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11 ¿Dónde se producen los biofarmacéuticos? — Transcript

by Aída Jimena Velarde Salcedo · 25,664 words · 4,310 segments · language en · Watch on YouTube

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0:07Hola, bienvenidas y bienvenidos a otro
0:09video del curso Diseño de
0:11Biofarmacéuticos.
0:12En esta sesión vamos a revisar el primer
0:15tema de la tercera unidad. Ya estamos en
0:19la segunda parte del curso. Eh, ya hemos
0:22visto y abordado algunos eh conceptos eh
0:26y temas referentes a la importancia de
0:29los medicamentos biotecnológicos,
0:31eh cómo es el paso que deberían de
0:34seguir para llegar al mercado, eh
0:36algunas características que tienen en
0:39términos eh pues de sus propiedades eh
0:43de sus propiedades biológicas. hemos
0:45visto cuáles son sus potenciales
0:47aplicaciones y y los eh principales eh
0:50tipos de biofarmacéuticos y cuáles son
0:52sus mecanismos de acción. También hemos
0:54revisado algunos conceptos eh
0:56relacionados con eh farmacología y
0:58cuáles son eh justamente estas
1:01diferencias entre los medicamentos
1:04biotecnológicos que en su mayoría van a
1:06ser eh proteínas recombinantes o
1:08moléculas de ácidos nucleicos versus los
1:11fármacos eh los fármacos clásicos o
1:14moléculas pequeñas de síntesis química.
1:16Eh, en esta unidad, en la unidad tres,
1:19vamos a hablar ahora sobre eh los
1:21sistemas de producción, cómo es que se
1:24generan eh y lo vamos a ver desde el
1:26punto de vista del eh el diseño o el
1:29desarrollo farmacéutico, la parte de la
1:31investigación de cómo generar una eh
1:34línea eh recombinante que sea capaz de
1:37producir una proteína terapéutica, una
1:39molécula terapéutica con eh pues con
1:42ciertos atributos eh de calidad y que
1:45sea también algo rentable y producible a
1:48gran escala, ¿no?
1:50También vamos a ver pues las ventajas y
1:53desventajas de las diferentes
1:54plataformas de expresión que están
1:56disponibles a nivel tecnológico,
1:59cuáles son las que más se utilizan y
2:01también vamos a revisar
2:03eh pues aspectos relacionados con pues
2:06el diseño de los bioprocesos, tanto la
2:08etapa upstream y downstream, cuáles son
2:10las estrategias, por ejemplo, de
2:11escalamiento que se pueden utilizar, los
2:13tiempos de producción eh para el
2:16procesamiento downstream, toda cómo se
2:18integran todas estas estas estas
2:20operaciones unitarias, todos estos
2:22procesos de bioseparación que van a dar
2:24lugar a un producto purificado en una
2:27concentración suficiente y como eh pues
2:30ya capaz de de poder darle una
2:32presentación farmacéutica y ser
2:34formulado.
2:35Y también al final de esta unidad
2:37revisaremos algunas de las técnicas que
2:39se utilizan para la parte de la
2:41caracterización,
2:43que esto también es un reto en términos
2:47pues regulatorios y de aseguramiento de
2:49la calidad e ya que eh pues para poder
2:53nos para poder estar seguros de que el
2:56medicamento, la sustancia que se está
2:57produciendo tiene los eh los atributos
3:00de calidad necesarios, pues es necesario
3:02hacerles pruebas tanto en la etapa de
3:04investigación y desarrollo como ya
3:05algunas pruebas eh rutinarias. Entonces,
3:08también pues recalcando estas
3:10diferencias moleculares y estructurales
3:12que tienen la mayoría de los
3:14medicamentos biotecnológicos con
3:15respecto a los fármacos de síntesis
3:17química, pues aquí también hay una serie
3:20eh de técnicas analíticas eh diferentes
3:23o que deben de adaptarse a a
3:26biomoléculas pues mucho más complejas. Y
3:29bueno, en este en el tema de este video
3:31vamos a hablar particularmente sobre las
3:33plataformas biológicas para la
3:36producción de medicamentos
3:38biotecnológicos, que eh aquí un punto
3:41importante para aclarar es que esta
3:43etapa de dónde se producen los
3:44biofarmacéuticos
3:46no corresponde como tal eh al proceso
3:50industrial o al proceso ya al proceso de
3:52manufactura rutinario, sino esto es el
3:54definir esta etapa eh corresponde más
3:57bien a la etapa de desarrollo
3:59farmacéutico, ¿no? cuando queremos, ya
4:01tenemos la molécula candidata que se
4:03quiere producir y que puede tener un
4:05potencial un potencial terapéutico, el
4:07definir si se va a producir en una
4:09levadura, en una bacteria, en células de
4:12mamífero, en células vegetales, todo eso
4:15eh pues se define o es necesario
4:17establecerlo para eh generar eh una
4:21línea genéticamente modificada, una
4:23célula de hibridoma o pues la técnica
4:26que la plataforma biológica que se vaya
4:28a utilizar.
4:33Y bien, de todas las opciones eh
4:34tecnológicas y biológicas que tenemos a
4:36la mano, eh cómo podemos elegir a la
4:39plataforma biológica de forma adecuada.
4:42Aquí es importante volver a a tener en
4:45cuenta que los medicamentos
4:46biotecnológicos
4:48eh pues decíamos están basadas en
4:51terapias eh a base de macromolécula
4:55macromoléculas muy complejas eh ya sea
4:58una proteína, una molécula de ácido
4:59nucleico o incluso pues una célula o una
5:02partícula viral como un producto de
5:03terapia génica. Eh y que por ende pues
5:06van a ser producidas mediante sistemas
5:08eh sistemas biológicos.
5:11Eh, aquí también olvidemos que en este
5:14tipo de biomoléculas, pues la estructura
5:16tridimensional o las modificaciones
5:18postraduccionales o el ensamblaje que
5:21puedan adquirir, pues van a ser
5:22importantes para la actividad biológica,
5:25la estabilidad y también la seguridad
5:27clínica. Entonces, eh pues sí es
5:31importante eh seleccionar una plataforma
5:34de expresión adecuada que funcione como
5:37una fábrica celular capaz de traducir
5:40información genética en proteínas
5:42funcionales con las características eh
5:45con las características adecuadas.
5:49Entonces, pues aquí la plataforma, la
5:51lección de la plataforma biológica no es
5:53algo trivial porque obviamente va a
5:55impactar directamente en la calidad del
5:58producto, ya sea a nivel de estructura,
6:00plegamiento, los perfiles de
6:02glicosilación, pero pues también hay que
6:04tener en cuenta eh también los
6:06rendimientos, los niveles de
6:08productividad, los costos, qué tan
6:11fácilmente escalable sea el cumplimiento
6:14regulatorio y también algunos eh pues
6:16aspectos de de seguridad. biológica que
6:18van inherentes con el manejo de algunas
6:21plataformas biológicas.
6:23Entonces, dentro de las em
6:26consideraciones o puntos que se deben de
6:27tomar en cuenta para poder definir cuál
6:30sería eh la mejor plataforma biológica
6:33para un producto determinado, pues tiene
6:35que ver desde las características eh del
6:38producto, que aquí yo lo estoy enfocando
6:40como hacia una proteína terapéutica, eh
6:43la calidad del producto, algunos
6:45aspectos operativos, viabilidad,
6:48eh puntos regulatorios. Sí. Eh, con
6:51respecto a las características eh de la
6:54proteína, pues podemos hablar de la
6:56complejidad estructural. Eh, podemos
6:59tener desde proteínas pequeñas eh no
7:03glicosiladas que no tengan puentes de
7:05sulfuro, ninguna modificación eh
7:07postraduccional, por ejemplo, algún
7:08pétido. Incluso, por ejemplo, la misma
7:10insulina solamente tiene dos puentes de
7:12insulfura, es una molécula bastante
7:14sencilla. Esta este tipo de moléculas,
7:17pues podrían producirse de manera eh
7:20adecuada en sistemas procariotas. Eh, y
7:24si esto lo contrastamos, por ejemplo,
7:26con un anticuerpo monoclonal,
7:29que pues es una glicoproteína eh
7:33multimérica de gran peso molecular que
7:35tiene pues tanto glicosilaciones,
7:38eh puentes de sulfuro, diferentes
7:40niveles eh de plegamiento, pues aquí eh
7:44pues una bacteria va a ser muy difícil
7:45que pueda producir un anticuerpo
7:47completo o que lo haga de manera
7:49adecuada, que sea eh biológicamente
7:51activo. Entonces, en estos casos, pues
7:53sería más bien necesario recurrir a
7:56sistemas a sistemas eucariotas, ¿no?
8:00Dando un poquito más sobre esto de las
8:02características de las de las proteínas,
8:04por ejemplo, los puentes de sulfuro,
8:06decíamos que eh pues en bacterias es más
8:10difícil. Eh, hay que considerar que el
8:13citoplasma de las bacterias pues es más
8:16bien un ambiente un ambiente reductor,
8:19lo que dificulta la formación correcta
8:22de estos de estos puentes de sulfuro.
8:24Sin embargo, pues hay estrategias eh
8:27para hacer que una bacteria produzca
8:29proteínas glicosiladas. Por ejemplo,
8:31puede ser la expresión o el eh la
8:34acumulación de la proteína en el espacio
8:36periplásmico entre la membrana y la
8:37pared celular o incluso pues el el uso
8:40de cepas modificadas.
8:43Eh, con respecto también pues a las
8:46modificaciones postraduccionales, eh el
8:48criterio o el punto más determinante en
8:51este tipo de modificaciones, pues es las
8:53es la glicosilación. Ya hemos visto que
8:55las glicosilaciones eh son relevantes en
8:58los medicamentos biotecnológicos porque
9:00pueden afectar propiedades eh como la
9:03estabilidad, la actividad biológica eh y
9:06la inmunogenicidad, que recordemos que
9:08este último pues es un problema eh de
9:10seguridad que pues puede llegar a ser
9:12bastante importante. Entonces, si la
9:15proteína o el medicamento biotecnológico
9:17que queremos producir va a estar
9:20glicosado, pues lo más seguro es que
9:21tengamos que irnos a sistemas
9:23eucariotas. Pero, ¿a cuál? Eh, también
9:26ya hemos mencionado que eh en levaduras,
9:30células de insecto, células de mamífero,
9:32células vegetales pueden eh generar
9:36patrones de glicos eh diferentes.
9:40Entonces, pues aquí eh pues hay que
9:43considerar de qué tamaño son esos
9:44glicilaciones, qué tan importantes son
9:46para la estabilidad, la actividad
9:48biológica, la afinidad con receptores.
9:52Por ejemplo, las células de mamífero,
9:54que son las que pues más se utilizan
9:56para proteínas glicosiladas,
9:58se utilizan porque son capaces de
10:01generar glicosilaciones complejas con
10:04terminaciones en ácido cálico, lo cual
10:07es importante para prolongar el tiempo
10:09de vida media en las proteínas
10:11terapéuticas.
10:13Em, si en contraste las levaduras eh,
10:16por ejemplo, pueden eh generar patrones
10:19de glicos distintos y permanoscilados
10:22que además eh de alterar la
10:24farmacocinética, además pueden inducir
10:26respuestas inmunológicas.
10:28E otro punto importante eh que tiene que
10:31ver con eh
10:35la selección de la plataforma de
10:36expresión es la localización celular eh
10:40de la proteína en su estado nativo. Por
10:42ejemplo, si un anticuerpo e pues casi
10:46siempre va a tener la secuencia señal
10:47que permitan una secreción extracelular.
10:50Habrá otras que se mantengan de forma
10:53intracelular. Todo esto va a influir en
10:56la eh expresión del sistema, ¿no? En la
10:58elección del sistema, perdón. E
11:02y aquí pues también se pueden hacer eh
11:04implementar estrategias eh
11:06biotecnológicas o de ingeniería
11:07genética, pues para dirigir la
11:09acumulación de una proteína eh en un
11:12espacio en un espacio y otro. Eh, lo que
11:15sí es importante es tomar en cuenta que
11:17las proteínas eh que son secretadas
11:21eh pues o digamos que lo ideal sería que
11:24la mayoría de los medicamentos
11:25biotecnológicos o las proteínas
11:27recomendantes que se expresan eh se
11:29secreten al medio de cultivo porque esto
11:31facilita el procesamiento el
11:33procesamiento downstream, ya que no se
11:34tiene que hacer una lisis celular.
11:36Entonces, eso también tiene que ver con
11:37los aspectos eh operativos.
11:41Eh, también eh hay que tomar en cuenta
11:45la complejidad o qué tantos órdenes e de
11:49estructura es necesario que adquiera que
11:51adquiera la proteína eh para ser
11:53biológicamente activa y si la plataforma
11:55biológica es capaz eh es capaz de
11:58producirlo.
