o sea, de
2:22:02cuerpos de inclusión, pues incluye pasos
2:22:04adicionales. Entonces,
2:22:06pues eso también hace más complejo el
2:22:08proceso y hace más propenso, pues a que
2:22:10haya, eh, errores, eh, riesgos de
2:22:12contaminación, eh, y pues
2:22:14principalmente, eh, pues bajen, eh,
2:22:16bajen los rendimientos.
2:22:18Ah,
2:22:20La siguiente etapa en el procesamiento
2:22:22downstream sería la clarificación. En
2:22:25esta etapa, el objetivo principal es
2:22:27remover los sólidos suspendidos y todo
2:22:30el material particulado del sistema,
2:22:32generando un efluente, una corriente
2:22:34líquida que vaya a ser adecuada para las
2:22:36etapas, eh, de purificación ya más
2:22:39selectivas que deseamos, eh,
2:22:40generalmente, pues, o sea, lo que
2:22:42seguiría a partir de aquí es la, el
2:22:44proceso de captura cromatográfica.
2:22:47Eh,
2:22:50aquí, eh,
2:22:53la pri, ah, aquí hay que que tomar en
2:22:55cuenta, pues que los,
2:22:57se puede utilizar, o sea, se utiliza
2:22:59mucho como una etapa de clarificación,
2:23:01eso es bastante eficiente,
2:23:03utilizar también, eh, la centrifugación
2:23:06o la filtración, lo que veíamos en las
2:23:09en las diapositivas anteriores, o sea,
2:23:11hablando de, eh, el proceso de
2:23:13recuperación del producto. Eh, sin
2:23:15embargo, pues también, eh, pues se
2:23:17pueden utilizar, eh, otras, eh, otras
2:23:21técnicas o eh, complementarlas
2:23:23con estas, eh, como viene aquí, estas
2:23:25estrategias, eh, de acondicionamiento,
2:23:29eh, para, pues, mejorar la eficiencia,
2:23:33¿no? O sea, o sea, junto con la
2:23:34centrifugación o la filtración, se
2:23:36pueden utilizar estas otras técnicas que
2:23:38son la, eh, la floculación, la
2:23:40precipitación, cristalización o incluso,
2:23:43eh, la, la separación en, en fases
2:23:46acuosas.
2:23:48En la floculación, eh aquí pues mmm hay
2:23:51que considerar que pues tenemos un eh un
2:23:54sistema mmm coloidal, unas partículas eh
2:23:57en su en suspensión, que este estado o
2:24:01este comportamiento va a estar regido
2:24:03principalmente por un equilibrio entre
2:24:04fuerzas eh de atracción y repulsión.
2:24:08Eh
2:24:09repulsión eh principalmente en sistemas
2:24:11biológicos van a va a ser repulsión eh
2:24:13electrostática.
2:24:15Entonces, lo que hace eh la floculación
2:24:17es alterar este este equilibrio.
2:24:20Dependiendo del agente que se utilice,
2:24:22eh puede ocurrir eh la floculación o la
2:24:25agregación mediante neutralización de de
2:24:27cargas, la formación entre de puentes
2:24:30entre partículas o la reducción de la
2:24:32repulsión electrostática.
2:24:34Como resultado, eh las partículas se
2:24:36acercan lo suficiente para que las
2:24:38fuerzas de atracción dominen y se formen
2:24:40eh agregados que pues van a eh pues que
2:24:43van a generar un un un agregado de mayor
2:24:45densidad eh en el sistema en el que
2:24:47están inmersos y pues van a van a
2:24:50precipitarse, podemos decir.
2:24:52Aquí eh pues se pueden utilizar
2:24:54diferentes agentes eh floculantes, por
2:24:56ejemplo, polímeros catiónicos, eh donde
2:24:59se agregan eh agentes que tienen eh
2:25:03eh
2:25:05que van a interaccionar con partículas
2:25:07que tienen eh carga negativa, como las
2:25:09células del ADN.
2:25:11Eh y por ende eh promover la agregación
2:25:14de estas. Eh en dentro de estos eh
2:25:16polímeros catiónicos tenemos la
2:25:18polietilenimina
2:25:20o el polidia dialil dimetil amonio
2:25:24o también eh poliacrilamidas
2:25:26modificadas.
2:25:27También se pueden utilizar eh sales
2:25:29multivalentes, como el cloruro de
2:25:30calcio, cloruro de magnesio, sulfato de
2:25:33aluminio o cloruro férrico.
2:25:36Estos van a reducir la repulsión
2:25:37electrostática al comprimir la la capa
2:25:40eléctrica alrededor de las partículas.
2:25:43Ah, para la en muchos casos eh se puede
2:25:46utilizar para la floculación
2:25:47combinaciones de pues varios tipos de
2:25:49estos agentes pues para favorecer la
2:25:50formación de estos eh de estos flóculos.
2:25:54Mmm.
2:25:55Una de las
2:25:56principales desventajas de la eh
2:25:59floculación es la posible posible
2:26:01coagregación del producto con los
2:26:03flóculos. Pues es decir que puede ser eh
2:26:05no tan selectivo.
2:26:07Lo cual puede resultar en pérdidas eh en
2:26:10el en el rendimiento.
2:26:13Otro aspecto pues es que se van a
2:26:14introducir nuevos componentes al sistema
2:26:16que deben de ser removidos en etapas
2:26:18en etapas posteriores.
2:26:21Luego tenemos la precipitación.
2:26:23Que esta eh pues es una operación donde
2:26:26se induce una transición eh de las
2:26:28proteínas del estado soluble al estado
2:26:31insoluble.
2:26:33Y como consecuencia una disminución eh
2:26:35controlada de su solubilidad.
2:26:38Acordémonos eh
2:26:40que la solubilidad de una proteína va a
2:26:42depender de este equilibrio entre las
2:26:44interacciones proteína-proteína y
2:26:46proteína-solvente.
2:26:49Eh entonces cuando las condiciones
2:26:52del medio eh favorecen las interacciones
2:26:54intermoleculares por encima de la
2:26:56hidratación de la proteína se induce una
2:26:58agregación y la posterior precipitación.
2:27:02Eh para esto
2:27:04suelen utilizarse eh
2:27:08varios mecanismos de precipitación. Por
2:27:11ejemplo tenemos el salting out, que yo
2:27:13creo que este es el más común, donde eh
2:27:15pues se utilizan eh
2:27:18sales a altas concentraciones.
2:27:21Estas eh estas sales van a eh pues
2:27:24interaccionar con el agua, o sea,
2:27:26formando pues o sea, estos puentes estos
2:27:28puentes de hidrógeno con el agua y por
2:27:30ende van a reducir la cantidad de agua
2:27:32disponible para que va a estar y va a
2:27:34entrar en contacto eh con las proteínas.
2:27:38Eh entonces eh pues decimos que las
2:27:41moléculas de sal van a competir por la
2:27:42hidratación y esto va a favorecer estas
2:27:45interacciones proteína proteína
2:27:48formando eh formando agregados.
2:27:51Eh también se puede hacer eh con cambios
2:27:53eh de pH. Esto también, pues recordemos
2:27:56que cada proteína pues tiene eh
2:27:59eh un punto isoeléctrico
2:28:03eh donde su carga eh su carga neta pues
2:28:05es cero, lo cual va a disminuir eh la
2:28:08repulsión electrostática entre las
2:28:10moléculas y por ende pues va a facilitar
2:28:12esta esta precipitación.
2:28:14También se puede hacer uso eh de
2:28:16solventes eh orgánicos, por ejemplo eh
2:28:19con acetona,
2:28:21donde eh la constante dieléctrica del
2:28:24medio de estos solventes va a alterar de
2:28:26nuevo estas estas interacciones.
2:28:29Eh aquí, por ejemplo, lo que se muestra
2:28:32en la figura
2:28:36eh lo que se muestra aquí en esta figura
2:28:38es justamente un perfil eh de
2:28:40solubilidad, en este caso de la de la
2:28:42albúmina humana y de una
2:28:45inmunoglobulina, dependiendo eh pues de
2:28:48la concentración, en este caso pues de
2:28:50citrato de sodio, ¿no? Entonces
2:28:52mhm pues aquí este este perfil
2:28:55eh o obviamente esto sería como una
2:28:56curva de solubilidad utilizando sales.
2:29:00Eh pues este perfil va a ser específico
2:29:02eh de cada proteína, entonces
2:29:04de al ser relativamente selectivo
2:29:07eh podemos separar eh la proteína eh
2:29:10pues de otros eh de otros componentes,
2:29:12¿no? Obviamente eh utilizando pues
2:29:15posteriormente eh centrifugación y eh
2:29:18volver a solubilizar la proteína pues
2:29:20simplemente reduciendo la concentración
2:29:23eh pues ya de las sales o de los o
2:29:24removiendo los solventes, ¿no?
2:29:28Ehm
2:29:30Aquí, bueno, el detalle es que decíamos
2:29:32que
2:29:33la selectividad pues no siempre no
2:29:36siempre es exclusiva solamente de una
2:29:37sola proteína, se pueden coprecipitar
2:29:40algunas
2:29:41algunas impurezas. Eh, también luego a
2:29:44veces sucede esto que decíamos que la
2:29:47desnaturalización o esta precipitación
2:29:49puede producir una desnaturalización
2:29:52irreversible, entonces hay que tomar en
2:29:54cuenta eso. O sea, que ese no sea el
2:29:55caso.
2:29:58Eh.
2:30:00Otro
2:30:02otra técnica que se utiliza es la
2:30:04cristalización, aunque esta no es tan no
2:30:07es tan común a nivel industrial porque
2:30:08pues depende mucho de las
2:30:09características del producto. Pero si se
2:30:12logra hacer
2:30:13pues puede ser una técnica bastante
2:30:14eficiente y bastante selectiva.
2:30:17Eh, la aquí pues ocurre algo muy similar
2:30:20donde se juega con la solubilización de
2:30:23las proteínas pero de una forma
2:30:24diferente.
2:30:26Eh, aquí pues en la cristalización las
2:30:29proteínas se organizan en una red
2:30:31tridimensional altamente ordenada, por
2:30:33ende pues formando pues un cristal que
2:30:35es un sólido, ¿no? Un sólido cristalino
2:30:37que va a tener una composición y
2:30:39estructura definida.
2:30:41Y que suele ser suele darse en proteínas
2:30:44en condiciones muy muy muy particulares.
2:30:47Entonces, como les digo, si encontramos
2:30:49las condiciones en las que una proteína
2:30:51puede cristalizar, pues replicamos estas
2:30:53condiciones
2:30:54y se puede utilizar para purificar y
2:30:57concentrar el producto decíamos con una
2:30:58alta selectividad.
2:31:01Aquí para que una proteína se pueda
2:31:03cristalizar
2:31:05se requiere que el sistema alcance un
2:31:08estado de sobresaturación
2:31:11pero a un punto eh
2:31:14donde no o sea, que estemos, o sea, si
2:31:16esto es una curva de solubilidad de una
2:31:18proteína
2:31:20dependiendo de pues una mezcla de
2:31:22agentes eh
2:31:24de agentes cristalizantes
2:31:26eh, estamos en esta zona de
2:31:28supersaturación, pero que si nos pasamos
2:31:30de ese punto, pues nos vamos a la
2:31:32precipitación o que se separen eh dos
2:31:34fases. Debemos estar en un punto
2:31:36específico donde se lleva a cabo esta
2:31:40que llaman esta zona eh de de
2:31:43nucleación. Donde eh las moléculas de la
2:31:46proteína van a abandonar la fase líquida
2:31:48y se van a incorporar a una fase eh
2:31:50sólida eh ordenada.