12:00Ya habíamos dicho
12:02e
12:04que,
12:07por ejemplo, un anticuerpo monoclonal,
12:09que en realidad son cuatro cadenas de
12:11aminoácidos que se sintetizan de manera
12:13independiente y que además se tienen que
12:15ensamblar, este se tienen que glicosilar
12:18este y adquirir un plegamiento
12:19específico. Pues esto probablemente en
12:21plataformas eh pues si procariot les
12:23digo, no no va a ser posible.
12:25Ah, con respecto a la calidad eh del
12:28producto, aquí volvemos a hablar de las
12:30modificaciones posttraduccionales.
12:33Eh, decíamos que las glicosilaciones
12:35pues intervienen mucho en la
12:38estabilidad, la interacción con los
12:40receptores y la tasa tiempo de vida
12:42media eh en el organismo. Entonces se
12:46tiene que verificar que la plataforma
12:48que se seleccione
12:50pues no, o sea, si bien puede ser que no
12:53esté glicosilada o que las
12:55glicosilaciones sean diferentes, sí se
12:57tiene que evaluar que esos cambios pues
13:00no afecten estos puntos que ya eh que ya
13:02mencionamos, o sea, que no vaya a haber
13:04eh propiedades farmacocinéticas eh no
13:06deseadas o eh pérdida de la de la
13:09actividad biológica, ¿no?
13:13También hay que tomar en cuenta pues
13:16algunas
13:19eh por ejemplo cuestiones
13:22de la cantidad de contaminantes que
13:27pudieran estar presentes
13:29eh dependiendo de la, o sea, presentes
13:32en el sistema, dependiendo de la
13:33plataforma biológica que se seleccione y
13:35que pues sea necesario eliminarlas por
13:39pasos tal vez más que más rigurosos en
13:42el procesamiento Downstream, ¿no? Por
13:44ejemplo, en el caso de las bacterias,
13:46pues eliminar endotoxinas como el
13:49hipopolisacárido puede ser un proceso eh
13:51pues bastante engorroso en el proceso de
13:53purificación.
13:54eh versus por ejemplo eh con células eh
13:57de mamífero que eh pues estas estas
14:01células, los medios de cultivo, por
14:03ejemplo, suelen eh contener o
14:05suplementarse con suelo con sueros
14:07animales, con sueros de animal, eh que
14:10esos también pues deben de pasar eh
14:13criterios de seguridad rigurosos en
14:15cuanto a que no deban de tener
14:17partículas eh virales o otros agentes
14:20infecciosos. Entonces, eso también pues
14:23va a influir en la calidad del producto
14:25o de cómo se va a diseñar el proceso.
14:28E también
14:30la consistencia de la plataforma
14:33biológica.
14:34Eh,
14:36aquí pues sí es importante asegurarnos
14:39que el medicamento mantenga eh los
14:41atributos críticos de calidad de acuerdo
14:43a las requerimientos de las autoridades
14:46eh regulatorias. Entonces, esto quiere,
14:49esto implica que la plataforma que se
14:52utilice debe de ser robusta y
14:54reproducible, ¿no? gusta se refiera se
14:57refiere, perdón, a que pueda trabajar eh
15:01pues en un rango, en un intervalo de
15:03condiciones
15:05pues lo más amplio posible para y
15:08siempre dando el mismo resultado, o sea,
15:10de que por ejemplo que pueda crecer hm
15:13podamos por decir algo, no sé, de 25
15:15hasta 40ºC entre que solamente pueda
15:18crecer nada más a 37 y si no está 37 eh
15:22pues ya no ya no crece el organismo,
15:24¿no? Entonces, eh establecer esas
15:26estrategias de control, o sea, mientras
15:28más robusto sea un sistema, pues va a
15:30ser más fácilmente controlable, ¿no?
15:32porque no
15:34eh
15:36vaya, no las consecuencias no van a ser
15:38tan severas y se sale uno un poquito de
15:40de las condiciones óptimas y también
15:43pues que sea reproducible, que siempre
15:45eh o bueno, que el producto obtenido a
15:48lo largo de eh los lotes, diferentes
15:51generaciones de producción e pues sea
15:55pues lo más cercano posible a lo que se
15:58autorizó para obtener las
16:00características del producto de acuerdo
16:01a lo que se estableció. el registro
16:03sanitario.
16:05Eh, y bueno, con con también hay que
16:08tomar en cuenta algunos aspectos
16:10operativos, tanto en la en las etapas
16:13offstream y downstream. En la etapa
16:15offstream, por ejemplo, eh pues hay que
16:18seleccionar una una plataforma biológica
16:21que se adecúe mejor, por ejemplo, a la
16:24velocidad de crecimiento celular, la
16:26densidad celular que podemos alcanzar en
16:29el en un cultivo, en un solo lote. Eh,
16:34y también, o sea, todo esto se tiene que
16:37eh equilibrar muy bien con todos los
16:40demás puntos que ya que ya hemos
16:42mencionado, ¿no? por ejemplo, ¿qué caso
16:43tiene que crezca? Si no sé, digamos que
16:45si utilizamos un sistema bacteriano, eh,
16:48que alcancemos niveles muy altos de
16:51biomasa, pero pues la proteína no va a
16:53estar bien plegada, va a estar
16:54desnaturalizada, se va a expresar de
16:56forma incompleta, ¿no? Entonces, hay que
16:59tomar todo esto en consideración.
17:01Eh, si bien eh las bacterias y las
17:03levaduras permiten alcanzar densidades
17:06celulares eh y rendimientos en cuanto a
17:10producción de proteína pues bastante
17:12favorables en un tiempo muy corto. Eh,
17:14les digo, pues están estos atributos que
17:16pues a veces no son con las em con los
17:19atributos críticos de calidad eh
17:21necesarios para un producto viable, ¿no?
17:24Por otro lado, las células de mamífero,
17:27pues tenemos que son las que generan las
17:29proteínas más
17:31parecidas a las humanas. O, por ejemplo,
17:34si hacemos una línea celular de una
17:36línea de células humanas, pues así ahí
17:38sí tenemos esa garantía de la maquinaria
17:40biológica, pero pues estas son células
17:42que son de crecimiento muy muy lento,
17:44son muy delicadas, fácilmente se
17:46contaminan. Eh, pues hay pues hay pros y
17:51contras, ¿no? También pues los sistemas
17:53eh de manipulación genética eh sistemas
17:57procariotas o algunas levaduras pues ya
17:59tienen eh ya hay técnicas eh de
18:02transgénesis o de modificación genética
18:04eh bastante rápidas y económicas.
18:07Eh, y por otro lado, eh, en las líneas
18:12celulares, por ejemplo, pues puede el
18:14tiempo el que podrá tomar obtener una
18:18línea genéticamente modificada con
18:20nuestro biofarmacéutico de interés, pues
18:22podría tomar mucho más tiempo. Entonces,
18:24también que hay que ver eh y y también
18:27con métodos más caros, ¿no? Entonces,
18:29hay que ver cuáles son las eh las
18:31capacidades de la empresa para irse a
18:33una u otra plataforma, ¿no? porque esa
18:34también es eh pues no hay manera, no no
18:37tenemos la infraestructura para utilizar
18:39eh sistemas biológicos más complejos,
18:41pues tenemos que irnos a los más
18:42sencillos, ¿no?
18:44Y bueno, en con respecto al
18:46procesamiento downstream,
18:48decíamos que la localización del
18:51producto, ya sea si una proteína se
18:52acumula dentro de la célula o si se
18:55secreta el medio de cultivo, pues esto
18:57va a impactar de manera importante la
18:59complejidad del procesamiento del
19:01procesamiento downstream, ya que si las
19:04si la proteína se expresa y se acumula
19:07dentro de la célula, eh pues es
19:09necesario eh hacer una lisis celular. Y
19:12si por ejemplo para esto se utilizan
19:13agentes químicos muy abrasivos, pues
19:15estos también no pueden estar en la
19:17formulación final. Entonces, hay que
19:18ponerlos en hay que a incorporar pasos
19:21en el proceso de producción que aseguren
19:24la remoción de esos agentes eh a niveles
19:27eh a niveles seguros.
19:29Eh, también hay que tomar en cuenta la
19:31escalabilidad.
19:33Eh, no todos los sistemas biológicos
19:36responden de la misma forma al proceso
19:38del escalamiento eh en un biorreactor.
19:42Por ejemplo, las células de mamífero
19:45requieren condiciones más estrictas de
19:47control en cuanto, por ejemplo, pH,
19:49oxígeno disuelto o no aguantan e
19:54velocidades de agitación, o sea, los
19:58niveles de agitación que se manejan para
19:59este tipo de cultivos no es para nada ni
20:02cercano a la agitación que uno
20:04esperaría, por ejemplo, en un en un
20:06biorrector eh para células bacterianas,
20:08porque son eh las células de mamífero eh
20:11pues no tienen pared, son más delicadas
20:13en cuanto a este estrés por este estrés
20:16mecánico, ¿no? Entonces eso, o sea, los
20:20biorreactores que se utilizan para
20:21células de mamífero son diferentes a los
20:23que se utilizan en sistemas eh
20:25bacterianos o de levaduras.
20:27Con respecto a la viabilidad industrial,
20:29pues también hay que tomar en cuenta la
20:32economía del proceso, eh, o sea, qué tan
20:36caro o barato sea una plataforma, por
20:39ejemplo, pues hay que tomar en cuenta,
20:40digamos, los medios de cultivo, ¿no? Eh,
20:45los componentes del medio de cultivo eh
20:48que se utiliza para bacterias o
20:50levaduras son mucho más sencillos que
20:52los que se utilizan para células de
20:53mamífer, ¿no? Como decía, eh las células
20:55de mamíferos tienen que suplementarse eh
20:58con vitaminas, casi prácticamente todos
21:01los 20 aminoácidos necesarios para la
21:03síntesis de proteínas, eh un control muy
21:06estricto de pH, eh suplementarse con eh
21:11decíamos con sueros animales y esto
21:14también pues incrementa incrementa los
21:16costos, ¿no? la infraestructura, como
21:18decíamos, en cuanto a los el uso de los
21:20biorreactores, las estrategias de
21:22control, eso también, obviamente
21:23incrementa los precios, también, por
21:26ejemplo, los riesgos de contaminación
21:28que podían estar inherentes con un tipo
21:30de eh plataforma biológica u otra, eh
21:34por ejemplo, a líneas celulares eh de
21:36mamífero que requieren niveles de
21:38bioseguridad eh del tipo dos, mientras
21:42que eh pues unas un sistema bacteriano
21:45probablemente no lo necesita. Y esto a
21:47nivel de infraestructura
21:49pues tiene muchas implicaciones, ¿no? De
21:50sistemas eh de ventilación cerrados o
21:53también cómo va a ser el acomodo de
21:55todos los equipos de manera que se
21:57asegure que no haya una contaminación eh
22:00cruzada en etapas posteriores eh en
22:02etapas posteriores de de la
22:04purificación, etcétera, ¿no? La
22:05logística de cómo van a cómo va a estar
22:08ubicada ubicados todos los equipos, ¿no?
22:10Necesarios para la producción, los
22:12tiempos de desarrollo, ¿no? O sea,
22:14cuánto tiempo tarda en llegar a cierta
22:16cierta densidad celular, una célula
22:18bacteriana versus una célula animal
22:19versus a una célula vegetal, ¿no? Eh,
22:23las técnicas que utilicemos para la
22:25purificación, etcétera. O sea, todo eso
22:26va a influir y pues puede ser que uno se
22:28decante por una plataforma eh o por
22:31otra. De manera general, pues sí podemos
22:33decir que las bacterias y las levaduras
22:35presentan eh costos pues obviamente
22:38muchísimo menores en comparación con las
22:39células de mamífero. Eh, sin embargo,
22:43ahorita vamos a ver en la siguiente
22:45diapositiva cuáles son las plataformas
22:47que más se utilizan.
22:50Eh,
22:52también hay que eh
22:56tomar en cuenta eh decíamos las agencias
22:58regulatorias
23:00eh
23:02dependiendo de la tanto las agencias
23:05regulatorias, o sea, los gobiernos, las
23:07propias empresas farmacéuticas, puede
23:08ser que también se decanten más por una
23:10plataforma u otra, dependiendo de qué
23:12tanta eh experiencia tengan eh con estos
23:17sistemas biológicos. Eh, por eso también
23:19tengo aquí esta nota de sobre la
23:21industria eh sobre la industria
23:23conservadora, ¿no? Eh, el utilizar
23:26plataformas biológicas con las que las
23:29agencias regulatorias ya tengan cierta
23:31experiencia en cuanto a su aprobación,
23:33sepan cómo funcionan, qué tan seguras
23:35son, eh pues va a ser más fácil el
23:37proceso el proceso de aprobación. O sea,
23:40si nosotros proponemos para la
23:43producción de x medicamento utilizar una
23:45plataforma menos eh tradicional,
23:48eh pues esto puede implicar eh a nivel
23:50regulatorio pues que tenga que ser más
23:53exhaustiva la caracterización y
23:55validación tanto del producto como de la
23:57plataforma biológica, porque también a
23:59nivel regulatorio se pide la
24:00caracterización de la plataforma
24:01biológica.