2:31:54Encontrar esta zona de de nucleación es
2:31:57una zona metaestable.
2:31:59¿Sí? Donde ocurre esta nucleación
2:32:02espontánea, o sea, esta generación y
2:32:03crecimiento de los cristales.
2:32:06Eh
2:32:10una vez que se llega a esta zona de
2:32:12nucleación, el cristal va a ir
2:32:14creciendo.
2:32:15El crecimiento de un cristal, pues se
2:32:16refiere a la incorporación ordenada de
2:32:18más moléculas de eh de estos núcleos,
2:32:20que es un proceso pues bastante eh
2:32:25hm
2:32:27bastante ordenado, una vez que ya
2:32:29eh que ya que ya se da.
2:32:33Eh esto, por ejemplo, permite reducir la
2:32:35variabilidad y dirigir el tamaño final
2:32:37de los eh de los cristales.
2:32:40Ah, aquí, pues las estrategias o bueno,
2:32:42la la cristalización se puede inducir
2:32:45mediante puede ser, o sea, de nuevo, va
2:32:47a depender eh pues de la estructura
2:32:49completa eh de una proteína y de sus
2:32:52pues por ende sus propiedades
2:32:53fisicoquímicas,
2:32:54pero puede hacerse eh por enfriamiento
2:32:56controlado, por la adición eh de agentes
2:32:59precipitantes suaves, por ejemplo, sales
2:33:01y también gradientes de pH o incluso
2:33:04pues una combinación de de todos estos
2:33:07factores.
2:33:08Eh
2:33:11una vez que se forman los cristales,
2:33:12pues estos se separan mediante
2:33:13filtración o centrifugación y luego pues
2:33:15pueden someterse los cristales eh a
2:33:17lavados para remover pues todas estas eh
2:33:20impurezas y luego volver a eh
2:33:23redisolver eh la proteína, ¿no? Algo
2:33:26similar eh de lo que ocurre con la
2:33:28precipitación. Eh pero a diferencia
2:33:31eh de la precipitación, aquí no ocurre
2:33:35como tal una hm desnaturalización eh de
2:33:38la proteína, simplemente lo que hace es
2:33:39que se se va aglomerando de una forma eh
2:33:42de una forma ordenada.
2:33:44Eh esta estrategia de cristalización
2:33:45puede disminuir considerablemente eh los
2:33:48costos y las cargas eh operativas.
2:33:51Sin embargo, pues yo creo que eh la
2:33:53principal desventaja es que, pues
2:33:55decíamos, no todas las proteínas son
2:33:56cristalizables y más, pues si son muy
2:33:58complejas.
2:34:00Eh yo he visto eh protocolos reportados
2:34:04donde, de hecho, se utiliza eh la
2:34:05cristalización como método de
2:34:06separación, esto yo lo he visto
2:34:08reportado eh en la insulina.
2:34:10Habrá algunas proteínas que no sean
2:34:12cristalizables, entonces, pues esta no
2:34:13va a ser no va a ser una opción, pero
2:34:15pues si se puede, yo creo que eso es
2:34:16algo que se que se debería de explotar.
2:34:19Eh y luego, por último, otra etapa eh
2:34:22otra estrategia de acondicionamiento,
2:34:24pues tenemos eh la
2:34:27eh la extra- la extracción en dos fases
2:34:31acuosas.
2:34:32Eh esta, pues se basa en la separación
2:34:36eh en la formación de dos fases líquidas
2:34:38inmiscibles,
2:34:39ambas predominantemente acuosas y que se
2:34:42va a dar por una eh combinación de
2:34:45polímeros o sales a concentraciones eh
2:34:48adecuadas.
2:34:49Entonces, aquí lo que tenemos es eh que
2:34:51cuando ciertas combinaciones de estos
2:34:54componentes, por ejemplo, puede ser eh
2:34:56polietilenglicol,
2:34:58dextrano, sales de fosfato, se mezclan a
2:35:01concentraciones específicas,
2:35:04eh se genera eh se generan dos fases.
2:35:08En dos fases líquidas debido a
2:35:10incompatibilidades termodinámicas.
2:35:13Eh ambas eh ambas fases van a contener
2:35:17agua, pero eh pues la composición, la
2:35:19densidad o la viscosidad pues va a ser
2:35:21diferente.
2:35:22Entonces, esto va a generar un entorno
2:35:24donde pues diversas biomoléculas
2:35:26biomoléculas pueden distribuirse a una u
2:35:29otra a una u otra fase.
2:35:32Esto puede ayudar eh a a separar, por
2:35:35ejemplo,
2:35:37eh proteínas, ADN, lípidos u u otras
2:35:40partículas, ¿no? Dependiendo de esta eh
2:35:43hidrofobicidad o carga que puedan
2:35:45adquirir en la en en esta en este
2:35:47gradiente de fases.
2:35:49Eh,
2:35:50esta, por ejemplo, esta técnica de
2:35:52separación se utiliza
2:35:55eh
2:35:57eh se utiliza eh en sistemas donde eh
2:36:01pues digamos la proteína recombinante eh
2:36:04se separa en una fase diferente en la
2:36:06que se tendría tendería a distribuir eh
2:36:10el ADN o los lípidos.
2:36:12Ah, aquí eh
2:36:16entonces también puede ser eh puede ser
2:36:17una ventaja porque eh esta este tipo de
2:36:21separación no suele inducir
2:36:23desnaturalización del eh de las
2:36:25proteínas.
2:36:29La etapa siguiente es la etapa de
2:36:31captura. Esta eh corresponde a la
2:36:35primera etapa ya de este procesamiento
2:36:37ya más fino
2:36:39eh
2:36:41en el procesamiento downstream y tiene
2:36:43como objetivo aislar el producto de
2:36:44interés desde una corriente compleja,
2:36:47este frente que ya hemos estado
2:36:49trabajando.
2:36:50Lo concentra eh bueno, concentrándolo y
2:36:52eliminando una a una eliminando una
2:36:54fracción significativa eh de impurezas.
2:36:58Esta etapa trabaja a nivel eh molecular
2:37:01aprovechando las propiedades
2:37:02fisicoquímicas del producto o de los
2:37:04contaminantes.
2:37:06La captura es una etapa donde se
2:37:08prioriza la capacidad,
2:37:11la velocidad y la robustez,
2:37:14manteniendo una selectividad suficiente
2:37:17para reducir la complejidad del sistema
2:37:19antes de etapas posteriores que
2:37:20requieren una mayor resolución.
2:37:24Esto implica eh concentrar el producto
2:37:27desde grandes volúmenes, eliminar
2:37:29impurezas críticas y generar una
2:37:31corriente compatible.
2:37:33Esta etapa es muy importante porque
2:37:35tiene un impacto desproporcionado en el
2:37:37proceso global, es super super
2:37:39importante. Pérdidas del producto en
2:37:42esta etapa son muy difíciles de
2:37:44recuperar posteriormente. O, por
2:37:46ejemplo, una captura eh deficiente va a
2:37:48incrementar eh la carga eh o, bueno, sí,
2:37:51eh el peso en etapas que van a suelen
2:37:54ser más costosas.
2:37:56Por lo tanto, eh pues se debe de
2:37:58de elegir adecuadamente.
2:38:01Al final, eh la captura
2:38:04se basa en la explotación de sus
2:38:05propiedades fisicoquímicas del producto,
2:38:07como la afinidad, la carga, el tamaño,
2:38:10la hidrofobicidad o el grado de
2:38:12solubilidad que pudiera tener en
2:38:14diferentes medios.
2:38:16En general, la captura eh consiste en
2:38:20hacer interactuar el producto con una
2:38:21fase estacionaria o un sistema de
2:38:23separación bajo condiciones donde se
2:38:25favorezca su retención. Es decir, pues
2:38:28utilizar técnicas cromatográficas, donde
2:38:31se va a retener el producto mientras que
2:38:33otras impurezas van a permanecer en
2:38:35solución y se van a arrastrar.
2:38:38Posteriormente, el producto se va a
2:38:40eluir bajo condiciones controladas y se
2:38:42puede recuperar.
2:38:44Para esto,
2:38:46pueden utilizarse diferentes tipos eh de
2:38:48cromatografías. O sea, les digo, aquí en
2:38:50esta etapa, lo más frecuente es que se
2:38:52utilice la croma una un paso
2:38:54cromatográfico.
2:38:56No necesariamente van a ser estas dos
2:38:58que vienen eh señaladas en la
2:39:00diapositiva. Estas, digamos, que son las
2:39:03más comunes que se utilizan en esta
2:39:05etapa, pero de nuevo,
2:39:07tanto estas pueden utilizarse en etapas
2:39:09posteriores como en la etapa de captura
2:39:11pueden utilizarse otras. De nuevo, esto
2:39:13todo va a depender eh pues de las
2:39:15propiedades fisicoquímicas del producto
2:39:16y de la propiedad que queramos eh
2:39:18explotar.
2:39:20Eh vamos a hablar primero de la
2:39:22cromatografía de afinidad.
2:39:24Esta es una técnica, igual que todas las
2:39:26cromatografías, es una técnica de
2:39:27separación, pero esta se basa de manera
2:39:30particular en la interacción específica
2:39:32y reversible obviamente y reversible
2:39:36entre el producto de interés y un
2:39:38ligando específico que va a estar
2:39:40inmovilizado en la fase estacionaria, en
2:39:42una matriz sólida.
2:39:45Esta esta
2:39:47técnica de separación
2:39:49es la más
2:39:51poderosa
2:39:52o la más importante que podríamos
2:39:54explotar eh dentro del procesamiento
2:39:56downstream, ya que transforma este
2:39:58efluente que va a estar pues que va a
2:40:00contener eh pues una mezcla bastante
2:40:03compleja eh de moléculas en una fracción
2:40:06significativamente enriquecida del
2:40:08producto en una sola etapa.
2:40:11Eh el punto es encontrar
2:40:13ese ligando que sea pues específico para
2:40:17esa molécula, ¿no?
2:40:19Ah el principio de la cromatografía de
2:40:21afinidad radica en la formación de estas
2:40:24interacciones uniones uniones
2:40:26específicas entre el producto y un
2:40:28ligando, ¿no?
2:40:30Ah aquí, por ejemplo, podría ser
2:40:33por decir algo, un anticuerpo que se une
2:40:36a
2:40:37mmm
2:40:40que se une al antígeno de interés, el
2:40:41cual va a estar fijado en la fase en la
2:40:44fase estacionaria, ¿no?
2:40:46Estas interacciones pues pueden incluir
2:40:48enlaces no covalentes como fuerzas
2:40:49electrostáticas, interacciones
2:40:51hidrofóbicas, eh puentes de hidrógeno y
2:40:54en algunos casos pues se damos pues este
2:40:55recono- este reconocimiento altamente eh
2:40:58específico.