24:03Eh, estos estudios adicionales, pues
24:05obviamente también pues van a a
24:07entorpecer o facilitar el proceso. Eh,
24:11también eh la trazabilidad del sistema,
24:14la estabilidad eh genética de la línea
24:17celular, la ausencia o presencia de
24:19contaminantes son aspectos eh críticos a
24:23lo que le pueden poner mucho más
24:24atención las agencias regulatorias
24:26dependiendo de la plataforma biológica
24:27que se utiliza.
24:31Entonces, pues al final la selección de
24:33la plataforma ya a niveles prácticos,
24:36pues no nos vamos a casar con un
24:38basarnos en un solo criterio. Se deben
24:40de tomar en cuenta todos estos factores,
24:43ponerlos en una balanza.
24:45Eh, aquí pues de manera que te eh de
24:49tener de una forma más eh equilibrada
24:53eh cuál es el sistema que sea más
24:56adecuado para cumplir con los atributos
24:59críticos del producto al menor costo y
25:02tiempo posible y con los menores eh con
25:05los menores riesgos. Eh, entonces, pues
25:08al final es encontrar este balance entre
25:10calidad, productividad y costos.
25:16Entonces, en esta diapositiva se muestra
25:19una gráfica donde se señalan el número
25:23de productos eh de medicamentos
25:25biotecnológicos aprobados en el mercado,
25:29o sea, para uso terapéutico, eh
25:32clasificados dependiendo de la
25:34plataforma biológica eh que se utiliza.
25:38Entonces, pues aquí podemos ver que si
25:41bien uno pensaría que es más la que la
25:45plataforma que cumple con las tres ve
25:48serían las bacterias, ¿no? en cuanto a
25:51rapidez, que sea barato y pues que sea
25:53eficiente, pues vemos que en la realidad
25:55eh pues hay otras plataformas que se
25:57utilizan más en la industria
25:58farmacéutica y esto pues tiene que ver
26:02pues por la complejidad de los productos
26:05que se quieren generar, que decíamos eh
26:07pues van a ser proteínas con eh con
26:10cierto ensamblaje, modificaciones
26:11postraduccionales, glicosilaciones,
26:14este cosas que ecoli o las bacterias
26:17pues no lo van a poder hacer. Entonces,
26:20pues en ese sentido, eh pues es muy
26:22lógico ver que las plataformas de
26:24mamífero son las que más se utilizan en
26:26la industria farmacéutica, a pesar de
26:28que son las más delicadas, las más
26:29lentas y las más caras, por el simple
26:32hecho de que puedan eh generar pues las
26:36proteínas o el producto con los
26:38atributos de calidad deseados, pues ya
26:40con eso es suficiente o tiene el
26:42suficiente peso para compensar todas
26:45estas desventajas que ya mencionamos.
26:47Entonces, eh aquí podemos ver que las la
26:51plataforma
26:54eh más importante serían las células eh
26:58las células ch, las células de ovario de
27:00hámsterino, seguidas de las BHK, que son
27:04eh son células de riñón de hámster,
27:08seguido por eh líneas celulares humanas,
27:11principalmente la las células he, que es
27:13son células embrionarias de riñón. Eh, y
27:17ya aquí tenemos eh con un número pues
27:19también bastante considerable, es más o
27:21menos como un cuarto del pastel, tal vez
27:23un poquito más, eh a Ecoli, ¿no? O sea,
27:27sí, sí se utilizan mucho, pero pues
27:29también eh como ya hemos mencionado,
27:31pues las primeras eh proteínas
27:32terapéuticas que se aprobaron en el
27:34mercado, pues eran proteínas más
27:35sencillas, ¿no? la insulina, la hormona
27:38del crecimiento, eh e interleucinas,
27:42interferones, factores de crecimiento
27:43hematopoyético.
27:45Eh, entonces de aquí podríamos estar
27:47clasificando a todos estos todos estos
27:49productos, ¿no? Luego tenemos eh
27:53levaduras como sacaromises y sacaromises
27:56cerebici y pique a pastoris. Eh, esta
27:59gráfica voy a vale la pena aclarar, es
28:01como eh tiene un corte como del 2016, ya
28:04tiene unos añitos, pero en general no ha
28:07cambiado mucho en cuanto a la proporción
28:09del eh pues de las células de mamífero
28:11las bacterias, pero aquí, por ejemplo,
28:12piquia eh con el paso de los años ya ha
28:15sido eh un poquito más relevante. Luego
28:18tenemos esta de color como azul
28:21grisáceo, que también pues es un es un
28:24tiene un cachito considerable del pastel
28:26eh que se refiere a las células de
28:28mieloma, ¿no? Que recordemos que la
28:30tecnología de hibridomas y las células
28:32de mieloma e
28:35son era una plataforma o es una
28:37plataforma que se utiliza mucho para la
28:40producción de anticuerpos monoclonales.
28:43Si, aunque esto ya yo creo que con pues
28:45se va a ir desplazando poco a poco con
28:47los anticuerpos pues completamente
28:50recombinantes. Y por aquí pues tenemos
28:52otros eh que estos pues van a incluir eh
28:56eh por ejemplo células de insecto,
28:58células vegetales y también podemos
29:01incluir eh animales eh transgénicos.
29:07En esta en esta tabla se listan algunas
29:10eh propiedades, ventajas y desventajas
29:13que pueden eh tener pues algunas
29:17plataformas biológicas, no son todas, yo
29:19creo que las más representativas
29:22eh y que de nuevo pues son algunas eh
29:25consideraciones pues para la selección
29:28correcta de la plataforma de expresión
29:30dependiendo pues del producto de
29:31interés. Eh, deseamos eh tenemos aquí
29:34las eh los sistemas procariotas,
29:36principalmente representado por
29:38esquerikia coli, eh los sistemas de
29:42levaduras,
29:44sistemas de células de mamífero, células
29:47vegetales y animales transgénicos. Aquí
29:51yo creo que de los que vamos a revisar
29:52en el en el resto del video nos falta
29:56eh hongos filamentos
29:58y células de insecto. Eh, entonces, pues
30:01al final todos decíamos todos van a
30:03tener eh sus pros y contras. Ya vimos en
30:05la realidad de la industria, pues cuáles
30:07son las que más se utilizan.
30:10Eh, en cuanto, por ejemplo, a los
30:12niveles eh de rendimientos de producto
30:14que podemos obtener, eh los sistemas eh
30:19eh procariotas y de levaduras, pues son
30:22los que pueden tener eh mejores, o sea,
30:25un mejor balance en este sentido en
30:26cuanto una buena productividad, en
30:29menores tiempos eh de replicación.
30:32Eh,
30:34y aquí las células eucariotas sí les
30:36toma más tiempo, pero ya también se ha
30:38como son las es una de las plataformas
30:40que más se utiliza, pues ya se ha
30:41estandarizado o eh mejorado eh a tal
30:45grado que pues ya podemos obtener eh muy
30:47buenos rendimientos. Con los animales
30:49transgénicos, pues estamos en un punto
30:51intermedio y las células vegetales, pues
30:53aquí ya la producción es un poquito más
30:55baja. Ahorita vamos a a hablar un
30:56poquito de eso. Tiene mucho que ver eh
30:58pues con los métodos de modificación
31:00genética que se utilizan.
31:02En cuanto a las características
31:05estructurales de las proteínas que
31:07pueden eh producir y ensamblar, eh los
31:10sistemas procaburrietas pues tienen la
31:12limitante pues que no pueden eh realizar
31:14modificaciones eh postraduccionales
31:16complejas. deseamos también eh esto de
31:18las
31:20de la producción de eh la sí la
31:24generación de puentes de puentes de
31:25sulfuro o que no puedan ensamblar
31:27correctamente eh muchas proteínas muy
31:30grandes, además que tienen esta
31:31limitante de secretar eh proteínas al
31:34medio. Eh los sistemas ehucariotas, como
31:37el resto de los que se listan aquí, pues
31:39no tienen estas limitantes.
31:42Nada más que pues aquí el detalle sería
31:44la cuestión de las glicos
31:47el estado de agregación. Pues aquí de
31:50nuevo los sistemas procariotas, pues
31:52proteínas con las que no se siente muy
31:54cómoda la célula eh generando proteínas
31:56muy complejas, pues generalmente van a
31:58dirigir la producción a cuerpos de
32:00inclusión, que esto pues puede ser una
32:03ventaja, una desventaja desde el punto
32:05de vista de eh de producción. eh puede
32:08la formación de cuerpos de inclusión que
32:11al final pues son agregados eh de
32:13proteína mal plegada, pues sí puede
32:15ayudar al proceso de purificación
32:16siempre y cuando esa esa
32:18desnaturalización y agregación pues sea
32:21eh sea irreversible, mientras que los
32:23sistemas eucariotas pueden hacer eh pues
32:25sintetizar proteínas eh complejas sin
32:26mayor problema. Igual lo mismo para para
32:29el plegamiento. Tenemos esta esta
32:31limitante en cuanto a las glicosaciones,
32:34que de nuevo ya hemos dicho que esto
32:35influye mucho en las propiedades
32:37farmacocinéticas, la eh la eficacia
32:40biológica y también eh la bioseguridad o
32:44la potencial inmunogenicidad.
32:46Eh, pues obviamente los sistemas
32:49procariotas y la proteína B está
32:51glicosilada, pues prácticamente pues no
32:52es una opción.
32:54Eh, levaduras sí pueden glicosilar, pero
32:57pues decíamos que estos van a eh
33:01perdón, a generar residuos de
33:03hipermanocilados que pues pueden ser
33:05inmunogénicos. Algo similar sucede eh
33:08con las células
33:11eh con las células vegetales. No van a
33:13ser necesariamente hipermanocilados,
33:14pero pues las glicosiones son diferentes
33:16y que pueden ser inmunogénicas.
33:19Entonces, en este sentido, eh la
33:20plataforma que es más eficiente para
33:22producir glicosilaciones, lo más
33:24parecido a las humanas, pues es la de
33:25pues la de mamíferos y más de nuevo si
33:27estamos usando porque se puede usar eh
33:30una línea celular humana. Los riesgos de
33:33contaminación aquí eh los agentes eh
33:35contaminantes que puedan estar presentes
33:37van a ser diferentes dependiendo en la
33:39plataforma biológica. Por ejemplo,
33:41decíamos que eh en bacterias,
33:43especialmente en bacterias eh gram
33:44negativas, endotoxinas como el
33:46hipopolisacárido, pues es un
33:48contaminante un contaminante común. Eh
33:51las las levaduras en cuanto a riesgos de
33:54contaminación, igual lo mismo con las
33:57células eh vegetales. Hm. Aquí pues es
34:01importante considerar que los agentes
34:02que pudieran hacer considerarse
34:04patógenos para estos sistemas biológicos
34:08no siempre van a ser eh patógenos, no
34:11suelen ser patógenos pues para eh pues
34:14para los mamíferos o sistemas animales.
34:16Entonces, aquí, por ejemplo, el riesgo
34:17de contaminación es bajo. Aquí yo
34:19agregaría en el caso de los,
34:22por ejemplo, las levaduras, si se
34:24utilizan organismos gras que se conocen
34:26como seguros, que se utilizan en la
34:28industria para generar alimentos, este,
34:30u otro tipo de productos, pues por eso
34:32también ese bajo riesgo. En el caso de
34:35las células vegetales, tenemos el riesgo
34:37eh, por ejemplo, de otro tipo de
34:39contaminantes eh de bajo peso molecular
34:41que podían llegar a ser muy difíciles de
34:44eh de eliminar. eh por ejemplo e la
34:47clorofila, eh algunos metabolitos,
34:51alcaloides que pues no quisiéramos que
34:53estuvieran presentes. Aquí pues también
34:55hay ese posible riesgo de contaminación.
34:58Eh y los sistemas eh, perdón, los
35:02sistemas
35:04de mamífero como los animales
35:06transgénicos o las líneas celulares,
35:08pues tenemos el riesgo que sí, que si se
35:10contamina eh un cultivo de este tipo,
35:12pues casi siempre va a ser por prones.
35:15eh o partículas virales que pues sí, el
35:18potencial de eh generar enfermedad en
35:21los humanos pues obviamente es mucho más
35:23alto. Entonces, en términos de seguridad
35:24se requieren condiciones más estrictas.
35:27Y bueno, al final aquí al final dice
35:29costos de manufactura. Decimos que
35:31levaduras y bacterias pues son los son
35:33las más baratas y las demás pues son más
35:36eh son más caras pues por la complejidad
35:39de la producción y mantenimiento.
35:44En esta tabla se desglosan algunos de
35:47los productos de los medicamentos
35:49biotecnológicos
35:51aprobados en el mercado que están, o
35:54sea, que son producidos en pues en
35:57diferentes plataformas biológicas, o
35:59sea, como que el medicamento más
36:00representativo para la producción en
36:02estas en estas plataformas. Tenemos pues
36:05el primero eh bacterias eh Ecoli. Pues
36:08aquí el producto estrella prácticamente
36:10es la insulina. fue el primer eh
36:12medicamento biotecnológico aprobado para
36:14eh a su uso en humanos. Este fue
36:17aprobado, hicimos, en 1982 por la
36:19empresa Ilail con el nombre de Umulina.
36:22Entonces, esto ya hemos hablado mucho.
36:25Eh, en cuanto a células eh de hibridoma,
36:30pues podríamos hablar eh pues sí, de
36:32esta que viene aquí desglosada en la
36:34segunda fila o también las células, si
36:36no me equivoco, las SP20,
36:40eh pues que se utilizan para la
36:41producción de anticupos monoclonales.
36:43Ambas son líneas de hibridoma o de
36:45mieloma. También eh tenemos las células
36:50namalgua. las células CHO, que son eh
36:53pues plataformas plataformas de
36:57de mamífero.
36:59Las células namalguas son eh una línea
37:01celular inmortalizada de linfocitos B.
37:05Eh las células CHO son células ovario de
37:06hámstero.
37:08Y pues como podemos ver, se utilizan
37:10para la producción eh pues de proteínas
37:12eh más complejas eh como por ejemplo el
37:14TPA. tenemos a sacaromisevicie que aquí
37:18eh pues desglosan pues la producción de
37:21insulina, que este también es un punto
37:22importante. Eh es, o sea, hay que tomar
37:25en cuenta que muchos medicamentos como
37:28la insulina pues se puedenir producir y
37:30se han producido en todas las
37:31plataformas biológicas que vamos a ver
37:33en este video.
37:35Y esto pues también tiene mucho que ver
37:37con maneras que hacen las empresas
37:39farmacéuticas o la competencia, pues,
37:41para buscar también su lugar en el
37:43mercado cuando, por ejemplo, por
37:45términos o alcances de ciertas patentes,
37:47el uso de una plataforma biológica eh
37:49está más limitada, ¿no?
37:52Eh, aunque también pues acaromise se
37:55utiliza mucho para eh la producción de
37:57proteínas de subunidades, por ejemplo,
37:59que se me viene a la mente es eh la
38:01vacuna contra la hepatitis B.
38:04Tenemos las células BHK, que esta es una
38:06línea eh también una línea celular
38:08humana. Eh las N S0, que esa es también
38:13una es una una línea celular de mieloma
38:16que se utiliza para la producción de
38:18anticuerpos.
38:19Eh, las células HEC, eh que también eh
38:24las células HEC y las células HT1080
38:27también son líneas celulares humanas.
38:28Aquí, perdón, creo que me dije una
38:30imprecisión. BHK es baby hamster kidney,
38:34o sea, son células de mamífero, no son
38:35células humanas.
38:37Eh, y eh luego viene Tení y ese
38:41Frujiperda que esta, por ejemplo, son eh
38:43es una plataforma eh de células de
38:45insecto eh que esta pues me o se fijan,
38:48se utiliza para la producción eh de
38:51vacunas, así como también eh pues
38:54productos de terapias avanzadas. este
38:56que viene aquí, el Provench, como una
38:59terapia celular eh
39:02para la generación de de cartílago, pues
39:05está descrita, o sea, en cierta manera
39:08utiliza esta plataforma biológica, este
39:11para activar a esas a esas células. Eh,
39:16estas, por ejemplo, eh las líneas
39:19celulares
39:20de insecto que más se utilizan, pues
39:22tienen que son de organismos como eh por
39:25ejemplo el gusano de la seda y algunas
39:27polillas.
39:29Y por último tenemos en cuanto a los
39:31productos vegetales, aunque ahorita lo
39:33vamos a a expandir un poquito más, el
39:35caso de la taliglucerasa alfa por la
39:38empresa eh Protalic, que esta se produce
39:42en células en células de zanahoria.
39:48Los sistemas de expresión en organismos
39:51procariotas, eh particularmente aquellos
39:53que están eh basados en esquerikia coli,
39:56decemos pues es una de las eh
39:58plataformas más importantes a nivel eh a
40:01nivel biotecnológico y también en la
40:03industria farmacéutica, ¿no? Yo creo que
40:05después de las todas las células de
40:07mamífero que se pueden utilizar, eh pues
40:10el segundo lugar en cuanto a prevalencia
40:12y productos que tiene el mercado eh es
40:15eh ese coli, ¿no? Y esto decíamos que
40:18pues tiene que ver por la el contexto
40:22histórico, pues porque fue pues era una
40:24plataforma pues mucho más sencilla y que
40:26pues fue con la que se permitió la
40:28producción de los primeros
40:30biofarmacéuticos recombinantes, pero
40:32actualmente también eh pues sigue
40:34estando vigente eh tanto para
40:37investigación como en la producción
40:38industrial de proteínas terapéuticas
40:42específicas.
40:44Entonces, recordemos que las bacterias
40:46son organismos procariotas eh que no
40:48contienen, o sea, que que carecen de
40:50organelos membranosos
40:52y que también pues su maquinaria eh
40:55celular pues es mucho más eh primitiva,
40:59podemos decirlo, con respecto a la
41:02maquinaria celular que está presente en
41:04células eucariotas.
41:06Eh, esto, por ejemplo, a nivel biológico
41:07eh implica que tanto la que la
41:09transcripción y la traducción están
41:11acopladas tanto espacial y
41:13temporalmente, ocurren prácticamente al
41:15mismo tiempo. No hay una
41:18compartamentalización
41:20eh intracelular compleja y pues que la
41:23pues no tiene una capacidad limitada o
41:26inexistente de realizar eh
41:28modificaciones posttraduccionales.
41:31Si bien hay algunos organismos en los
41:34que se ha reportado como sistemas de
41:37glicosilación o pseud glicosilación
41:40primitiva, pues Ecoli no eh no lo puede
41:43hacer.
41:44Eh, entonces eh principalmente en en
41:47esquerikia coli, la expresión de
41:49proteínas recombinantes se logra
41:51mediante la introducción de eh de
41:53plásmidos que van a contener eh el gen
41:56de interés bajo el control eh pues de
41:59diferentes promotores, ¿no?, que también
42:00estos pueden ser constitutivos, pueden
42:02ser inducibles.
42:07Y por ejemplo, aquí en cuanto a los
42:09inducibles, lo que más se utiliza es la
42:11regulación mediante el operón la
42:13utilizando IPTG. El hecho de que se
42:16pueda eh controlar el momento de la
42:18expresión de la proteína eh
42:20recombinante, pues es eh permite eh
42:24poder lograr un control eh temporal del
42:26proceso, ¿no? De eh eh de limitar el
42:29periodo en el que se va a producir eh la
42:31proteína, ¿no?
42:34Aquí pues también recordemos que
42:36depende, o sea, cómo se haga eh el
42:39plácido que se utilice, el número de
42:42copias que pueda almacenar el palmido
42:44junto con la eficiencia del sistema de
42:46traducción de las bacterias, pues se
42:48pueden eh alcanzar niveles muy elevados
42:51eh de expresión de proteína al grado de
42:53hasta h podríamos hablar en el orden de
42:56gramos por litro eh por litro de
42:58producto.
43:01En cuanto a las estrategias de expresión
43:04que se pueden utilizar en sistemas
43:06bacterianos, podríamos
43:09abordar diferentes estrategias
43:11dependiendo de la las características
43:13del producto. decíamos que la más común
43:15pues es expresar eh las proteínas en el
43:18bueno, obviamente que se expresen y que
43:20se acumulen eh en el citoplasma dentro
43:22de la célula frecuentemente eh en forma
43:26eh soluble o como cuerpos de eh de
43:29inclusión, que aquí recordemos eh los
43:33cuerpos de inclusión
43:36eh pues puede ser tanto una ventaja como
43:39una desventaja. Aquí en la tabla que se
43:41muestra en la diapositiva viene más bien
43:43indicada eh pues más que una desventaja
43:45como un reto. Eh, pero
43:50pues o sea, decíamos que al final
43:51podemos aprovechar esa ese agregado de
43:54proteínas para facilitar la
43:56purificación.
43:58Eh, otra estrategia es dirigir la
44:00proteína al espacio periplásmico. Eh,
44:03esto usualmente se hace mediante eh
44:05péptidos, señales eh que van a favorecer
44:08la forma en este espacio periflásmico,
44:10que es un ambiente mucho más reductor
44:13por perdón, promover la formación de los
44:16enlaces de sulfuro y en algunas
44:18proteínas esto puede eh mejorar el
44:21plegamiento.
44:25Podríamos también hablar de una
44:27estrategia de, o sea, que la proteína
44:31se excrete, se secrete al medio de
44:33cultivo.
44:35E coli no es un sistema
44:38que naturalmente sea eficiente para la
44:40secreción extracelular, sin embargo, si
44:43se han desarrollado estrategias para
44:46exportar proteínas al medio de cultivo,
44:49por ejemplo, ponerle algunas etiquetas
44:51relacionadas con eh con enterotoxinas.
44:56También pues se pueden emplear eh
44:59etiquetas de purificación, la más pues
45:01la más utilizada son las etiquetas de
45:04polistirina. aunque pues hay otras que
45:06facilitan la la purificación eh de la
45:09proteína y también hasta cierto punto
45:11pueden mejorar la solubilidad de estas.
45:13Nada más que eh recuerden en el caso
45:15aquí, o sea, no hay que perder de vista
45:17que la aplicación eh de la proteína
45:20recombinante que se va a producir eh
45:23pues es para administración pues
45:25terapéutica en humanos. Entonces, hay
45:27que contemplar si estas etiquetas no
45:30tienen un impacto en la seguridad, eh,
45:32calidad y eficacia del producto o
45:36establecer pues medidas que permitan,
45:38por ejemplo, eh pues su corte, ¿no?, su
45:41eh que se puedan excindir en etapas
45:44posteriores de purificación.
45:46Entonces, en cuanto a las ventajas e en
45:49en los sistemas bacterianos,
45:51principalmente en Ecoli, pues la
45:52velocidad de crecimiento es una de las
45:55más altas entre todos los sistemas eh
45:57biológicos que se pueden utilizar a
45:58nivel industrial. Eh, esto pues nos
46:01puede permitir generar ciclos de
46:03producción cortos y una alta rotación eh
46:06de los eh de los bioprocesos a
46:08diferencia de lo que ocurre con las
46:10células de mamífero, que pues son mucho
46:11más lentas.
46:13eh la densidad celular eh alcanzable en
46:16biorreactores pues es bastante alta, lo
46:18que al final pues se traduce en una en
46:21un volumen de producción también mucho
46:23más alto. Los costos del medio de
46:25cultivo eh son bastante bajos eh y
46:28simples y más si lo comparamos con
46:30sistemas eucariotas o sistemas de
46:31mamífero, ya que no requieren eh ni
46:34suero ni componentes complejos.
46:37La manipulación genética es sencilla y
46:40altamente eficiente. Existen muchas
46:42herramientas moleculares disponibles
46:45para eh introducir pues genes de interés
46:48a través de los plmidos, optimizar la
46:50expresión entre eh entre otras, ¿no? Eh,
46:54o sea, al final yo creo que todas las
46:56herramientas de biología molecular que
46:57están disponibles eh pues primero se
47:00prueban en en bacterias y en el colino.
47:04En cuanto al escalamiento, pues los
47:06procesos que utilizan bacterias pues son
47:08bastante robustos, están bien
47:10comprendidos, lo cual pues facilita su
47:12transferencia a a escala industrial, o
47:15sea, suelen ser bastante pues
47:17constantes, ¿no? Aguantar muchas eh la
47:19variación de muchas de muchas
47:20condiciones de cultivo.
47:26En cuanto las limitaciones o deseamos
47:29desventajas o retos, pues tenemos la
47:32ausencia de glicosilaciones
47:34y que eh pues el problema no es que Coli
47:37no pueda glicosilar, el problema es que
47:40eh pues para la industria farmacéutica
47:42pues muchas de las proteínas
47:43terapéuticas requieren esas
47:44glicosaciones. Entonces ya por esto eh
47:48pues ya está descartada esa plataforma
47:49biológica, ¿no? O se tendría que
47:51valorar, ¿no? También tenemos el caso eh
47:54decíamos de eh interleucinas o
47:56interferones que se pueden producir en
47:58ecoli que no están glicosiladas y que
48:00aún así pues tienen la actividad
48:01biológica. Al final es algo que se tiene
48:03pues se tiene que eh que definir.
48:07La otra desventaja pues es el
48:08plegamiento incorrecto eh de proteínas.
48:10Esto es un problema bastante frecuente,
48:13especialmente pues para la expresión de
48:15proteínas eucariotas, ¿no? O sea, que
48:16mientras más eh desconocida o lejana
48:19filogenéticamente sea la proteína con
48:21respecto a la bacteria, pues va a ser
48:23más difícil que la pueda eh expresar y
48:26esto pues conduce a la formación de los
48:28cuerpos de inclusión.
48:30E también pues tenemos la cuestión de el
48:33ambiente eh reductor. Eh por esto que
48:37pues si las proteínas requieren de
48:39muchos puentes de sulfuro y tal vez no
48:42quepan
48:43o no sea posible exportarlas al espacio
48:45periplásmico, pues aquí ya sería eh
48:50pues un eh pues no sería viable, ¿no?