2:41:00La matriz que suele utilizarse en estas
2:41:02cromatografías, pues eso va a ser un
2:41:04material poroso, generalmente eh agarosa
2:41:07o algún polímero sintético, que va a
2:41:09estar diseñado para eh ofrecer una alta
2:41:12área superficial
2:41:14y que además permita la difusión del
2:41:16producto hacia estos sitios en estos
2:41:18sitios de unión o de exposición al
2:41:20ligando.
2:41:21Aquí el el punto medular eh de la
2:41:24cromatografía de afinidad, pues va a ser
2:41:26el ligando.
2:41:27Ese es la que va a ser responsable de la
2:41:29de la especificidad.
2:41:31Ah por ejemplo, ya habíamos mencionado
2:41:35que la cromatografía de afinidad a por
2:41:37ejemplo, la proteína se utiliza para
2:41:39purificar inmunoglobulinas que con una
2:41:42alta selectividad. Pero de nuevo, podría
2:41:44utilizarse en el caso de los
2:41:45anticuerpos, pues eh como ligando, pues
2:41:48el antígeno al que va a ser afín eh el
2:41:51anticuerpo, ¿no?
2:41:52Podría eh también eh por ejemplo,
2:41:55decíamos las am proteínas con etiquetas
2:41:58de poliestirena, pues que van a ser eh
2:42:00afines a metales divalentes, pues se
2:42:02pueden utilizar eh columnas
2:42:04cromatográficas de afinidad eh al
2:42:06níquel, al cobalto o al zinc.
2:42:10Entonces, este ligando
2:42:12va a estar unido a la fase estacionaria,
2:42:14usualmente con un linker.
2:42:17Eh
2:42:18y pues en general podríamos eh dividir
2:42:21la cromatografía de afinidad eh en
2:42:24varias etapas.
2:42:26Primero, la columna se va a equilibrar
2:42:29en condiciones que van a favorecer la
2:42:31unión al ligando.
2:42:33Luego se carga eh se carga la muestra,
2:42:36permitiendo que el producto eh
2:42:37interaccione con la fase estacionaria y
2:42:40sea retenida, mientras que las impurezas
2:42:43van a eluir primero, ¿sí?
2:42:46Que sería eh ay, perdón, eh esta esta
2:42:49porción pues sería todas estas am
2:42:53proteínas o componentes de la mezcla o
2:42:54de nuestro efluente que no van a
2:42:56interaccionar con la fase estacionaria.
2:42:59Eh, después de la carga se realiza un
2:43:01lavado para eliminar, pues también,
2:43:02todas al las impurezas que pudieran
2:43:05estar eh asociadas débilmente a la fase
2:43:07estacionaria.
2:43:09Y eventualmente se lleva a cabo la eh la
2:43:12elución.
2:43:14Donde aquí ya se va a desorber
2:43:18eh la proteína de su ligando
2:43:20y se puede eh pues recuperar con una eh
2:43:23con una alta pureza.
2:43:25Esta elución se lleva usualmente a cabo
2:43:27modificando las condiciones del sistema,
2:43:30típicamente mediante un cambio de pH o
2:43:32un cambio en en la fuerza iónica.
2:43:36Para debilitar estas interacciones entre
2:43:38el producto y el ligando.
2:43:40Eh, al final de esta cromatografía la
2:43:43columna se regenera y se limpia al
2:43:45eliminar para eliminar contaminantes
2:43:46residuales y pues se prepara para un eh
2:43:49para un nuevo ciclo, tal cual como lo
2:43:50hicimos en el laboratorio.
2:43:52Mmm, aquí pues algunos parámetros
2:43:54críticos para la
2:43:56cromatografía eh de afinidad, pues es
2:43:59esta mmm
2:44:02pues que al final eh la fase
2:44:03estacionaria pues está contenida en una
2:44:05columna que tiene eh un espacio
2:44:07definido. Si bien es un material poroso
2:44:09que tiene una alta área eh superficial.
2:44:14Espero no ser redundante, o sea, es
2:44:15tiene una alta superficie.
2:44:17Ah, pues al final esto está limitado,
2:44:19¿no? Y mmm
2:44:23todas las columnas tienen una capacidad
2:44:25de carga, una capacidad de unión.
2:44:28Sí, entonces ah pues dependiendo de eh
2:44:31los volúmenes que tengamos que trabajar
2:44:33y más como la cromatografía de
2:44:34afinidades por ciclos,
2:44:36eh pues tal vez sea necesario utilizar
2:44:39eh varios ciclos para
2:44:41eh para recuperar el mismo producto o la
2:44:44necesidad de tener eh pues varias
2:44:46columnas en
2:44:48conectadas en paralelo, ¿no?
2:44:51Eh
2:44:53también pues el tiempo eh de residencia
2:44:56va a influir en la unión, es decir, los
2:44:58flujos, eh si el flujo es muy rápido, eh
2:45:01pues el producto puede no tener el
2:45:03tiempo suficiente para interaccionar eh
2:45:06con el ligando y por lo tanto pues se
2:45:07vaya a se pues haya pérdidas.
2:45:11Eh pues también eh si es muy lento con
2:45:13el o sea si es muy el flujo es más
2:45:14lento, pues sí se mejora la resolución,
2:45:17pero pues
2:45:18en tiempos pues que no sean eh pues a
2:45:21nivel de costos que sean apropiados,
2:45:22¿no?
2:45:23Mmm también el pH y la conductividad en
2:45:25la fase estacionaria pueden eh afectar
2:45:28tanto la unión como la elución, entonces
2:45:30se tienen que definir pues previamente
2:45:32cuáles con son las condiciones eh
2:45:34óptimas de operación.
2:45:36Mmm otra de una desventaja de esta
2:45:38técnica, o sea si bien es altamente
2:45:40específico
2:45:42y nos puede ahorrar un montón de pasos
2:45:44eh
2:45:45pues es el costo elevado de las de las
2:45:47resinas.
2:45:49Eh suele ser eh elevado.
2:45:52Mmm además decíamos que las columnas
2:45:54cromatográficas pues también tienen un
2:45:56tiempo un tiempo de vida útil.
2:45:59Ahm entonces pues esto puede hacer
2:46:01necesario pues más eh gastos gastos de
2:46:04operación.
2:46:05Ahm
2:46:07además que pues se tienen que
2:46:09que estar eh monitoreando de forma
2:46:11continua para evitar eh pues la lo que
2:46:13llaman la lixiviación del ligando o de
2:46:16la propia de la propia matriz eh de la
2:46:18columna, ¿no?
2:46:20Ahm
2:46:23pero en general yo creo que sí vale la
2:46:25pena
2:46:26ahm
2:46:27invertir en una cromatografía de
2:46:29afinidad siempre y cuando pues el el
2:46:31analito o el producto que queramos
2:46:32purificar pues sea lo sea lo lo permita,
2:46:35¿no? Porque sí reduce muchísimo
2:46:36muchísimo los pasos.
2:46:38Mmm otro ejemplo de cromatografía de
2:46:40afinidad es la eh cromatografía de
2:46:42afinidad a lectinas.
2:46:45Eh esta por ejemplo eh, explota
2:46:49la capacidad que tienen eh las las
2:46:51lectinas, que son eh proteínas que
2:46:53suelen encontrarse en en plantas,
2:46:56que tienen una alta afinidad por
2:46:59carbohidratos.
2:47:01Entonces, nos puede ayudar a purificar a
2:47:04purificar proteínas glicosiladas.
2:47:08Especialmente eh proteínas que tienen
2:47:10residuos de manosa, eh glucosa,
2:47:13galactosa o N-acetilglucosamina.
2:47:16Va a depender de la lectina hm que se
2:47:18utilice.
2:47:19Ah, aquí la eh
2:47:23cromatografía de afinidad a una lectina
2:47:25específica, por ejemplo, la
2:47:26concanavalina,
2:47:29permite ah purificar eh estructuras
2:47:32ricas eh en manosa.
2:47:35Hm, también, como ya mencioné, tenemos
2:47:38eh la croma- la cromatografía de
2:47:40afinidad a proteína A.
2:47:42Esta se utiliza, digamos, para recuperar
2:47:44eh anticuerpos eh anticuerpos
2:47:47monoclonales.
2:47:49Y bueno, también tenemos eh por ejemplo,
2:47:51IMAC, ¿no? Para eh utilizando metales
2:47:54divalentes.
2:47:55Luego tenemos la cromatografía de
2:47:56intercambio iónico, que esta separa las
2:47:59proteínas basado en interacciones eh
2:48:03electrostáticas a partir eh
2:48:06pues de utilizar eh fases estacionarias
2:48:08o matrices cromatográficas que tengan en
2:48:10una carga.
2:48:11Se separan las proteínas de acuerdo a su
2:48:13carga.
2:48:14Esta técnica se puede utilizar tanto en
2:48:16etapas de captura
2:48:18como en etapas posteriores, tanto de
2:48:20purificación intermedia eh como de
2:48:22pulido.
2:48:24Eh, creo que aquí no lo menciono, eh,
2:48:26pero
2:48:28pues obviamente se pueden utilizar
2:48:29explotar tanto una interacción de cargas
2:48:32entre cargas positivas o cargas
2:48:34negativas. Entonces, podemos tener eh
2:48:37cromatografía de intercambio aniónico o
2:48:39de intercambio catiónico.
2:48:41Ah, es también común, por ejemplo, eh
2:48:44pues en ciertas etapas
2:48:46de purificación, en una etapa primero
2:48:49ver eh una cromatografía de intercambio
2:48:51catiónico y posteriormente a aniónico,
2:48:54¿no? Aquí pues dependiendo, de nuevo, va
2:48:56a depender pues de qué es lo que
2:48:57queramos eh capturar, eh recuperar o
2:49:00remover.
2:49:02Ah.
2:49:05Aquí, pues, recordemos que las proteínas
2:49:08eh pues tienen grupos eh ionizables que
2:49:10van a determinar eh su carga neta en
2:49:13función del pH.
2:49:14Cuando una proteína se encuentra en un
2:49:16pH por debajo de su punto isoeléctrico,
2:49:18va a generar, va a presentar una carga
2:49:20neta positiva y puede interaccionar con
2:49:23resinas de intercambio catiónico que van
2:49:25a tener una carga negativa.
2:49:29O al contrario, a un pH por encima de su
2:49:31punto isoeléctrico, va a eh puede
2:49:34interactuar con resinas de intercambio
2:49:37aniónico. Entonces, también aquí un
2:49:39punto importante o lo que le puede dar
2:49:40esa selectividad
2:49:43eh de separación para eh pues nuestro
2:49:45producto de interés, especialmente
2:49:47cuando hablamos de una proteína, hm pues
2:49:49es saber, justamente, eh el punto
2:49:51isoeléctrico, ¿no? Eh que es el el cual
2:49:54suele ser
2:49:55muy particular eh para las proteínas.
2:49:58O sea, para una proteína dada, ¿no? Y si
2:50:00esto hm lo mezclamos posteriormente con
2:50:03una eh un paso cromatográfico, por
2:50:06ejemplo, de
2:50:08eh de exclusión molecular, donde se
2:50:10paran de acuerdo al tamaño, pues podemos
2:50:11recuperarlas con una bastante
2:50:13selectividad. Es decir,
2:50:15eh son pocas la, o sea, es raro, más
2:50:20bien, son pocas las proteínas que pueden
2:50:22coincidir en un sistema que tengan tanto
2:50:24el mismo punto isoeléctrico como el
2:50:26mismo el mismo peso molecular.
2:50:29Eh entonces, pues, la la cromatografía
2:50:31de intercambio iónico pues nos ayuda a a
2:50:33ir disminuyendo la la de
2:50:36eh pues de otros contaminantes con con
2:50:38cargas diferentes, ¿no?
2:50:40Entonces, eh las matrices que son suelen
2:50:43utilizarse es suelen estar basadas en
2:50:45agarosa o en otros polímeros
2:50:48eh y el grup y que van a estar em
2:50:51acopladas a grupos funcionales
2:50:54como sulfonatos o aminas cuaternarias,
2:50:57así también carboxilatos o aminas
2:51:00secundarias.
2:51:01Hm aquí también en la cromatografía de
2:51:04intercambio iónico, pues existen
2:51:05diferentes hm abordajes o estrategias am
2:51:08de purificación. Puede hacerse eh por
2:51:11ejemplo a través de
2:51:13eh de gradientes entre eh
2:51:17entre esta estas fuerzas estas fuerzas
2:51:19iónicas o en etapas, que es como viene
2:51:22señalado aquí en la eh en la figura.
2:51:26Eh
2:51:27Un modo de operación también em
2:51:30común es el de método de unión y
2:51:34elución. Donde eh el producto se une a
2:51:37la resina y posteriormente se eluye
2:51:39mediante un cambio en las condiciones
2:51:40del sistema, o sea, típicamente
2:51:42aumentando la fuerza iónica o aumentando
2:51:45el fea el pH.
2:51:47Hm otro modo
2:51:50es el modo de flujo a través.
2:51:53Donde el producto no se une en al eh no
2:51:55se une en la resina, mientras que las
2:51:57impurezas sí lo hacen.
2:52:00Am
2:52:02Este enfoque, por ejemplo, o sea, aquí
2:52:04lo que donde bus o sea, una o sea, de
2:52:06nuevo, vamos a esta pa a esta parte de
2:52:07que hay que definir qué es lo que
2:52:08queremos que se una a la columna
2:52:10cromatográfica, si el producto de
2:52:11interés o ciertos contaminantes.
2:52:14Eh en este último enfoque que les digo
2:52:16donde lo que se unen son los
2:52:17contaminantes, este este esta técnica es
2:52:21común en etapas de pulido donde se donde
2:52:23pues no se retiene eh no se retiene el
2:52:25producto.
2:52:27Entonces, decíamos que eh por ejemplo,
2:52:29en este caso
2:52:31em donde
2:52:33aquí lo que hacemos es retener eh al
2:52:36producto de interés.
2:52:38Mmm, las estrategias de elución, lo que
2:52:40se muestra aquí,
2:52:41eh es si se fijan, donde se va
2:52:44aumentando la conductividad.
2:52:48Que pues la conductividad pues va
2:52:49cambiando dependiendo de la
2:52:50concentración de sales, por ejemplo, si
2:52:51desde aquí un lavado con alta
2:52:53concentración de sales, pues donde se
2:52:54puede eh
2:52:56eh eluir.
2:52:58Em.
2:53:00El producto de interés, ¿no?
2:53:02Ah, entonces un aumento en la
2:53:04concentración de sales introduce eh
2:53:06iones que que van a competir por la
2:53:08proteína, por los sitios de unión de la
2:53:09resina, debilitando la eh la interacción
2:53:12electrostática y el producto eh se
2:53:14libera.
2:53:15Cuando em se hace a través del cambio de
2:53:18pH, pues lo que se altera no es tanto es
2:53:20la matriz o la interacción entre la
2:53:22matriz, sino que lo que pasa es que
2:53:24cambia la carga de la proteína, entonces
2:53:26por ende va a reducir su afinidad a la
2:53:28resina.
2:53:30Mmm, entonces un punto importante, un
2:53:31parámetro crítico que hay que controlar,
2:53:34obviamente en la cromatografía de
2:53:35intercambio iónico, pues va a ser el pH
2:53:39eh y la conductividad del medio, que
2:53:41obviamente pues está relacionado eh con
2:53:43la concentración de sales.
2:53:45Ah, otro parámetro importante y en
2:53:48general para todas las los métodos
2:53:50cromatográficos, pues es el tiempo de
2:53:52residencia, es decir, pues el flujo
2:53:54eh y también pues la carga la carga de
2:53:57la columna.
2:53:59Entonces,
2:54:00ah,
2:54:01la cromatografía de intercambio iónico
2:54:03pues se puede, por ejemplo, utilizar eh
2:54:06como una alternativa a la cromatografía
2:54:08de afinidad cuando no existe un ligando
2:54:09específico o cuando se busca también en
2:54:12pues reducir costos, ¿no?
2:54:14En la purificación intermedia, es decir,
2:54:15en etapas posteriores, se puede utilizar
2:54:17para separar separar variantes del
2:54:19producto, o sea, relacionadas con el
2:54:21producto que tienen propiedades
2:54:22fisicoquímicas similares o para remover
2:54:25eh impurezas mmm específicas, por
2:54:27ejemplo,
2:54:29eh,
2:54:30se puede utilizar
2:54:32eh, cromatografía de intercambio
2:54:35aniónico para eliminar, por ejemplo, el
2:54:37lipo, el lipopolisacárido,
2:54:40eh, cuando vienen proteínas de, eh,
2:54:42producidas en el coli.
2:54:48Eh, y bueno, luego tenemos la la etapa
2:54:50de purificación intermedia, que es,
2:54:52pues, obviamente, pues, es este punto
2:54:54intermedio entre la captura y, eh, la
2:54:58separación o la o el pulido,
2:55:01que esta ya es, o no se utilizan
2:55:02técnicas de una mayor resolución.
2:55:05Eh, en esta etapa lo que se busca es
2:55:07reducir de manera sustancial la carga de
2:55:09impurezas, mejorar la pureza del
2:55:11producto y acondicionar la corriente o
2:55:13el efluente para las etapas finales, eh,
2:55:15de tratamiento.
2:55:17Aquí, en esta etapa, se le da una mayor
2:55:21preferencia a la selectividad, es decir,
2:55:23a la resolución,
2:55:25tratando también, eh, de mantener en
2:55:26medida de lo posible la capacidad. Sí,
2:55:29aquí, si fijan, ya la velocidad ya no es
2:55:31un parámetro, eh, tan importante.
2:55:35Ah, aquí, pues, también seguimos
2:55:36explotando las, eh, las propiedades
2:55:40fisicoquímicas, eh,
2:55:44eh, pues, tanto del producto como de
2:55:46los, hm, contaminantes.
2:55:50Eh, aquí también en este enfoque, eh,
2:55:52pues, no hay que perder de vista el
2:55:53principio de ortogonalidad, el cual se
2:55:56refiere a que cada etapa, pues,
2:55:58contribuye a la remoción de impurezas
2:56:01mediante mecanismos diferentes,
2:56:03aumentando, por ende, la eficiencia
2:56:05global del proceso. Sí.
2:56:09Entonces, el objetivo de esta etapa de
2:56:11purificación intermedia no es lograr un
2:56:13producto con una pureza, eh, absoluta,
2:56:16pero sí reducir de manera, eh,
2:56:19considerable la reducción de impurezas
2:56:21sin generar tantas pérdidas de producto,
2:56:24manteniendo una operación robusta y
2:56:26escalable.
2:56:28En esta etapa, eh pues también se
2:56:30utiliza mucho la cromatografía de
2:56:31intercambio iónico,
2:56:33ah pero aquí pues también podríamos
2:56:35hablar de otro tipo de cromatografías
2:56:37como la de interacción hidrofóbica.
2:56:40Esta, por ejemplo, se utiliza mucho para
2:56:42eliminar eh agregados y especies
2:56:44parcialmente desnaturalizadas del
2:56:45producto.
2:56:47Am,
2:56:48en algunos procesos también se utiliza
2:56:50la ultrafiltración y diafiltración para
2:56:53concentrar el producto y ajustar las
2:56:55concentraciones del buffer. De hecho,
2:56:57esto estas esta etapa de ultrafiltración
2:56:59y diafiltración,
2:57:01si se fijan, eh va a ser una etapa eh
2:57:03común entre pasos cromatográficos,
2:57:05porque decíamos que
2:57:07am, una desventaja que tiene la
2:57:09cromatografía, o sea, a pesar de que se
2:57:11puede puede ser una técnica de
2:57:13separación altamente selectiva, pues es
2:57:14que se mezcla con una fase móvil que
2:57:17tiende a
2:57:19a diluir muchísimo el eh el producto.
2:57:21Entonces, con la ultrafiltración y la
2:57:23diafiltración, pues se puede volver a
2:57:25concentrar.
2:57:27Entonces, la cromatografía de
2:57:28interacción hidrofóbica se basa en la
2:57:30interacción y re- la interacción
2:57:32reversible entre las regiones
2:57:34hidrofóbicas de una proteína con grupos
2:57:36hidrofóbicos que van a estar
2:57:37inmovilizados en la fase estacionaria.
2:57:41Esta
2:57:42opera en condiciones eh pues
2:57:44relativamente gentiles y acuosas, o sea,
2:57:47esto comparándolo, por ejemplo, con la
2:57:49cromatografía en fase reversa, que
2:57:51también su fundamento hm se basa en esta
2:57:55en la separación de acuerdo a la
2:57:57polaridad o hidrofobicidad e
2:57:59hidrofilicidad de las moléculas, pero
2:58:01eso como se utiliza en esa otra
2:58:02cromatografía se utilizan solventes em,
2:58:06pues las condiciones son más agresivas.
2:58:07La cromatografía de interacción
2:58:09hidrofóbica es más gentil para en este
2:58:11sentido. Y además decíamos, pues utiliza
2:58:13eh medios acuosos,
2:58:16lo cual permite conservar la estructura
2:58:19nativa o el plegamiento, pues de una
2:58:21proteína terapéutica.
2:58:24Esta cromatografía de interacción
2:58:25hidrofóbica se utiliza mucho en estas
2:58:27etapas intermedias o también en las
2:58:29etapas de pulido, en etapas posteriores.
2:58:32Porque va a ayudar a remover eh
2:58:34agregados, variantes conformacionales y
2:58:36ciertas impurezas que no puedan
2:58:38separarse por carga o por afinidad.
2:58:41Entonces, el fundamento de esta técnica
2:58:43es que en soluciones acuosas las
2:58:45moléculas de agua forman estructuras
2:58:48desordenadas alrededor de superficies
2:58:50hidrofóbicas.
2:58:52Am, lo cual es energéticamente
2:58:54desfavorable.
2:58:56Cuando dos superficies hidrofóbicas se
2:58:57aproximan,
2:58:59se reduce el área expuesta al agua y el
2:59:01sistema disminuye su energía libre.
2:59:05En la cromatografía de interacción
2:59:06hidrofóbica se explota este fenómeno
2:59:09promoviendo la interacción
2:59:11entre las regiones hidrofóbicas de las
2:59:13proteínas
2:59:14con los ligandos hidrofóbicos de las
2:59:16resinas en la fase estacionaria.
2:59:19Eh, estas interacciones se va a ver se
2:59:21van a ver favorecidas por eh medios o
2:59:24fases móviles con una alta concentración
2:59:27de sales.