48:56Aquí también pues la realidad, si bien
48:58mencionaba que se pueden utilizar
49:00diferentes estrategias para dirigir la
49:02acumulación de la proteína, pues la
49:04mayoría de las veces pues la más
49:06sencilla pues es la producción
49:07intracelular.
49:09Esto pues también eh va a implicar
49:13la lisis celular eh y esto en
49:16consecuencia incrementa la complejidad
49:19del procesamiento downstream. También
49:21tenemos la presencia de endotoxinas. Los
49:25lipopolisacáridos de la membrana eh
49:27deben de ser eliminados debido a que son
49:29eh pues agentes pirogénicos, es decir,
49:32que producen fiebre. Y esto pues es un
49:34de hecho la las agencias regulatorias eh
49:37han establecido eh niveles eh mínimos
49:40tolerables de la presencia de estos eh
49:42pirógenos, incluso en las en las en las
49:44farmacopeas. Eh, entonces pues es un
49:48contaminante ya muy bien identificado
49:50que pues no debería de estar presente.
49:54Y bueno, a pesar de sus limitaciones, eh
49:57los sistemas bacterianos pues se
49:58utilizan eh bastantemente bastante,
50:00perdón, ampliamente para la producción
50:03de de biofarmacéuticos.
50:05Deeamos eh pues van a ser muy adecuados
50:08para eh producir proteínas no
50:10glicoxiladas, algunos peptidos eh
50:13terapéuticos,
50:14proteínas de bajo peso molecular como la
50:17insulina, el hormona del crecimiento,
50:20interferones y eh otros factores de
50:23crecimiento.
50:27Y bien, con el objetivo de superar
50:29algunas de las limitaciones que presenta
50:31eh que presentan las bacterias y
50:33particularmente eh Ecoli para eh su uso
50:37en el en la producción de medicamentos
50:39eh biotecnológicos, se han desarrollado
50:42múltiples estrategias eh de ingeniería
50:44en este tipo en esta plataforma eh
50:46biológica. Eh, por ejemplo, se han
50:49diseñado cepas que sobreexpresan
50:51chaperonas eh para mejorar el
50:54plegamiento de de moléculas o proteínas
50:57complejas, ¿no? Lo cual podría evitar la
50:59formación de los cuerpos de inclusión.
51:02Eh, también se han generado eh cepas
51:05mutantes eh que tienen e un ambiente
51:09redox diferente y permiten por ende la
51:12formación de puentes de sulfuro en el
51:14citoplasma.
51:16Eh, también podríamos hablar eh sobre la
51:18optimización de eh de codones.
51:22Eh, es decir, que se adapta eh la
51:24secuencia genética que, o sea, que se va
51:26a introducir en el plásmido para mejorar
51:29eh la eficiencia de la traducción. es
51:30como si hablaran en otro idioma, pues
51:32los estamos a traducir del inglés al
51:34español o del español al inglés con el
51:36que se sienta más cómodo cómoda la
51:38bacteria, ¿no? Ah, también con respecto
51:40a la glicoingeniería, eh se han
51:42introducido rutas metabólicas que
51:44permiten la glicosilación, decíamos,
51:47ciertas glicosaciones en bacterias,
51:50aunque en realidad eh aún tiene
51:52bastantes limitantes para pues una
51:55aplicación clínica, ¿no?, para producir
51:57una proteína eh terapéutica, ¿no?
52:02se puede trabajar con el diseño de los
52:07de los promotores, por ejemplo, con el
52:08manejo de promotores híbridos para
52:10aumentar la eficiencia de la expresión,
52:13eh generar diferentes eh cepas eh por
52:16ejemplo de coli que pues resistan
52:18diferentes niveles de oxígeno o con
52:21tasas de crecimiento eh específicas
52:24eh para darle más eh robustez a las a
52:27las conducciones condiciones, perdón, a
52:30las condiciones de de cultivo. E también
52:34eh la integración, deseamos pues de
52:36proteínas de fusión, de diferentes eh
52:38diferentes etiquetas eh y e incluso eh
52:43el uso de ARNs de transferencia eh
52:45adicionales, pues para que sea para que
52:48no tengamos esta limitante de este eh
52:51sesgo de los codones, ¿no? que
52:54justamente la optimización de codones es
52:56porque los arenes ecoli
53:00no necesariamente va a tener la misma
53:01proporción de ARNs de transferencia que
53:04tiene, por ejemplo, una célula eucariota
53:06o una célula una célula humana, una
53:08célula de mamífero. Entonces, se pueden
53:10introducir esos ARN de transferencia,
53:12pues para que lea con mucha más
53:14facilidad eh secuencias humanas
53:18o secuencias eucariotas y por ende pues
53:21la producción sea la expresión sea más
53:23eficiente.
53:29Y bien, en esta tabla se listan algunos
53:32de los productos aprobados de
53:34medicamentos biotecnológicos aprobados
53:36que son producidas en en Ecoli. Aquí de
53:40nuevo, como podemos ver, los más
53:42representativos, pues son proteínas eh
53:45pues pequeñas, sin muchas modificaciones
53:48postraduccionales
53:49como la insulina eh o la hormona del
53:52crecimiento.
53:54También tenemos muchas e citosinas como
53:59interferones,
54:01interleucinas.
54:04Eh, y aquí lo que yo quisiera llamar su
54:07atención es eh, por ejemplo, tenemos
54:10aquí eh algunos productos que se marca
54:12que son eh anticuerpos. Aquí eh voy a
54:16hacer la aclaración que estos productos
54:18si ustedes van y los googlean, eh no son
54:21anticuerpos completos, son solamente
54:22fragmentos de anticuerpos. que esta
54:24también es una eh pues una ah un
54:28escenario eh pues bastante innovador,
54:30bastante interesante, que pues
54:32justamente te quita ese bloqueo, ¿no?,
54:33de que puedas producir eh proteínas en
54:37una plataforma eh pues mucho más
54:39económica.
54:40Em, aquí, obviamente, en condiciones en
54:42las que pues solamente eh se requiera
54:46ese fragmento de anticuerpo,
54:47generalmente la porción FAB, que es la
54:49que tiene la afinidad contra su ligando
54:52o su antígeno, pues que, o sea, como
54:54para anticuerpos para diagnóstico o que
54:57nada más queremos que neutralicen y no
54:59necesariamente desencadenen toda la
55:01respuesta inmune. Entonces, hablamos de
55:02un cachito del anticuerpo, si es lo
55:04suficientemente pequeño, no está en la
55:05porción que necesita ser glicosilada del
55:07anticuerpo, pues se puede producir en en
55:10sistemas bacterianos.
55:12Eh, también aquí eh lo que yo quisiera
55:15eh resaltar es eh la disponibilidad de
55:18productos, por ejemplo, de proteínas
55:19peguiladas
55:21eh y por ejemplo eh fármacos de segunda,
55:24tercera generación, eh análogos, por
55:26ejemplo, de insulina. Eh, y esto pues
55:29también tiene que ver con el contexto
55:30histórico eh de el uso de esquerikia
55:33coli, ¿no?, para la expresión de
55:34proteínas heterólogas. eh pues como ya
55:37tienen mucho tiempo y los primeros
55:38biofarmacéuticos se aprobaron en los
55:4080s, pues ya esto ha permitido la
55:42aparición tanto decamos de mejoras eh
55:45mediante ingeniería de proteínas eh así
55:48como también eh decíamos variantes
55:50peguiladas y
55:52e
55:54muchos de los productos biosimilares o
55:57biocomparables que ya están aprobados en
55:59el mercado, pues los primeros pues se
56:01aprobaron justamente en Ecoli.
56:06Bueno, ahora vamos a hablar un poquito
56:08de las levaduras. Estas ya saben que, o
56:10sea, yo siempre he dicho que las
56:11levaduras están como en un punto eh
56:14intermedio entre las plataformas
56:15biológicas eh ya por ya que tienen eh
56:19pues estas eh ventajas en cuanto a
56:21robustez, simplicidad de cultivo eh que
56:24tienen las células eh procariotas, pero
56:27al ser un organismo eucariotas
56:28eucariota, perdón, puede eh realizar
56:31modificaciones eh postraduccionales y
56:34sintetizar eh proteínas eh complejas.
56:37Por ende, pues como dice aquí, combina
56:39la facilidad de cultivo y bajo costo en
56:42eh y bajo costo de los eh con
56:45capacidades de procesamiento eh
56:48postraduccional.
56:50Eh,
56:52en particular eh deseamos que la
56:55plataforma de levaduras que más se
56:56utiliza es acarumice cerebicie y pique
57:00eh pique pastores, al menos para la
57:02producción de proteínas recombinantes.
57:05Las levaduras, ya saben, pues son
57:07microorganismos eucariotas unicelulares
57:10que poseen organelos definidos, tienen
57:12un retículo endoplásmico, tienen aparato
57:14de Golgi y esto pues por ende les va a
57:16permitir, deseamos realizar un
57:19plegamiento de proteínas adecuado,
57:22formar enlaces eh disulfuro, ejecutar eh
57:26modificaciones postpraduccionales
57:29eh y a diferencia de las de las
57:32bacterias, las levaduras pueden secretar
57:35eh proteínas al medio extracelular con
57:38pues bastante preferencia. De hecho,
57:39algo que distingue a los hongos, tanto
57:41levaduras como hongos filamentosos, es
57:44que les encanta secretar cosas en el
57:45medio en el medio de cultivo o al
57:47exterior. Y esto pues se puede utilizar
57:50para simplificar eh pues el
57:52procesamiento Downsen, ¿no? Eh, además
57:55pues presentan ventajas importantes para
57:57muchas herramientas de ingeniería
57:58genética eh tanto sacaromises,
58:02especialmente sacaromises, pero también
58:04eh piquia, pues sus genomas están bien
58:07caracterizados. eh son sistemas eh
58:10plataformas de expresión eh bastante
58:11robustas, son bastante eh aguantadoras a
58:14diferentes eh variables de eh de
58:18cultivo. Tienen también una amplia
58:20disponibilidad de vectores y promotores
58:22que se pueden utilizar pues para eh
58:24producir mejorar los rendimientos de
58:26producción de de proteínas
58:28recombinantes.
58:30Por lo cual pues si se han adoptado
58:31tanto en la industria farmacéutica como
58:34también para la producción de enzimas y
58:37otros bioproductos a gran escala.
58:41Em, particularmente sacaromis serie bici
58:44decamos es uno de los organismos modelos
58:47más estudiados en la biología molecular
58:49y en la biotecnología junto con Ecoli.
58:52Por estas ventajas que ya hemos
58:54mencionado.
58:55uso en la industria farmacéutica está
58:59ampliamente validado y pues podríamos
59:01hablar de siglos, milenios de que se
59:02utiliza este microorganismo tanto para
59:04la producción eh pues de pan, cerveza,
59:08vino eh y obviamente pues actualmente ya
59:11con herramientas de biología molecular
59:13pues para otro tipo de productos.
59:15Entonces, el hecho de que ya tengamos
59:17mucha experiencia con este eh
59:20microorganismo
59:22eh
59:24pues es también es una ventaja
59:25importante desde el punto de vista eh
59:27regulatorio.
59:29Esta levadura tiene eh un metabolismo
59:32fermentativo eh bien caracterizado, ya
59:34también hay diferentes cepas que se
59:36pueden utilizar dependiendo de las
59:37características que queramos. es
59:40considerado un organismo gras, es decir,
59:42generalmente reconocido como seguro.
59:44Entonces, aquí, por ejemplo, decíamos la
59:46presencia de potenciales contaminantes
59:48eh pues se reduce bastante.
59:51Eh, y pues eh posee múltiples
59:54herramientas genéticas disponibles para
59:56su modificación.
59:57Eh, yo creo que una de las principales
1:00:00ventajas de sacaromises cerebici pues es
1:00:03su historial de uso seguro, deseamos, en
1:00:06alimentos y en la biotecnología.
1:00:09Además de que permite, [carraspeo]
1:00:11perdón, la secreción eficiente de
1:00:12proteínas, presenta robusteza en
1:00:14condiciones de cultivo y es adecuada
1:00:17para la producción eh a gran escala. Ha
1:00:20sido utilizada ampliamente en la
1:00:22producción de vacunas recombinantes, eh
1:00:24como ya decíamos en el caso de la
1:00:26hepatitis eh vacunas contra la hepatitis
1:00:29B. Ah, sin embargo, pues no hay ninguna
1:00:33plataforma que sea perfecta. eh
1:00:35sacaromice cerebici eh su principal
1:00:37limitante es eh los patrones de
1:00:40glicosilación. Esta levadura tiende a
1:00:43producir glicanos del tipo de semos
1:00:45hipermanocilados
1:00:47que pues difieren significativamente de
1:00:50las glicos humanas, lo que eh pues va a
1:00:53generar eh productos eh mucho más
1:00:56inmunogénicos que por ejemplo en el caso
1:00:58de una vacuna, pues la inmunogenicidad
1:01:01pues sería un atributo de eficacia más
1:01:03que de seguridad. Entonces, también la
1:01:05justificación de por qué se utilizan
1:01:06para la producción de vacunas. Eh,
1:01:09también estas diferencias en glicos pues
1:01:11generan proteínas que se eliminan eh
1:01:14rápidamente del organismo
1:01:17y eh en algunos casos la productividad
1:01:20puede ser inferior a las de otros
1:01:22sistemas como pique piquia pastores.