2:59:29Eh,
2:59:31aquí, bueno, las resinas
2:59:33eh suelen eh estar funcionalizadas con
2:59:37ligandos hidrofóbicos
2:59:39eh
2:59:40como grupos butilo, octilo o fenilo.
2:59:45Am, y la unión del producto va a ocurrir
2:59:49en presencia de altas concentraciones de
2:59:51sales, usualmente utilizando eh sulfato
2:59:54de amonio, que aquí también como dato,
2:59:57como dato extra, el sulfato de amonio se
2:59:59utiliza mucho eh para precipitar eh
3:00:02proteínas con el famoso eh salting out.
3:00:06Am, bajo estas condiciones las
3:00:08interacciones hidrofóbicas se van a
3:00:09intensificar y las proteínas se van a
3:00:11absorber en la resina eh pues que tiene
3:00:13una matriz em hidrofóbica, ¿no?
3:00:17Y eventualmente em
3:00:20la elución del producto pues se utiliza
3:00:23aplicando, o sea, reduciendo, si se
3:00:24fijan, eh aquí en este caso lo que se
3:00:26indica es la concentración em de sulfato
3:00:28de amonio.
3:00:30Em por lo tanto, o sea, aumentando eh
3:00:34pues la concentración, bueno, no la
3:00:35concentración, sino
3:00:37pues la presencia de los puentes de
3:00:38hidrógeno eh en el agua
3:00:41em y por ende la las interacciones
3:00:43hidrofílicas.
3:00:46Eh y debilitando por ende la interacción
3:00:49con la resina.
3:00:51Am
3:00:52esta mmm cromatografía de inter eh de
3:00:58de interacción hidrofóbica, perdón, pues
3:01:01es pudiera ser, o sea, es es altamente
3:01:03eh selectiva,
3:01:05obviamente pues en donde hay proteínas
3:01:07con regiones hidrofóbicas expuestas.
3:01:09Esto eh pues permite separar, por
3:01:12ejemplo, la proteína proteína
3:01:13correctamente plegada de una que está
3:01:15agregada, ¿no? Ya hemos mencionado que
3:01:17esta agregación es justamente por esta
3:01:18interacción o esta exposición em de las
3:01:21regiones hidrofóbicas.
3:01:23Am o también con la eliminar eh
3:01:26variantes conformacionales o isoformas
3:01:29pues que tengan diferente grado de
3:01:30hidrofobicidad. Aquí pues el punto es
3:01:32saber en dónde está eh eluyendo eh pues
3:01:36el producto que nosotros
3:01:38am queramos.
3:01:40Am
3:01:41a mí también una ventaja de la
3:01:43cromatografía de interacción hidrofóbica
3:01:45es que como utiliza eh sulfato de
3:01:47amonio, pues es altamente compatible eh
3:01:51eh o sea, se suele utilizarse em mucho,
3:01:54o sea, si por ejemplo, si en una etapa
3:01:55previa utilizamos eh precipitación con
3:01:58sulfato de amonio, ya podemos
3:01:59llevárnoslos para allá.
3:02:01Este eh pues es es más compatible, ¿no?
3:02:05Am sin embargo, eh
3:02:10cuando
3:02:12se vaya a utilizar eh antes de una
3:02:15cromatografía de intercambio iónico,
3:02:17pues es necesario reducir la
3:02:18concentración de sales, ¿no?
3:02:21Ah, de hecho, pues también es común que
3:02:22después de ver la cromatografía de
3:02:24interacción hidrofóbica, esté presente
3:02:26la ultrafiltración diafil- y la
3:02:28diafiltración.
3:02:31Eh
3:02:33Esta última técnica, ultrafiltración y
3:02:35diafiltración, pues es una operación
3:02:37basada en el uso de membranas que va a
3:02:39permitir separar eh los componentes en
3:02:41función de su tamaño mediante el uso de
3:02:43una barrera semipermeable. Pues al
3:02:45final, pues es una filtración como
3:02:47cualquier otra.
3:02:49Eh Esta técnica, o sea, obviamente
3:02:52utiliza tamaños de poros eh mucho más eh
3:02:55pequeños y selectivos que las
3:02:57filtraciones que vimos en etapas
3:02:59anteriores.
3:03:00Y se utiliza para concentrar proteínas
3:03:03mientras que al mismo tiempo se
3:03:05intercambian eh los buffers.
3:03:08Eh se le puede reducir la concentración
3:03:10de sales y eliminar impurezas de bajo
3:03:12peso eh molecular. Entonces, esta
3:03:15técnica eh suele ser una una transición
3:03:18entre etapas cromatográficas o que
3:03:20también se utiliza mucho para eh obtener
3:03:23la formulación final, es decir, no nada
3:03:24más se utiliza para la purificación
3:03:26intermedia, sino la podemos ver a lo
3:03:28largo de todo el proceso de downstream.
3:03:30Ah, entonces, pues aquí se utilizan
3:03:33membranas con un corte de peso molecular
3:03:36específico, el cual va a definir el
3:03:37rango de tamaño que puede eh
3:03:39atravesarla.
3:03:41Entonces, las proteínas eh terapéuticas,
3:03:43o sea, pues se le tendría que buscar un
3:03:44tamaño de poro
3:03:46eh menor al de la proteína terapéutica
3:03:48para que estas sean retenidas, mientras
3:03:50que sales, metabolitos y pequeñas
3:03:52impurezas puedan hm puedan separarse.
3:03:55Entonces, aquí, pues ese eh las
3:03:57proteínas se separan de acuerdo a su
3:03:59tamaño.
3:04:00Aunque también pueden influir algunas eh
3:04:03pues interacciones y fenómenos de
3:04:04absorción eh de las membranas que se
3:04:07pudieran eh utilizar.
3:04:09Entonces, en biofarmacéuticos la
3:04:11ultrafiltración y la diafiltración se
3:04:13realiza pues prácticamente en modo de
3:04:15filtración por flujo tangencial.
3:04:18Eh donde en la etapa de ultrafiltración
3:04:21lo que pasa es que se re vol se reduce
3:04:23el volumen del sistema
3:04:25incrementando la concentración del
3:04:27producto hm retenido.
3:04:30Eh este proceso, por les decía, es
3:04:33importante después de etapas
3:04:34cromatográficas porque el producto se
3:04:36diluye se diluye bastante.
3:04:39Eh y la el la etapa de diafiltración es
3:04:42una extensión de la ultrafiltración que
3:04:44permite el reemplazo del buffer del
3:04:46sistema. O sea, si nosotros nos quedamos
3:04:47hasta acá donde nada más eh o reducimos
3:04:51el volumen, pues nada más estaríamos
3:04:52concentrando. Pero si después, digamos,
3:04:54en lugar en un en una solución
3:04:57que tiene una alta concentración de
3:04:59sales, la vamos diluyendo,
3:05:01pues vamos haciendo este este recambio
3:05:03eh
3:05:04de soluciones.
3:05:07Mientras eh
3:05:08pues el producto se mantiene en la
3:05:10concentración deseada, ¿no?
3:05:13Ah
3:05:15Aquí eh
3:05:18una limitante eh es que eh en este
3:05:22proceso ocurre una lo que le llaman la
3:05:25polarización de concentración,
3:05:27donde los solutos que son retenidos se
3:05:29acumulan cerca de la superficie de la
3:05:31membrana, formando una capa que puede eh
3:05:34reducir eh el flujo.
3:05:38Otro fenómeno es el ensuciamiento
3:05:41de la membrana,
3:05:43eh que puede ser reversible o
3:05:45irreversible, pues eso es que se vaya eh
3:05:47que se vaya tapando el filtro por la
3:05:48deposición de proteínas o agregados que
3:05:51están interaccionando con la membrana.
3:05:54Hm Algunos puntos críticos para esta
3:05:56etapa es, por ejemplo, la presión de la
3:05:59que se utiliza en en la membrana.
3:06:02O sea, al aumentar la presión, pues
3:06:04aumenta el flujo de lo que puede pasar,
3:06:06pero solo hasta eh hasta cierto punto,
3:06:08¿no?
3:06:09Obviamente también la concentración de
3:06:11la proteína, porque esto puede influir
3:06:12en la viscosidad y en la potencial
3:06:14agregación y que se tapón y que se tape
3:06:16la
3:06:17eh la resina.
3:06:20Eh
3:06:21pero pues sí, esta técnica eh se utiliza
3:06:23mucho, tiene muchísimas muchísimas
3:06:24ventajas.
3:06:25Además que pues se puede utilizar en
3:06:27formatos pequeños hasta como pues escala
3:06:29escala industrial.
3:06:31Y no suele ser eh
3:06:33un método eh agresivo con el producto, o
3:06:37sea, es bastante es bastante gentil,
3:06:39sirve para hacer el recambio de
3:06:40soluciones, ayuda también bastante eh
3:06:43pues en la formulación.
3:06:47Seguimos con la etapa de pulido, que
3:06:48esta es la fase final eh de la
3:06:50purificación,
3:06:52que tiene esta etapa como objetivo
3:06:54principal remover todas las impurezas
3:06:57residuales que quedaron a nivel traza, o
3:06:59sea, en concentraciones muy bajas o casi
3:07:01indetectables,
3:07:02asegurando que el producto cumpla con
3:07:04los estándares de calidad requeridos
3:07:06para su uso clínico.
3:07:08Eh en esta etapa se va a priorizar
3:07:12eh la pureza, es decir, em la resolución
3:07:17o la recuperación,
3:07:19eh la cantidad y pues el control de los
3:07:21atributos críticos de calidad,
3:07:24aunque esto implique eh mayores costos
3:07:26operativos.
3:07:28Decíamos que en esta en esta etapa
3:07:31se van a utilizar
3:07:33eh técnicas de alta resolución que
3:07:35permitan separar especies
3:07:40muy sutiles en las propiedades
3:07:42fisicoquímicas con respecto eh al
3:07:44producto, o sea, aquí es donde ya se van
3:07:45a eliminar la mayoría,
3:07:47o sea, prácticamente todas las impurezas
3:07:50relacionadas con el producto.
3:07:52Eh, aquí, por ejemplo, suele utilizarse
3:07:56la eh
3:07:58cromatografía de intercambio iónico,
3:08:01donde eh lo que se va a retener es el eh
3:08:05es el producto, mientras los
3:08:06contaminantes em se se remueven, ¿no?
3:08:10Especialmente contaminantes eh cargados.
3:08:13También eh en esta etapa se utiliza se
3:08:16puede utilizar la cromatografía de
3:08:17interacción hidrofóbica, eh la
3:08:20cromatografía de exclusión molecular y
3:08:23en algunos casos, pues sí, la
3:08:25cromatografía eh en fase reversa.
3:08:30Em la cromatografía de exclusión
3:08:32molecular
3:08:34también es conocida como filtración en
3:08:36gel.
3:08:36Esta es una técnica eh cromatográfica de
3:08:39separación que se eh va vaya, separa, en
3:08:42este caso, las proteínas eh basado en
3:08:45diferencias en su tamaño hidrodinámico.
3:08:49Ah, aquí eh el mecanismo de separación,
3:08:53pues, se basa exclusivamente
3:08:56eh pues de un proceso eh físico de
3:08:58exclusión y accesibilidad a los poros de
3:09:00la resina.
3:09:02Ah, la cromatografía de exclusión
3:09:04molecular em se basa en el principio hm
3:09:08de que las moléculas más grandes no
3:09:10pueden penetrar los poros de la matriz
3:09:13cromatográfica, que aquí em
3:09:16en este tipo de cromatografías se
3:09:17utilizan, sí, resinas em resinas de
3:09:20agarosa, principalmente, de un tamaño de
3:09:23poro definido. De hecho, hay de
3:09:24diferentes rangos, dependiendo del eh
3:09:26pues el tamaño de proteínas que se
3:09:28quiera que se quiera separar.
3:09:31Entonces, ¿qué es lo que pasa? Que las
3:09:33moléculas más grandes no pueden penetrar
3:09:37por los poros de la matriz.
3:09:40Eh por ende, salen eh salen más rápido.
3:09:44Y las las más pequeñas sí pueden
3:09:46hacerlo, entonces, como van a recorrer
3:09:49todos los todos los poros y toda la sí,
3:09:52o sea, todo el todo el recoveco todo el
3:09:54el caminito de la de la resina, pues van
3:09:56a tardar más en salir más en salir.
3:09:59Las moléculas más grandes recorren un
3:10:00camino más corto a través de la columna
3:10:04eh y por lo tanto eluyen primero y las
3:10:05moléculas pequeñas penetran en los poros
3:10:08y experimentan un mayor tiempo de
3:10:09residencia, por lo tanto salen después.
3:10:14Eh aquí también hay que tomar en cuenta
3:10:17que la separación depende del volumen
3:10:20hidrodinámico y no necesariamente va a
3:10:22coincidir siempre
3:10:25con el peso molecular
3:10:27dado que pues también va a estar
3:10:28influenciado por la forma y la
3:10:30conformación de la
3:10:32de la proteína.
3:10:35Ah
3:10:36la selección de la resina o del tamaño
3:10:38del poro de la resina debe alinearse por
3:10:41ende con el tamaño del producto y
3:10:42también de las impurezas que se desean
3:10:44hm separar.
3:10:46Ah
3:10:47entre los modos de operación que tenemos
3:10:50de la cromatografía de exclusión
3:10:51molecular
3:10:53eh se generalmente pues hm se opera en
3:10:56condiciones isocráticas, es decir, que
3:10:58la fase eh estaciona- perdón, la fase
3:11:01móvil eh se mantiene constante
3:11:04eh a diferencia de la de las otras
3:11:06cromatografías que hemos visto que se
3:11:07juega con el pH o la concentración de
3:11:09sales
3:11:10eh aquí pues es que como tal
3:11:14la el producto no está absorbiéndose eh
3:11:18a la resina, sino que simplemente pues
3:11:20tarda más en salir.
3:11:23Ah
3:11:24o sea, las la proteína se va separando
3:11:26de lo demás
3:11:27eh conforme va fluyendo a través de a
3:11:29través de la matriz, entonces, pues
3:11:32no es necesario utilizar eh muchos
3:11:34buffers, ¿no?
3:11:35Hm
3:11:37esto, por ejemplo, esta técnica nos
3:11:39permite
3:11:41separar
3:11:43eh por ejemplo, decíamos en
3:11:47fragmentos de la proteína, o sea,
3:11:49proteína degradada o proteína proteína
3:11:52agregada de proteína que no lo está. Por
3:11:54esto se deja y ya para las etapas eh
3:11:57finales eh de la separación, pues en la
3:11:59etapa en la etapa de su de pulido.
3:12:02Eh algunos parámetros que van a eh
3:12:05influir en el resultado o pues sí, en
3:12:07los rendimientos son la en cómo opera
3:12:09esta cromatografía, pues es el volumen
3:12:11de carga. Eh aquí pues también, pues
3:12:14como todas las columnas cromatográficas,
3:12:16pues tienen una eh carga eh finita.
3:12:20Eh cargas excesivas eh del analito, pues
3:12:24pueden reducir la resolución y provocar
3:12:26el solapamiento de los picos.
3:12:28Aquí también el flujo eh es bastante es
3:12:31bastante importante. A flujos muy
3:12:32rápidos, pues se disminuye la
3:12:34resolución.
3:12:35Eh la longitud y el tamaño de la
3:12:37columna, así como el tamaño de la
3:12:39partícula, pues también van a influir.
3:12:41Mientras más grande sea la columna, o
3:12:43sea, más largo sea el caminito que tenga
3:12:46que recorrer eh la proteína, pues va a
3:12:48ser más eficiente o va a tener mejor
3:12:50resolución la separación.
3:12:53Ah también hay que considerar que el
3:12:54buffer debe de ser compatible con la
3:12:56estabilidad del producto
3:12:59para que se minimicen las interacciones
3:13:01no deseadas de la matriz y también pues
3:13:03para mantener eh la solubilidad del eh
3:13:06la solubilidad del producto.
3:13:08Mmm una limitación que tiene la
3:13:11cromatografía de exclusión molecular es
3:13:13que la capacidad de carga es más baja en
3:13:15comparación con otras técnicas mmm
3:13:18cromatográficas. También por eso se
3:13:20guarda ya hasta el final cuando ya eh
3:13:21pues los volúmenes en las que tenemos
3:13:23concentrada la proteína mmm son menores.
3:13:26Mmm
3:13:28Luego eh les decía, en esta etapa se
3:13:31pueden utilizar otras técnicas
3:13:32cromatográficas de las que ya hemos ah
3:13:35mencionado antes, ¿no?
3:13:36Pero también vale la pena hablar de la
3:13:38cromatografía eh en fase reversa. Tal
3:13:41vez, bueno, no, si esta sí se utiliza a
3:13:43nivel industrial, pero se utiliza menos
3:13:45que las otras que hemos mencionado.
3:13:47Eh esta, decíamos, de manera similar a
3:13:49la cromatografía de interacción
3:13:50hidrofóbica, pues la separación también
3:13:52se basa en estas interacciones
3:13:54hidrofóbicas
3:13:56entre las moléculas con la fase
3:13:57estacionaria, pero eh pues
3:13:59principalmente por la em
3:14:02por la polaridad, o sea,
3:14:05eh a diferencia
3:14:07de la cromatografía de interacción
3:14:08hidrofóbica, la fase reversa opera,
3:14:11decíamos, bajo condiciones más
3:14:12agresivas, utilizando solventes
3:14:14orgánicos.
3:14:16Em
3:14:18lo cual em la hace eh una herramienta,
3:14:22pues, de alta resolución, pero eh para
3:14:24aplicaciones preparativas o en etapas
3:14:27previas, pues tiene eh
3:14:29pues tiene muchas limitantes, ¿no?
3:14:31Eh aquí eh las proteínas
3:14:35interactúan con la superficie
3:14:37hidrofóbica de la columna
3:14:39y van a ser retenidos en función a su
3:14:41hidrofobicidad.
3:14:44Eh aquí en esta en esta
3:14:47en este tipo de cromatografía suelen
3:14:49utilizarse hm solventes como el
3:14:51acetonitrilo o el etanol. De hecho, el
3:14:54que viene indicado aquí en la figura es
3:14:55el eh el acetonitrilo.
3:14:58Estos solventes, pues, van a alterar la
3:15:00polaridad del medio y van a debilitar
3:15:03las interacciones hidrofóbicas,
3:15:05permitiendo la elución, pues, de las
3:15:07moléculas de acuerdo a su polaridad.
3:15:08También aquí se fijan, eh pues, es se
3:15:10generan como eh gradientes de polaridad
3:15:13entre este eh intercambio en la fase
3:15:16estacionaria.
3:15:18Ah, sin embargo, pues, la desventaja que
3:15:20tiene es que estas condiciones, pues,
3:15:21suelen provocar la desnaturalización de
3:15:23las proteínas.
3:15:24Entonces, pues, hay que hay que eh hay
3:15:26que checar esto, que esta
3:15:28desnaturalización sea eh sea sea
3:15:31Hm, aquí las resinas que suelen
3:15:34utilizarse en este tipo de cromatografía
3:15:36van a estar eh conformadas, por ejemplo,
3:15:39de sílica
3:15:41funcionalizadas con cadenas hidrofóbicas
3:15:43de diferentes carbonos, ¿no? O sea, de
3:15:45carbono 18, carbono 8 o carbono 4.
3:15:49Obviamente, mientras más larga sea la
3:15:51cadena de carbonos, pues más hidrofóbica
3:15:53va a ser y más fuerte va a ser la
3:15:55interacción.
3:15:56O sea, más hidrofóbica, ¿sí?
3:15:58Mmm.
3:16:00Esta es capaz de separar
3:16:02eh isoformas de proteínas, variantes de
3:16:05secuencia, productos de degradación o
3:16:08péptidos con diferencias mínimas eh en
3:16:10composición.
3:16:13Ehm.
3:16:15Esta eh se puede se suele utilizar mucho
3:16:18en la purificación, por ejemplo, de
3:16:19péptidos sintéticos o de proteínas
3:16:21pequeñas, donde la desnaturalización no
3:16:24compromete tanto eh la funcionalidad
3:16:26final, o sea, en en proteínas que no
3:16:27adquieren una eh conformación muy
3:16:29compleja.
3:16:31Mmm.
3:16:35Entonces, ehm pues sí, o sea,
3:16:39ahorita vamos a ver algunos ejemplos
3:16:42donde pues se pueden utilizar eh
3:16:43diferentes eh diferentes
3:16:45configuraciones, pero ya en estas etapas
3:16:47pues esperaríamos tener eh ya el
3:16:49producto con una eh con una alta pureza
3:16:52y podríamos pasar a pues etapas eh
3:16:55posteriores pues de preparación ya para
3:16:57la formulación.
3:17:02Ehm, aquí en esta en esta primera parte
3:17:04de la diapositiva, en esta figura eh
3:17:06pues se resumen eh o se presentan
3:17:08algunas eh técnicas cromatográficas que
3:17:11pueden utilizarse en estas etapas eh de
3:17:13procesamiento downstream eh posterior a
3:17:15la recuperación y calificación del
3:17:17producto, donde decíamos que teníamos
3:17:19este eh esta estrategia de CIPP,
3:17:23de captura, purificación intermedia y
3:17:26pulido.
3:17:27Ahm,
3:17:28o les digo de nuevo, esto no es no es un
3:17:32no es que sea forzosamente que se haga
3:17:33así, pero pues son algunas
3:17:34configuraciones que se pueden presentar.
3:17:37Por ejemplo, habrá casos en los que pues
3:17:39nada más con utilizar eh cromatografía
3:17:42de afinidad ya se puede obtener un
3:17:43producto eh con una pureza eh suficiente
3:17:46para cumplir con los requerimientos
3:17:47regulatorios. Así nos puede eh ahorrar
3:17:50una gran cantidad de pasos.
3:17:52Mmm, por lo cual pues siempre eh va a
3:17:54ser recomendable utilizar explotar la
3:17:56cromatografía de afinidad
3:17:58eh en cuanto pues el presupuesto o la
3:18:00disposición disponibilidad de estos
3:18:02ligandos pues esté accesible, ¿no?
3:18:05Ah,
3:18:06podemos acoplar por ejemplo, la
3:18:08cromatografía de afinidad con eh la
3:18:12cromatografía aquí es de gel filtration,
3:18:14o sea, de filtración en gel o exclusión
3:18:16molecular, donde ya se separan eh por
3:18:18tamaño, ¿no?