1:01:26Esta esta levadura piquia con el paso de
1:01:30los o sea los últimos años se ha
1:01:33consolidado, perdón, como una plataforma
1:01:36de hongos bastante bastante importante
1:01:39para la producción de proteínas eh
1:01:41proteínas recominantes, o sea, como que
1:01:42ahorita hay un boom en investigación y
1:01:44desarrollo con eh utilizando piquia. Eh,
1:01:48la principal característica de esta
1:01:50levadura es su capacidad para crecer a
1:01:52altas densidades celulares en cultivos
1:01:55inducidos por metanol, particularmente
1:01:58utilizando, bueno, haciendo uso del
1:02:00promotor AOX1 o la alcohol oxidaza 1,
1:02:04que este es uno de los promotores más
1:02:06fuertes conocidos en las plataformas eh
1:02:09eucariotes. Entonces, aquí esta alta
1:02:12productividad, ¿no?
1:02:15Entre sus principales ventajas destacan,
1:02:18decíamos la alta productividad. De
1:02:20hecho, aquí viene en la tabla en Piquia,
1:02:22pues hablamos de hasta 520, o sea, ya
1:02:25estamos hablando en el orden de, perdón,
1:02:28si vemos la albumina humana en el orden
1:02:30de gramos por litro,
1:02:33eh, y que puede alcanzar concentraciones
1:02:35de proteína recombinante superiores a
1:02:37las de sacaromises, como se puede ver
1:02:39aquí en la tabla.
1:02:41eh puede eh maximizar la productividad
1:02:44eh o la alta densidad, o sea, el
1:02:48crecimiento, o sea, puede crecer a alta
1:02:50densidad celular, lo que permite eh
1:02:53mejorar muchísimo la productiv el
1:02:55volumen de reactivo, ¿no? De el volumen
1:02:59de productividad en el biorreactor,
1:03:01perdón.
1:03:02Eh, además, pues tiene una tendencia
1:03:04todavía mayor a o más eficiente
1:03:09a secretar a las proteínas al medio de
1:03:11cultivo. De nuevo, pues facilita eh
1:03:13mejor la producción la producción de eh
1:03:17del producto.
1:03:19Y en cuanto a las glicosaciones, aunque
1:03:23aún
1:03:24piqueia produce glicosilaciones
1:03:26diferentes a las humanas, el patrón de
1:03:28glicosilación es más controlable que que
1:03:32en sacaromises. Entonces, eh pues
1:03:35tendría esta tendencia a producir
1:03:37proteínas menos inmunogénicas.
1:03:40Eh se considera que tiene flexibilidad
1:03:42metabólica, es decir, que puede utilizar
1:03:44diferentes fuentes de carbono como el
1:03:46glicerol o el metanol. eh utilizando
1:03:49también decemos esta del alcohol y
1:03:50oxidas pues como una fuente de carbono,
1:03:52¿no? Eh, algunas de las desventajas del
1:03:55uso de piquia es que eh pues justamente
1:03:58el uso de metanol como un inductor para
1:04:00la expresión de proteínas recombinantes
1:04:03pues introduce una cuestión operativa y
1:04:06de seguridad porque pues el metanol para
1:04:08empezar es inflamable y además pues y
1:04:11por ende requiere un control estricto en
1:04:14los biorreactores, ¿no? o sea, por este
1:04:16riesgo de inflamabilidad. Eh, y pues
1:04:19también que pues el metanol debe de
1:04:20eliminarse
1:04:22en etapas de purificación posteriores.
1:04:25Eh, y bueno, aunque la glicosilación es
1:04:28menos problemática eh que en
1:04:29sacaromises, sigue sin ser completamente
1:04:32humana, lo que va a limitar su uso en
1:04:35proteínas que vayan a ser eh muy
1:04:37sensibles a estas modificaciones
1:04:39postraduccionales en términos pues más
1:04:41que de eh seguridad, pues más bien de
1:04:43eficacia.
1:04:45Ah, eh también el desarrollo de cepas
1:04:48recombinantes eh en piquia puede ser más
1:04:51complejo eh en comparación con otros
1:04:55sistemas eh bacterianos. Pero bueno, en
1:04:57general pues ya vimos en el en la
1:04:59gráfica de al inicio del video eh pues
1:05:02que también tanto Piquea como
1:05:03sacarumises pues se han estado
1:05:05utilizando
1:05:06eh mucho en la industria en la industria
1:05:09farmacéutica.
1:05:11Eh,
1:05:13entonces, hm,
1:05:17pues
1:05:18aquí eh en la tabla, por ejemplo, eh se
1:05:21muestran eh algunas eh proteínas. Aquí
1:05:24dice que están bajo desarrollo. Ahorita
1:05:26les voy a mostrar una donde ya eh se
1:05:29muestran productos que ya están
1:05:30aprobados. Eh, pero aquí pues en
1:05:33términos eh, o sea, puse esta tabla eh
1:05:35para resaltar eh la productividad en
1:05:38términos pues de rendimiento de proteína
1:05:41eh y pues que la la flexibilidad que
1:05:43tiene, ¿no?, de producir eh proteínas de
1:05:46acumulación intracelular, tanto como que
1:05:48se secret en el medio de cultivo. Y
1:05:50aquí, si se fijan, el tipo de productos
1:05:54o de proteínas recombinantes humanas que
1:05:56se están produciendo, como la
1:05:57hemoglobina, la antitrombina, albúmina y
1:06:01anticuerpos, eh pues son muchísimo más
1:06:03complejos que las que se podrían eh
1:06:06generar con eh sistemas bacterianos.
1:06:12Y bien, entonces eh deseamos aquí en
1:06:14esta tabla se muestran eh algunos eh
1:06:17productos que se han generado en
1:06:19levaduras que aquí pues prácticamente
1:06:22también por el tiempo [carraspeo] pues
1:06:24de investigación o de pues sí que
1:06:26tenemos ya trabajando con sacaromises,
1:06:28pues esa es la más prevalente, pero se
1:06:30fijan ya hay un par de productos eh
1:06:34producidos, valga la redundancia, en
1:06:37piquia, que ya también están aprobados
1:06:38para para uso eh terapéutico.
1:06:42Eh aquí pues tenemos desde factores de
1:06:47coagulación, albúmina, todas estas
1:06:50moléculas que tienen que ver con eh la
1:06:54regular la hemostasia, por ejemplo, la
1:06:55irudina también lo platicábamos en la
1:06:57unidad pasada, que esta proteína es una
1:06:59proteína anticoagulante
1:07:01eh que proviene de la sanguijuela, que
1:07:04se produce eh en sacaromises ahora de
1:07:07manera recombinante.
1:07:09También algunas hormonas, decíamos como
1:07:10insulina en sus diferentes variantes o
1:07:13análogos, hormonal crecimiento,
1:07:17los análogos de GLP1 como eh pues ahora
1:07:21sí que eh la semaglutida, o sea, esta es
1:07:24la semaglutida,
1:07:26eh los pic, unaro, bueno, no mucharo,
1:07:29no, eh el pico, hegobi, pues estas son
1:07:32producidas eh, o sea, semaglutida
1:07:34producida en sacaromises y eh también
1:07:37decíamos que en el área de las la
1:07:39producción de vacunas, particularmente
1:07:41de vacunas de subunidades, se utilizan
1:07:43mucho levaduras, como decíamos, la más
1:07:47representativa es el vacuna contra la
1:07:50hepatitis B y eh también en los últimos
1:07:53años hay una vacuna que de hecho se
1:07:55distribuye en el sistema de salud
1:07:58mexicano eh para con la vacuna contra el
1:08:02virus del papiloma humano que esta eh
1:08:04pues es producida en en sacaromises.is.
1:08:11Y bueno, siguiendo esta línea eh del uso
1:08:13de eh de los hongos para la producción
1:08:16eh pues de proteínas recombinantes, eh
1:08:19pues principalmente el enfoque es en
1:08:21levaduras por esta versatilidad eh pues
1:08:23que tienen pues de manejarse en un
1:08:24biorreactor eh al ser organismos
1:08:27unicelulares, pero eh pues también los
1:08:29hongos filamentos se pueden eh se pueden
1:08:31utilizar ah en la biotecnología
1:08:33industrial.
1:08:35Eh, particularmente los hongos
1:08:37filamentos como eh pues diferentes e
1:08:43especies del género aspergilus, se
1:08:46utilizan para la producción de enzimas
1:08:49eh y metabolitos y en menor medida en
1:08:52biofármacos, pero ya también hay hay
1:08:55productos eh por ejemplo este lisosimas,
1:09:00lactoferrinas,
1:09:02insulinas, interleucinas o
1:09:04inmunoglobulinas. inas que también se eh
1:09:05se producen en hongos lamentos que pues
1:09:08tienen una potencial aplicación eh en en
1:09:11la medicina.
1:09:13Eh, los filamentos
1:09:15destacan particularmente eh por su
1:09:17extraordinaria capacidad de secreción de
1:09:19proteínas eh al medio de cultivo todavía
1:09:22más que las levaduras, lo que las
1:09:24convierte eh pues en sistemas muy
1:09:26atractivos pues para la producción de
1:09:28biomoléculas, ¿no? Eh, decíamos que eh
1:09:32los géneros más utilizados pues son
1:09:34aspergilus, pero pues también se
1:09:36utilizan eh del género eh tricoderma eh
1:09:39y penicilum.
1:09:41La principal ventaja del uso de hongos
1:09:43filamentosos es la capacidad masiva de
1:09:46estas proteínas, es decir, que se pueden
1:09:49eh o sea, obtener muy buenos
1:09:51rendimientos de proteína eh de proteína
1:09:54extracelular. Además, eh pueden crecer
1:09:56en medios eh relativamente económicos,
1:10:00incluyendo, por ejemplo, residuos
1:10:01agroindustriales, eh lo cual pues puede
1:10:03reducir los costos eh de operación, tal
1:10:06vez no necesariamente para la industria
1:10:07farmacéutica, pero para otro tipo de
1:10:08industrias si sean eh sea esto
1:10:10relevante. Obviamente, pues al ser
1:10:13eucariotas, pues pueden realizar
1:10:14modificaciones postraduccionales
1:10:16como eh puentes de sulfuro y
1:10:18glicosilaciones.
1:10:21Algunas de estas especies son
1:10:23clasificadas como organismos gras, lo
1:10:26que facilita su uso en aplicaciones en
1:10:28la industria alimentaria y farmacéutica.
1:10:30No digas así de aspergilus.
1:10:32E sin embargo, pues las ventajas,
1:10:36perdón, las desventajas
1:10:38pues son los problemas de las glicos
1:10:41diferentes a las humanas, igual que con
1:10:42las eh levaduras. Además, eh las los
1:10:48hongos filamentos pues secretan, tienen
1:10:51facilidad de secreción de muchas
1:10:53proteínas recominantes porque tienden a
1:10:55secretar muchas eh proteas, que van a
1:10:59ser proteas que pueden degradar a la
1:11:01proteína eh recombinante, reduciendo por
1:11:03ende el rendimiento del proceso. Y esto
1:11:06pues es parte de sus de la propia
1:11:08biología y los mecanismos de defensa de
1:11:10los hongos eh filamentos que tienden
1:11:12mucho a eh pues a verse a condiciones o
1:11:15como de reto biológico mucho más intenso
1:11:17que que otros organismos.
1:11:20Eh, entonces, pues podemos ver aquí en
1:11:22la tabla que los hongos filamentos eh
1:11:25pues tienen más prevalencia a la
1:11:27producción, por ejemplo, de enzimas más
1:11:29que en biofarmacéuticos eh
1:11:31tradicionales, pero pues aún así eh se
1:11:34utilizan, o sea, está este potencial, o
1:11:37sea, quien diga que eh pues se puedan
1:11:40proponer otro tipo de productos en estas
1:11:42plataformas pues más eh fuera eh fuera
1:11:48de lo tradicional, ¿no?
1:11:53Y bueno, las plataformas de expresión
1:11:55basadas en plantas eh han emergido en
1:11:57los últimos años como una alternativa eh
1:12:00innovadora dentro del panorama eh
1:12:03biotecnológico,
1:12:04principalmente eh bajo el concepto de el
1:12:07molecular farming o la agricultura
1:12:10molecular. Este concepto de molecular
1:12:13farming eh es un proceso eh que permite
1:12:16modificar, o sea, que se basa en la
1:12:18modificación genética eh de plantas para
1:12:22que pues produzcan proteínas de alto
1:12:24valor como medicamentos eh y vacunas,
1:12:27donde pues se combina la ingeniería
1:12:29genética eh y la biotecnología para
1:12:33generar como esto que le llaman
1:12:35biofábricas eh vivas, donde las plantas
1:12:38pueden sintetizar eh compuestos médicos
1:12:40de manera segura. eh y más económica,
1:12:42¿no? Y esto pues dándole eh el enfoque
1:12:46eh de planta completa.
1:12:49Eh las plataformas vegetales permiten la
1:12:52producción de proteínas recombinantes,
1:12:55vacunas, anticuerpos y metabolitos de
1:12:58alto valor, utilizándose ambos pues
1:13:00sistemas vegetales.
1:13:02Pero es importante resaltar que se
1:13:05pueden con las plataformas vegetales
1:13:08se han utilizado dos abordajes eh pues
1:13:12muy diferentes, ¿no? Que están
1:13:14claramente diferenciados desde el punto
1:13:16de vista biotecnológico.
1:13:18Uno es la expresión en planta completa y
1:13:23la expresión en cultivos celulares
1:13:25vegetales, o sea, invitro utilizando eh
1:13:28biorreactores.
1:13:30En ambos pues se comparte la maquinaria
1:13:33eucariota vegetal, o sea, pues al final
1:13:36ambas siguen siendo plataformas
1:13:38vegetales, pero sus sus implicaciones en
1:13:42cuanto a control, escalabilidad, costos
1:13:45y regulación van a ser eh diferentes.
1:13:51Las plantas como un sistema eucariota,
1:13:54pues igual tienen esta capacidad de un
1:13:57plegamiento de proteínas adecuado,
1:14:00pueden formar puentes de sulfura y otras
1:14:03modificaciones postraduccionales.
1:14:06Y además, particularmente en las
1:14:08plantas, dada la complejidad que tiene
1:14:11una célula vegetal, pues permite esta
1:14:14compartamentalización
1:14:16subcelular en vacuolas, cloroplastos o
1:14:19en el retículo endoplásmico, ¿no?, que e
1:14:22también pues en hasta cierto punto eh
1:14:25desde la perspectiva eh del bioproceso,
1:14:28pues también podría facilitar eh la
1:14:29purificación o el aislamiento de
1:14:31proteínas terapéuticas.
1:14:33Además, eh presentan eh ventajas como eh
1:14:37pues un bajo riesgo de contaminación con
1:14:39patógenos humanos. Ya habíamos dicho que
1:14:41eh los virus o bacterias que suelen
1:14:43atacar a especies vegetales, pues no
1:14:46tienen la maquinaria para eh afectar o
1:14:48generar enfermedad eh en humanos.
1:14:52eh se puede generar una escalabilidad eh
1:14:56potencialmente eh masiva y esto eh si le
1:15:00damos o si nos enfocamos más bien en
1:15:02este abordaje de el manejo de la planta
1:15:05completa, ¿no? pues al final eh toda la
1:15:07industria eh agrícola pues permite la
1:15:10producción de toneladas y toneladas eh
1:15:13de material eh vegetal, obviamente, pues
1:15:15principalmente para la producción de
1:15:16alimentos, pero aquí en este punto pues
1:15:19porque eh una vez que ya se tiene una
1:15:21planta genéticamente modificada, pues no
1:15:23llevarla a esos eh a esos niveles de
1:15:25producción con sistemas mucho más
1:15:27baratos que no necesariamente tengan que
1:15:29ser en condiciones eh estériles, ¿no?
1:15:34Y esto pues también podría
1:15:37reducir los costos, los costos de
1:15:39producción,
1:15:41lo cual pues los hace una plataforma
1:15:43pues bastante atractiva para la
1:15:45producción de de muchas de muchas
1:15:48biomoléculas.
1:15:50Eh, sin embargo, pues como vemos eh o
1:15:52bueno, si recordamos esta esta gráfica
1:15:54de pastel, pues no son todavía lo
1:15:57suficientemente relevantes en la eh en
1:15:59la industria farmacéutica.
1:16:03Eh, entonces el abordaje eh, o sea, la
1:16:07la expresión de eh proteínas
1:16:09recominantes en planta completa eh
1:16:12implica el uso eh del organismo vegetal
1:16:15intacto como un sistema de expresión.
1:16:18Eh, también de aquí valía la pena eh
1:16:20señalar otros dos eh, ¿cómo se llaman? E
1:16:24dos enfoques. Uno es una tanto una
1:16:27expresión estable como una expresión
1:16:30transitoria.
1:16:31Eh, en la expresión estable, el gen de
1:16:34interés se integra en el genoma de la
1:16:36planta, por lo tanto, eh la proteína se
1:16:39va a expresar de forma continua en
1:16:41tejidos eh específicos. Este eh bueno,
1:16:45dependiendo de la construcción aquí pues
1:16:46podríamos también hablar de el uso de eh
1:16:50de agrobacterium tumefasins y y el
1:16:52plasmido TI, pues para generar este tipo
1:16:54de eh plantas genéticamente modificadas.
1:16:58Sin embargo, pues también se puede
1:16:59utilizar para la expresión transitoria.
1:17:02Entonces, a esta última, la expresión
1:17:04transitoria, en este caso, pues se
1:17:05introduce el gen mediante eh vectores
1:17:09eh utilizando sí, ag puede ser
1:17:12agrobacterium, pero sin la información
1:17:14que implica la integración al genoma o
1:17:17también con el uso de vectores eh
1:17:19virales vegetales, logrando una
1:17:22expresión rápida pero temporal de una
1:17:25proteína recombinante.
1:17:30Aquí, obviamente esto viene con ventajas
1:17:32y desventajas. En cuanto al sistema de
1:17:34planta completa, hacemos uno de los
1:17:36mayores atractivos es esta escabilidad a
1:17:39nivel eh agrícola, ¿no? Eh porque se
1:17:42pueden eh producir grandes cantidades eh
1:17:45de proteína recominante cultivando
1:17:47plantas en el campo o en un invernadero.
1:17:50Eh se reducen mucho los costos de
1:17:53producción, ya que no se requieren eh
1:17:55biorreactores y se utilizan eh pues
1:17:57recursos agrícolas tradicionales eh
1:18:00convencionales.
1:18:02Además, se menciona que la acumulación
1:18:04de proteínas en diferentes órganos
1:18:06vegetales, por ejemplo, en vacuolas,
1:18:09puede facilitar su estabilidad. O, por
1:18:12ejemplo, si se si se expresa o se
1:18:14acumula una proteína en semillas, pues
1:18:17la colecta y el almacenamiento eh de
1:18:20esta proteína previo a la purificación,
1:18:21pues puede ser mucho más sencillo.
1:18:24Eh, sin embargo, el principal desafío de
1:18:26este sistema de planta completa está en
1:18:29la variabilidad biológica.
1:18:32Eh, por ejemplo, eh, factores
1:18:34ambientales como la temperatura, la luz,
1:18:37los niveles de nutrientes, eh estrés,
1:18:40biótico o abiótico, eh pues van a
1:18:42expresar, perdón, a alterar la expresión
1:18:45del transgeni, lo cual pues puede
1:18:48generar mucha variabilidad entre lotes,
1:18:51eh dificultad en la estandarización y
1:18:53por ende eh retos regulatorios. Al final
1:18:56pues esto se traduce a bajos estándares
1:18:59de calidad, ¿no? Algo que pues para la
1:19:01industria farmacéutica
1:19:03pues es algo eh pues inconcebible,
1:19:06podríamos decirlo, ¿no? O sea, es muy
1:19:07difícil que cumpla con los
1:19:09requerimientos regulatorios.
1:19:12Otro eh otro punto importante es el
1:19:14procesamiento downstream. eh dado que la
1:19:19extracción de proteínas a partir de
1:19:20tejidos vegetales es bastante compleja y
1:19:23obviamente también va a depender pues de
1:19:25el órgano de la planta, de qué planta
1:19:26estemos hablando, pero deseamos pues que
1:19:29hay eh muchos compuestos que pueden
1:19:31interferir en la purificación como eh la
1:19:34clorofila, algunos compuestos fenólicos,
1:19:37eh alcaloides, aceites, polisacáridos,
1:19:41eh que luego puede ser más eh difícil la
1:19:44purificación.
1:19:46Ah, y bueno, otro punto importante eh, y
1:19:48eso también es tanto para eh, o sea, en
1:19:51general para los sistemas vegetales son
1:19:54las glicosaciones. Eh, también aquí la
1:19:57glicosilación vegetal difiere mucho de
1:19:59la humana, lo cual por ende puede
1:20:01afectar eh la funcionalidad de las
1:20:03proteínas terapéuticas.
1:20:06Eh,
1:20:08sin embargo, pues sí hay eh sí se han
1:20:11estado generando pues muchas estrategias
1:20:15eh utilizando los sistemas eh vegetales
1:20:17o la el sistema de planta completa, por
1:20:21ejemplo, para la producción eh de
1:20:23proteínas recombinantes. Eh, por
1:20:25ejemplo, si se utilizan plantas
1:20:26comestibles, pues hablamos de este de
1:20:28este tema de vacunas comestibles que
1:20:31estuvo eh
1:20:33estuvo muy [carraspeo] de moda hace unos
1:20:35años.
1:20:36eh lo cual pues facilita también la
1:20:39distribución eh de vacunas eh en
1:20:42localidades
1:20:43eh pues de difícil acceso, ¿no?, donde
1:20:46eh por ejemplo llevar una vacuna que
1:20:48debe estar refrigerada o congelada es
1:20:50mucho más difícil a transportar y
1:20:52administrar pues un un vegetal
1:20:55comestible, ¿no?
1:20:57Eh,
1:20:59luego hablamos también de la expresión
1:21:02en cultivos vegetales, o sea, nivel
1:21:05invitro. Eh, en este enfoque se utilizan
1:21:09eh células en suspensión,
1:21:12callos o raíces modificadas
1:21:14genéticamente que van a ser eh aquí sí
1:21:16cultivadas ya en condiciones más
1:21:18controladas dentro de eh biorreactores.
1:21:22Esto eh pues la ventaja que da este esta
1:21:25plataforma pues es el alto nivel de
1:21:27control del proceso, donde vamos a tener
1:21:30pues condiciones eh ambientales de pH,
1:21:33temperatura, oxígeno eh altamente
1:21:35controlada y por ende una mejor
1:21:38reproducibilidad entre los entre los
1:21:40lotes y por ende un mejor cumplimiento
1:21:43de la de la normativa eh regulatoria o
1:21:46de las buenas prácticas de manufactura.
1:21:49Eh, a diferencia del sistema de planta
1:21:52completa, los cultivos celulares pues
1:21:54permiten un entorno eh cerrado eh lo que
1:21:57reduce riesgos de contaminación y
1:21:59facilita la eh estandarización.
1:22:03Eh, además, pues aquí en esta en esta
1:22:05plataforma se pueden diseñar procesos
1:22:07donde la proteína se secrete eh al medio
1:22:09de cultivo, simplificando, como ya hemos
1:22:11mencionado, el procesamiento el
1:22:13procesamiento Down en las etapas de
1:22:15purificación posteriores.
1:22:17Eh, aquí las limitantes o las
1:22:20desventajas que se presentan en los
1:22:22cultivos invitro vegetales eh es el
1:22:27crecimiento más lento. aquí pues crecen
1:22:30mucho más lento que los microorganismos,
1:22:32ya sean bacterias o levaduras. también a
1:22:35nivel de biomasa que se puede alcanzar
1:22:37la productividad en muchos casos es
1:22:40menor y pueden presentarse mucha
1:22:42sensibilidad a eh a condiciones de
1:22:44cultivo. Además eh
1:22:48aquí e los medios de cultivo eh para
1:22:54los cultivos sin vitrales eh pues son
1:22:56mucho más son más caros y más complejos
1:22:59que en los que se utilizarían para
1:23:01levaduras o para o para bacterias. Eh, y
1:23:04principalmente eh también pues para
1:23:06dependiendo de el tipo de células eh
1:23:09como decía, se pueden utilizar callos,
1:23:11que estas son, por ejemplo, son células
1:23:13no diferenciadas vegetales. Eh, para
1:23:17llegar a este punto, pues se necesita
1:23:19suplementar los medios con eh con
1:23:22hormonas eh vegetales que también en
1:23:26muchos casos estos van a ser sensibles,
1:23:28por ejemplo, a la luz solar, al
1:23:30calentamiento. Entonces, también en
1:23:31cuanto al control y el manejo de la
1:23:33esterilidad y la estabilidad de estos
1:23:35medios de cultivo, pues es es eh son más
1:23:38delicados y por ende pues también se
1:23:39utilizan son más caros, ¿no? E además
1:23:44las células vegetales pues pueden tener
1:23:47cierta sensibilidad a lo que le llaman
1:23:49el cisallamiento del estrés mecánico y a
1:23:52la eh
1:23:55a los niveles eh de oxígeno eh
1:23:57presentes.
1:23:59Sin embargo, bueno, los costos suelen
1:24:02ser menores que en células de mamífero,
1:24:04aunque pues mayores que en los que sería
1:24:07la producción en campo.