3:18:20O incluso pues mezclarla eh
3:18:22cromatografía de afinidad, intercambio
3:18:23iónico y luego exclusión molecular.
3:18:26Mmm, cuando no tenemos
3:18:29la cromatografía de afinidad podemos
3:18:31utilizar eh intercambio iónico o
3:18:33interacción hidrofóbica en las etapas
3:18:35iniciales de captura.
3:18:38Eh la cromatografía de intercambio
3:18:40iónico, si se fijan, puede utilizarse
3:18:42tanto en etapas iniciales como en etapas
3:18:44intermedias.
3:18:45Y si se fijan, la filtración en gel o la
3:18:48de exclusión molecular pues se reserva
3:18:50prácticamente ya para las de alta
3:18:52resolución, ahí donde ya no tenemos eh
3:18:54pues ya cuando ya la mezcla no es tan
3:18:56compleja, ya no tenemos tantos
3:18:57componentes eh que pues sí nos prometan
3:18:59tener una mejor eh separación de acuerdo
3:19:01a su tamaño.
3:19:03Y bueno,
3:19:04eh posteriormente o bueno, o también
3:19:06incluso en etapas
3:19:08entre estas etapas se pueden em
3:19:11o se deberían de implementar
3:19:14técnicas para eh remover
3:19:18o inactivar eh partículas virales.
3:19:21Esto porque mencionábamos
3:19:23que
3:19:26principalmente en sistemas o cultivos eh
3:19:29de mamífero,
3:19:30donde eh pues puede haber problemas de
3:19:33contaminación en los medios de cultivo a
3:19:35lo largo de todo el proceso,
3:19:37am
3:19:39que pues luego a veces es am
3:19:41con agentes virales,
3:19:44los que pueden generar un riesgo eh de
3:19:45contaminación y de pues pues un riesgo
3:19:47de infección si se encuentran en la en
3:19:49la formulación final. Entonces, también
3:19:51un parte de los eh requerimientos
3:19:53regulatorios es que se implementen
3:19:55eh pues técnicas que garanticen la
3:19:58inactivación o remoción
3:20:00eh de estas eh de estas partículas eh
3:20:04virales.
3:20:06Entonces, la inactivación viral implica
3:20:09la destrucción de la capacidad infectiva
3:20:11del virus sin necesariamente eliminar eh
3:20:13sus componentes físicos.
3:20:15Am Aquí pues un método muy utilizado
3:20:18para la inactivación viral es utilizar
3:20:22eh cambios en el pH, pH muy ácido.
3:20:25Esta técnica es relativamente común en
3:20:27la producción de anticuerpos eh
3:20:29monoclonales,
3:20:31donde el producto se expone a
3:20:33condiciones ácidas durante un tiempo
3:20:34controlado para desestabilizar la
3:20:36envoltura la envoltura vira viral.
3:20:40Am Además, este método suele
3:20:41implementarse después de la captura eh
3:20:44por afinidad.
3:20:45Sí, o sea, sería después de estas eh
3:20:47etapas.
3:20:48También pueden hacerse uso de solventes
3:20:50y detergentes para disolver, por
3:20:52ejemplo, la membrana lipídica en virus
3:20:54envueltos.
3:20:57Eh o tratamientos térmicos.
3:20:59Y esto obviamente pues la selección de
3:21:01un método u otro pues va a depender de
3:21:03la estabilidad de
3:21:04de pues del producto, ¿no? Que tanto
3:21:06aguanta estas condiciones.
3:21:08Eh casi siempre lo que se utiliza más am
3:21:12son las estrategias de remoción, que
3:21:14esto se basa en la separación física de
3:21:16las partículas virales eh del producto,
3:21:18para lo cual pues se utiliza mucho la
3:21:21filtración.
3:21:22En estas se utilizan también membranas
3:21:24con tamaños de poro definidos que van a
3:21:26retener a los virus mientras permite el
3:21:28paso de las proteínas.
3:21:31Este es un proceso altamente efectivo y
3:21:33se considera una etapa crítica en en
3:21:35muchos procesos.
3:21:38También otro punto relevante que hay que
3:21:41considerar es que
3:21:43pues puede ser que nosotros estemos
3:21:44implementando técnicas de bioseparación
3:21:48ah
3:21:50para ir purificando el producto que
3:21:52también nos vayan ayudando a eliminar
3:21:54este tipo de contaminantes.
3:21:56Por ejemplo, pues la misma
3:21:58ultrafiltración por ese tamaño de poro
3:21:59tan pequeño pues puede ayudar a remover
3:22:01partículas virales.
3:22:03Así como también pues separar productos
3:22:06eh
3:22:07de bajo peso molecular dependiendo del
3:22:09tamaño, o sea, jugar jugar con los
3:22:11tamaños del poro, ¿no? Para saber si
3:22:12recuperamos el concentrado o el
3:22:15filtrado, ¿no?
3:22:17O por ejemplo, la cromatografía de
3:22:19intercambio iónico también puede
3:22:21contribuir a la remoción de partículas
3:22:23virales.
3:22:25Ah
3:22:26cuando se utiliza la remoción viral por
3:22:29filtración, esto casi siempre se hace se
3:22:32utiliza donde el producto ya ha sido
3:22:33purificado por completo
3:22:36y donde las condiciones del sistema son
3:22:38compatibles con la
3:22:40pues con la operación.
3:22:44Bueno, vamos a pasar brevemente a
3:22:47mencionar unos ejemplos.
3:22:49Aquí en esta diapositiva lo que se
3:22:50muestra es como un diagrama de flujo de
3:22:53trabajo pues muy genérico.
3:22:55Ah dependiendo
3:22:57pues de si la o sea, pues de dónde viene
3:22:59el producto, ¿no? Dónde se está
3:23:00acumulando, si se expresa
3:23:02intracelularmente o si la proteína es
3:23:05secretada al medio de cultivo. Entonces
3:23:07ya hemos mencionado mucho que esta
3:23:09segunda opción, o sea, donde la proteína
3:23:11esté fuera de la célula, eh, pues
3:23:14pues siempre va a ser preferible eh,
3:23:16para el procesamiento downstream, porque
3:23:18pues si se fijan nos quita eh, de muchas
3:23:19etapas de de purificación posteriores.
3:23:23Mmm.
3:23:25Aquí pues simplemente pues consistiría
3:23:27en remover las células del medio de
3:23:29cultivo por centrifugación o filtración,
3:23:32recuperar obviamente el medio de cultivo
3:23:35eh, y pues ir concentrando eh, el
3:23:38producto ya sea por por ejemplo por por
3:23:40ultrafiltración para separarlas por
3:23:41tamaño o la precipitación también
3:23:44explotando mmm, decíamos la
3:23:47ya sea la precipitación de contaminantes
3:23:50eh, o por por por floculación o por una
3:23:52precipitación selectiva de nuestro
3:23:54producto, ¿no?
3:23:56Casi siempre pues esto va a ir seguido
3:23:57de dos o cuatro pasos eh,
3:24:00cromatográficos, decíamos pues de de
3:24:02captura, purificación intermedia o de
3:24:04pulido al grado que ya tengamos nuestro
3:24:06producto con alta pureza y esto termina
3:24:09con eh, pues la adición de excipientes
3:24:12eh, esterilización por filtración
3:24:15y pues también no olvidemos que parte
3:24:17del proceso pues debe y parte de la
3:24:19formulación y el envasado pues va a
3:24:21incluir si eh, el producto va a estar
3:24:24líquido o va a estar eh, liofilizado,
3:24:27entonces también obviamente si va a
3:24:28estar liofilizado pues hay que agregar
3:24:29este paso eh, en el bioproceso.
3:24:33Por otro lado si el producto se expresa
3:24:35dentro de la célula pues lo que
3:24:37tendríamos que recuperar pues en después
3:24:39de eh, de la en la colecta
3:24:42por centrifugación o filtración pues
3:24:44serían las células donde nos quedaríamos
3:24:46con el material eh, particulado
3:24:49eh,
3:24:50seguido de una eh, disrupción celular,
3:24:53aquí por ejemplo se maneja la
3:24:54homogenización pero pues también puede
3:24:56ser eh,
3:24:58eh, ruptura eh, decíamos por perlas,
3:25:01este métodos químicos, etcétera, ¿no?
3:25:04Después se remueven los restos celulares
3:25:06por centrifugación o filtración.
3:25:08Mmm, aquí también habría que agregar un
3:25:11pas- un pasos adicionales aquí, eh,
3:25:14recordemos pues si esto vamos hablando
3:25:16de un producto de sistemas bacterianos y
3:25:18que la proteína está en cuerpos de
3:25:19inclusión, ¿no? Que aquí adicionaríamos
3:25:21pasos de recuperación de los cuerpos de
3:25:23inclusión, eh, lavados, eh,
3:25:26solubilización de los cuerpos de
3:25:28inclusión y renaturalización o
3:25:30replegamiento.
3:25:32Eh,
3:25:34y luego pues seguiríamos también con
3:25:35esta purificación o concentración,
3:25:38eh, seguido después de los pasos
3:25:40cromatográficos que ya eh, que ya
3:25:42mencionamos.
3:25:46Eh, en esta eh, en esta diapositiva se
3:25:49representa el diagrama de proceso eh, ya
3:25:51específico para purificar un interferón
3:25:54mmm, recombinante.
3:25:57Aquí pues las técnicas que vemos después
3:25:59de que termina el procesamiento
3:26:01upstream, pues tenemos eh,
3:26:03centrifugación y filtración eh,
3:26:06tangencial.
3:26:07Sí, y y vean aquí por ejemplo la
3:26:09ultrafiltración diafiltración, en qué
3:26:11etapas está del proceso. Tenemos aquí
3:26:13una, dos, tres, cuatro veces. Y si a
3:26:17esto le sumamos eh, filtración con otros
3:26:20tamaños de poro eh, específicos, pues
3:26:22tenemos
3:26:24pues seis, eh, una, dos, tres, cuatro,
3:26:28cinco, seis técnicas diferentes de
3:26:30filtración a lo largo del proceso.
3:26:32Obviamente cada etapa eh, pues el que
3:26:34esté eh, en ese punto y no en otro pues
3:26:36tiene eh, pues una razón de ser, ¿no?
3:26:39Por ejemplo, eh, aquí pues es eh, esta
3:26:42estaría en esta etapa pues también pues
3:26:44para remover los componentes y preparar
3:26:47el efluente pues para introducirlo a a
3:26:49un compaso cromatográfico. De hecho, si
3:26:51se fijan, eh, pues casi siempre va a
3:26:53estar mmm, precedido
3:26:57eh,
3:26:58o sea, va a estar antes de una técnica
3:27:00cromatográfica o incluso eh, después,
3:27:02¿no?
3:27:03Eh mientras que aquí la filtración, pues
3:27:05va a involucrar eh aquí estas técnicas
3:27:08de remoción viral o esta final, pues
3:27:10como un paso eh final de
3:27:13de esterilización.
3:27:15Entre las cromatografías que tenemos
3:27:16aquí, por ejemplo, la inter- la
3:27:18cromatografía de intercambio aniónico
3:27:19para remover
3:27:21eh lípidos, proteínas, ADN y material
3:27:23viral.
3:27:24Aquí se utiliza el catiónico para
3:27:26remover
3:27:27eh albúmina y otras proteínas de gran
3:27:30peso molecular.
3:27:31Mmm luego tenemos la cromatografía de
3:27:34interacción eh hidrofóbica para remover
3:27:37mmm contaminantes de pues proteínas
3:27:39similares y luego esta de gel
3:27:42permeation, eh filtración en gel, eh
3:27:44exclusión molecular, separar las por eh
3:27:46por tamaño.
3:27:51Ah aquí tenemos otro eh otro diagrama eh
3:27:54de proceso para la purificación de
3:27:56proteínas, en este caso es un TPA
3:27:59eh producida eh en E. coli, que aquí yo
3:28:02esto, bueno, bueno, con reservas, porque
3:28:03recordemos que el TPA es una proteína
3:28:06muy compleja que casi siempre se produce
3:28:08en sistemas em de mamífero, además de
3:28:10que está glicosilada, ¿no? Pero pues
3:28:12aquí es un reporte de unas técnicas de
3:28:14eh de purificación, probablemente tal
3:28:16vez un fragmento
3:28:17o una versión eh no glicosilada de esta
3:28:19proteína.
3:28:20Em
3:28:22después de la salida del caldo de
3:28:23cultivo en el biorreactor, em aquí, por
3:28:26ejemplo, la eh la proteína se recupera
3:28:29por centrifugación, se lisan las células
3:28:31por eh homogenización seguida de una
3:28:34centrifugación como una técnica de
3:28:35clarificación
3:28:37y aquí se fijan eh hay pasos adicionales
3:28:40que tienen que ver
3:28:41em porque la proteína se va a cuerpos de
3:28:45de inclusión. Entonces, esta
3:28:46centrifugación ayuda justamente a
3:28:48recuperarlos, luego se solubilizan y
3:28:51debe de haber un paso eh de
3:28:52ultrafiltración de la filtración, pues
3:28:54para hacer este em este replegamiento,
3:28:57¿no? Que ya mencionábamos.
3:28:59Em, luego tenemos otra vez
3:29:01ultrafiltración, cromatografía, eh, de
3:29:03intercambio iónico, particularmente, eh,
3:29:07o sea, para separarlas por carga,
3:29:09ultrafiltración, una cromatografía, eh,
3:29:12de afinidad particular, eh, puede ser
3:29:14croma, aquí mencionan que, o sea, el TPA
3:29:16tiene ciertas interacciones con residuos
3:29:18de lisina, entonces utilizan la
3:29:20cromatografía
3:29:21de interacción, eh, a lisinas,
3:29:23ultrafiltración, cromatografía de
3:29:25intercambio iónico.
3:29:27Eh, ah, de hecho, ah, también vale la
3:29:29pena mencionar que hay muchos tipos de
3:29:30cromatografía de afinidad, no nada más
3:29:32las que mencioné, puede haber adición a
3:29:34colorantes, puede haber, eh, por
3:29:36ejemplo, interacción, eh, con
3:29:38hidroxiapatita, eh, etcétera, ¿no?
3:29:41Entonces, pues hay, hay, hay muchas
3:29:42variantes.
3:29:43Pero si se fijan aquí, pues el número de
3:29:45pasos, eh, es mayor
3:29:48porque, eh, a pesar, o sea, además
3:29:50estamos utilizando las células y además
3:29:51la proteína se va a cuerpos de
3:29:53inclusión.
3:29:54Entonces,
3:29:56un mayor número de pasos, puede haber
3:29:58más rango de error, rango de pérdidas,
3:30:01eh, dura más tiempo y esto, pues,
3:30:02también incrementa costos.
3:30:04Eh, como ya también veíamos previamente,
3:30:07el que podamos utilizar, eh,
3:30:08cromatografía de afinidad, pues, nos
3:30:10puede reducir bastante, eh, pues, el
3:30:12número de pasos en el proceso, entonces,
3:30:14eh, pues, son puntos a, eh, a considerar
3:30:16a la hora de, pues, de diseñar, diseñar
3:30:19el proceso, ¿no?
3:30:23Y bueno, como conclusiones, eh, pues, de
3:30:25nuevo, si retomamos, eh, la pregunta con
3:30:27la que abrimos el video, pues, de que si
3:30:28existe, eh, un proceso único, eh, para
3:30:32la purificación de los biofarmacéuticos,
3:30:34pues, no, este va a estar ampliamente
3:30:36definido, pues, por las características
3:30:38fisicoquímicas del producto, también,
3:30:40eh, pues, de la plataforma, eh,
3:30:42biológica que utilicemos, eh, para su
3:30:44producción, porque esto va a definir,
3:30:46pues, en dónde puede estar contenido el
3:30:47producto, el perfil de impurezas que
3:30:49puedan estar presentes y, pues, por
3:30:51ende, todo lo que se tiene, todo lo que
3:30:53se tiene que remover. También pues qué
3:30:55tan estable es el producto
3:30:57en términos pues de pues de las
3:30:59condiciones de operación pues puede
3:31:03hacer que sea más complejo o más
3:31:04sencillo purificarlo, ¿no?
3:31:07Pero pues sí podemos ver que podríamos
3:31:09clasificar eh
3:31:11las técnicas para la producción
3:31:14para el procesamiento
3:31:15upstream pues esas sí son pues
3:31:18si bien el tren de siembra o el
3:31:19escalamiento puede ser en diferentes en
3:31:21diferentes números de pasos pues ahí sí
3:31:23los pasos sí van a
3:31:24estar muy definidos. Lo que lo que va a
3:31:27definir el tren de siembra pues
3:31:28principalmente pues es la cantidad de
3:31:30biomasa que necesitamos y el volumen de
3:31:32producción del biorreactor, ¿no?
3:31:35Para la etapa de procesamiento
3:31:37downstream
3:31:39pues esa también ya tenemos estas
3:31:41técnicas eh
3:31:44o bueno objetivos entre las diferentes
3:31:46etapas donde se pueden utilizar entre
3:31:47cada etapa pues varias
3:31:49varios varios tipos de bioseparaciones,
3:31:51tenemos cromatografías, diferentes tipos
3:31:54de filtración, precipitación,
3:31:56cristalización
3:31:57floculación.
3:31:59Entonces pues tenemos que
3:32:01pues la producción de los
3:32:02biofarmacéuticos
3:32:04pues a nivel de
3:32:06pues de la producción industrial o a
3:32:07nivel de ingeniería pues es un problema
3:32:09complejo, ¿no? Donde cada decisión que
3:32:13se toma va a impactar de manera directa
3:32:15tanto en el rendimiento
3:32:17como en la calidad y la escalabilidad
3:32:21del del proceso
3:32:23y así también en la viabilidad económica
3:32:26del producto. Entonces eh
3:32:29me dice aquí el bioproceso no debe de
3:32:31entenderse
3:32:32como una secuencia
3:32:34rígida de operaciones
3:32:37de operaciones unitarias sino más bien
3:32:39como un sistema integrado
3:32:41donde cada etapa condiciona la siguiente
3:32:43y al final en cuanto la rentabilidad
3:32:48eh, proceso pues se debe de llegar a un,
3:32:50a un equilibrio, ¿no?
3:32:52Debemos de tener una comprensión
3:32:54profunda del producto, cuáles son sus
3:32:56sus propiedades fisicoquímicas y los
3:32:59atributos críticos de calidad que deben
3:33:01cumplirse, por eso también la etapa de
3:33:02investigación y desarrollo es muy
3:33:04importante, porque va a influir
3:33:05fuertemente,
3:33:07eh, pues ya durante, pues todo el
3:33:09tiempo, el ciclo de vida del producto.
3:33:11Eh, también, pues, es importante
3:33:13resaltar
3:33:14la relevancia de la, eh, de la
3:33:17cromatografía de afinidad en estos
3:33:19procesos. Esta representa, eh, un flujo
3:33:22de inflexión, punto de inflexión,
3:33:24perdón, en el desarrollo del bioproceso.
3:33:27La posibilidad de explotar estas
3:33:29interacciones tan específicas entre
3:33:32estos ligandos a los que va a ser afín
3:33:33nuestro producto, reduce
3:33:35considerablemente la complejidad del
3:33:37procesamiento downstream. Por ende,
3:33:39disminuye el número de las etapas o
3:33:41pasos necesarios y también mejora la
3:33:43robustez, eh, del proceso.
3:33:45Sin embargo, pues, también viene con sus
3:33:47desventajas, introduce dependencias, eh,
3:33:50tecnológicas, eh, costos elevados y
3:33:52considera- consideraciones regulatorias
3:33:54que deben ser evaluadas, o sea, que se
3:33:55debe de verificar la viabilidad de estas
3:33:57columnas, eh, cromatográficas.
3:34:00Mmm, también, como ya mencioné, es
3:34:02importante comprender que no existe un
3:34:04diseño único ni universal para la
3:34:06purificación, eh, de los
3:34:07biofarmacéuticos.
3:34:09Ehm,
3:34:11aquí, pues, no hay que
3:34:13casarnos con la idea de que, pues, una
3:34:16técnica se utiliza exclusivamente para
3:34:18cierta etapa, por ejemplo, que la
3:34:20cromatografía de afinidad siempre va a
3:34:21utilizarse en la etapa de captura, o que
3:34:24la cromatografía de intercambio iónico
3:34:25siempre va a utilizarse en la
3:34:27purificación intermedia, o que la
3:34:29cromatografía de exclusión molecular
3:34:30solamente va a ser exclusi- exclusiva de
3:34:32la etapa final, de la etapa de pulido.
3:34:35Eh, en la práctica, pues, una misma
3:34:36técnica puede emplearse en diferentes
3:34:38etapas del proceso, dependiendo, eh,
3:34:40pues, del contexto, ¿no?
3:34:43Eh el diseño downstream debe basarse en
3:34:46una
3:34:47selección lógica de las operaciones
3:34:50unitarias y que de la cual va a estar
3:34:52fundamentada eh pues decíamos en las
3:34:55propiedades del sistema de la mezcla,
3:34:56las propiedades fisicoquímicas del
3:34:58producto y los objetivos del proceso, de
3:34:59lo que queramos lograr en cada en cada
3:35:02etapa.
3:35:03Eh aquí de nuevo hay que recordar eh la
3:35:05aplicación
3:35:08eh de princi- los principios de
3:35:10ortogonalidad,
3:35:11establecer un balance entre pureza
3:35:13rendimiento, la compatibilidad entre las
3:35:16etapas
3:35:18y el cumplimiento hm de los atributos
3:35:21críticos de calidad.
3:35:22Entonces, eh pues al final decíamos nos
3:35:25cerramos como que no existe eh un
3:35:28proceso un proceso único, pero pues sí
3:35:31hay muchas eh consideraciones a tener
3:35:34presentes pues a la hora de definir eh
3:35:36el proceso y que hay que considerar que
3:35:39los estándares hm de calidad y de pureza
3:35:42requeridos para la producción industrial
3:35:45de estos productos, o sea, ya a nivel eh
3:35:47o sea, que son de aplicación eh
3:35:49farmacéutica, son insumo para la salud,
3:35:51pues van a ser mucho más eh rigurosos
3:35:53que los que se utilizan pues para
3:35:55cualquier otro eh otro proceso
3:35:57industrial.

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