1:24:10Entonces, los sistemas vegetales a nivel
1:24:12biotecnológico, pues se utilizan tanto
1:24:14para la producción de proteínas
1:24:16recombinantes, de metabolitos
1:24:17secundarios y también pues si se han si
1:24:21se han utilizado para la producción de
1:24:23biofármacos, como ya les mencionaba,
1:24:25pues hay también productos aprobados en
1:24:27células eh de cebolla, de cebolla,
1:24:29perdón, de zanahoria eh que se producen,
1:24:32o sea, que que ya están aprobadas para
1:24:34su uso en la medicina.
1:24:36Eh,
1:24:38aquí pues también hay que tomar en
1:24:40cuenta eh que a nivel de o desde una
1:24:44perspectiva de ingeniería,
1:24:46el irse más sobre un sistema eh vegetal
1:24:52versus otro o por ejemplo si va a ser
1:24:54planta completa o a nivel invitro, pues
1:24:57es el nivel eh de control requerido para
1:24:59el cultivo contra eh el costo.
1:25:04y pues también la reproducibilidad, el
1:25:07control del proceso. Sí. Eh eh sí
1:25:11podríamos decir que a nivel eh
1:25:13regulatorio o al menos para la industria
1:25:15farmacéutica, los sistemas eh los
1:25:17cultivos celulares vegetales eh invitro
1:25:21o en biorreactores son más cercanos a
1:25:23los estándares eh farmacéuticos
1:25:25tradicionales.
1:25:28Y bueno, también en ambos sistemas
1:25:30tenemos esta desventaja de las
1:25:33diferentes las glicosilaciones
1:25:34diferentes que en este caso las células
1:25:37vegetales generan residuos como gilosa
1:25:41oosa en posiciones específicas que pues
1:25:44no van a estar presentes en humanos y
1:25:47eso generalmente se ve asociado en
1:25:50proteínas eh inmunogénicas que claro
1:25:53también se también se pueden hacer eh
1:25:55modificaciones en ingeniería genética.
1:25:58pues para que las glicosilaciones sean
1:26:01más parecidas a las humanas, pero pues
1:26:02nunca se van a parecer
1:26:05o asemejar lo suficiente como lo haría
1:26:07una célula una célula de mamífero o una
1:26:10célula humana.
1:26:15Y bien, en esta en la tabla que está a
1:26:18en la posición derecha eh se muestran e
1:26:21algunas estrategias de transferencia o
1:26:25de transfección de modificación genética
1:26:28en sistemas eh vegetales.
1:26:33Aquí lo que les comentaba es que la
1:26:36transferencia de genes mediadas por el
1:26:39plasmido TI de Agrobaacterium se
1:26:41utilizan se utilizan mucho eh
1:26:45especialmente cuando se quieren integrar
1:26:47eh proteínas, perdón, genes al genoma de
1:26:49la célula vegetal. Sin embargo, también
1:26:52mencionábamos que se puede hacer la
1:26:54expresión eh transitoria.
1:26:56En estos casos, el gen eh para la
1:26:58expresión transitoria, el gen de interés
1:27:00se introduce en células
1:27:03vegetales, obviamente sin integrarse al
1:27:05genoma, permitiendo una expresión rápida
1:27:07y temporal. Esto, o sea, para esto se
1:27:11puede eh hacer uso de eh agrobacterium o
1:27:14lo que le se le conoce como
1:27:16agroinfiltración
1:27:17o el uso de vectores virales como el
1:27:20virus del mosaico del tabaco
1:27:23para generar una producción rápida de la
1:27:24proteína recombinante en el orden de
1:27:27días a semanas con muy buenos niveles de
1:27:30expresión.
1:27:31Sin embargo, al ser una expresión
1:27:33temporal, existe la necesidad de repetir
1:27:35el proceso para cada lote, lo cual, pues
1:27:38también a nivel regulatorio pues implica
1:27:40retos, ¿no?, con respecto a la eh a la
1:27:42caracterización y estandarización de la
1:27:44producción. Sin embargo, pues ahorita
1:27:46vamos a ver que que sí se utiliza.
1:27:49Este sistema, por ejemplo, de expresión
1:27:52transitoria. Ha sido importante para el
1:27:53desarrollo de vacunas eh por ejemplo en
1:27:56situaciones de emergencia sanitaria.
1:27:58eh pues por esta
1:28:01esta urgencia, ¿no?, que hay en la
1:28:03velocidad.
1:28:05Ah, también vale la pena mencionar que
1:28:08eh los sistemas de edición genética eh
1:28:12como Crisper CAS eh se han utilizado y
1:28:15se han intentado eh utilizar en sistemas
1:28:19eh vegetales en los últimos años.
1:28:22Eh,
1:28:25y por ejemplo, e particularmente Crisper
1:28:28Cas en sistemas vegetales
1:28:31ha permitido eh realizar eh, por
1:28:35ejemplo, para eliminar genes eh no
1:28:37deseados, modificar rutas metabólicas o
1:28:40para optimizar la expresión de ciertas
1:28:42eh ciertas proteínas eh en plantas.
1:28:47Eh, aquí, por ejemplo, eh el uso de
1:28:50Crisper Cas como una herramienta de
1:28:51adisión genética eh pues que es mucho
1:28:53más precisa eh reduce algunas de las
1:28:57desventajas que se presentan, por
1:28:59ejemplo, con la transformación con
1:29:00agrobacterium, que agrobacterium, el
1:29:03plasmido TI eh hace la incorpora el gen
1:29:07de interés en el genoma de la célula
1:29:10vegetal, pero lo hace eh al azar. con
1:29:12Crisper Cas pues no pasaría no pasaría
1:29:15esto, ¿no? Sin embargo, eh la regulación
1:29:18del uso de Crisperc en sistemas
1:29:19vegetales y más cuando va a ser a nivel
1:29:21de planta completa varía eh dependiendo
1:29:24del país. Eh de aquí, por ejemplo,
1:29:27podríamos eh hablar de estas cuestiones
1:29:29eh bioéticas de la modificación genética
1:29:32eh de plantas y de la liberación
1:29:34ambiental de organismos genéticamente
1:29:35modificados. Recordemos que pues hay eh
1:29:38todavía hay mucho estigma en la sociedad
1:29:41con el uso o el consumo de organismos
1:29:43genéticamente modificados, que yo veo
1:29:46como que para la medicina no hay mucho
1:29:48problema, pero para eh las plantas sí y
1:29:52más pues si estas decíamos si se van a
1:29:54liberar eh al ambiente, ¿no? Y para esto
1:29:56eh pues se compaginan diferentes
1:30:01leyes o normas que regulan en el orden
1:30:05de pues de bioseguridad, ¿no? Porque si
1:30:07vamos a trabajar con un sistema vegetal
1:30:10eh a nivel de planta completa,
1:30:13aunque aún así que esté en invernadero,
1:30:15pues se deben de tomar eh los considerar
1:30:19los candados biológicos necesarios o
1:30:21medidas que eviten la diseminación no
1:30:24intencionada o cruzas con especies
1:30:27vegetales eh que pues estén en el
1:30:29ambiente, en la región. Entonces, esto
1:30:31también le le hallade más complejidad a
1:30:34la cuestión regulatoria y pues también
1:30:36ética, ¿no?
1:30:38Eh, cerrando este paréntesis, eh también
1:30:41nos falta mencionar que para la
1:30:43expresión de proteínas recombinantes en
1:30:45sistemas vegetales también hay una un
1:30:48abordaje, un enfoque muy interesante que
1:30:50es la transformación de cloroplastos. No
1:30:53necesariamente eh hablaríamos de, o sea,
1:30:55no no es modificar o eh genes o o
1:30:59modificar el genoma nuclear de la
1:31:01bacteria, sino eh pues que se pueden,
1:31:03recordemos e que de acuerdo a la tería
1:31:06endosimbiótica, tanto mitocondrias como
1:31:08cloroplastos, pues es como un proceso de
1:31:10fusión donde se integró eh una bacteria
1:31:13a una célula más grande y que pues ya se
1:31:16utiliza como una maquinaria eh de apoyo
1:31:19eh para la célula, en este caso vegetal,
1:31:21el cloroplasto, ¿no? Entonces, los
1:31:23cloroplastos también tienen su propio eh
1:31:26genoma eh y que también eh la
1:31:29modificación de este genoma permite, por
1:31:31ejemplo, eh incluso introducir geles
1:31:34genes polisistrónicos,
1:31:37o sea, expresar varios genes bajo la
1:31:39regulación del mismo del mismo promotor.
1:31:41O sea, aquí como que estas em
1:31:46cualidades o particularidades que se
1:31:49podrían explotar de una célula
1:31:51bacteriana se puede hacer con el con el
1:31:53cloroplasto. En este caso, el AD el ADN
1:31:56exógeno se integra en el genoma del
1:31:58cloroplasto en lugar del núcleo.
1:32:01Esto por decíamos permite lograr niveles
1:32:04de expresión más altos porque se pueden
1:32:07tener múltiples copias del genoma en
1:32:10diferentes cloroplastos, hay un menor
1:32:12riesgo de dispersión genética,
1:32:15este y por ende pues que sea más seguro
1:32:17de liberarse al ambiente y la expresión
1:32:19se menciona que es más estable. Además
1:32:22permite eh producir buenas cantidades eh
1:32:24de proteínas y se ha utilizado para la
1:32:27producción eh de vacunas.
1:32:30Eh, sin embargo, pues también eh tenemos
1:32:33el problema de la glicosilación. Aquí
1:32:35obviamente los cloroplastos no van a
1:32:36poder glicosilar, pero sí pudiera ser
1:32:38que liberen eh esas proteínas en el
1:32:41citoplasma y que pues también ahí se
1:32:43glicile, pero pues tenemos esta
1:32:45desventaja que pues van a seguir siendo
1:32:46diferentes eh a las humanas, pero pues
1:32:48es una eh estrategia bastante
1:32:51interesante.
1:32:55Entonces, la transformación mediada por
1:32:57agrobacterium tumefasciens, decíamos que
1:32:59es la técnica que más se utiliza para
1:33:01modificar genéticamente células
1:33:03vegetales y esta se basa en la capacidad
1:33:08natural que tiene la bacteria
1:33:10agrobacterium intumefas para transferir
1:33:13ADN, particularmente el eh el TDNA o el
1:33:18ADN el ADN que se puede transferir a
1:33:21células vegetales.
1:33:23La bacteria introduce el gen de interés
1:33:25integrado en un factor plasmídico dentro
1:33:28del genoma nuclear de la planta. Este,
1:33:32recordemos que, o sea, esta bacteria de
1:33:34manera natural, a través de este
1:33:36plásmido,
1:33:38eh puede eh introducir al genoma de la
1:33:41planta genes que codifican a auxinas,
1:33:45citocininas y opinas, que son eh
1:33:47hormonas eh hormonas vegetales que van a
1:33:50eh fomentar el crecimiento eh
1:33:54desacelerado y no diferenciado de las
1:33:56células vegetales, formando eh como
1:33:58callos tumorales
1:34:01Eh, aquí pues obviamente a nivel
1:34:02biotecnológico pues ya se puede
1:34:04modificar ese cassette o ese plásmido,
1:34:07de manera que pues eliminan estos eh
1:34:11eh estos genes que codifican a
1:34:13fitoormonas e introducir pues el gen de
1:34:16interés dejando eh
1:34:19eh conservando, perdón, estas regiones
1:34:22eh en el plásmido de integración al
1:34:24genoma vegetal.
1:34:27Eh, este ADN eh exógeno utilizando el el
1:34:30plasmido TI se integra eh de manera pues
1:34:33relativamente estable, ya que pues lo
1:34:35hace, o sea, en el genoma nuclear
1:34:38eh
1:34:42con pues bajos costos y una facilidad
1:34:45pues técnica relativamente pues sí
1:34:46sencilla. Sin embargo, la integración al
1:34:49genoma es aleatoria,
1:34:54eh lo cual pues da posibles efectos
1:34:57dependiendo de la posición en el genoma
1:34:59donde se inserte el gen de interés y por
1:35:02ende puede haber variabilidad
1:35:05en los niveles de eh expresión.
1:35:08Esta técnica además permite desarrollar
1:35:10líneas vegetales
1:35:12eh productoras de proteínas terapéuticas
1:35:14de forma estable. Por ejemplo, también
1:35:16esto se puede aplicar eh este plasmido y
1:35:19o agrobacterium también pues a callos eh
1:35:21o a cultivos eh vegetales invitro.
1:35:26Eh, aquí pues la desventaja es que el
1:35:29tiempo requerido para generar plantas
1:35:31transgénicas pues está en el orden de
1:35:33meses, lo cual eh pues limita su uso eh
1:35:37pues cuando decíamos tenemos esta
1:35:38emergencia eh o se requiere una
1:35:40respuesta rápida ante una emergencia
1:35:42sanitaria. Entonces, pues en este en
1:35:44estos casos pues el plasmido TI y
1:35:47agrobacterium pues no sería una
1:35:49alternativa viable, ¿no? Por eso
1:35:51decíamos esto de la transformación de
1:35:52cloroplastos.
1:35:54Eh, en contraste también pues existe el
1:35:57uso de agrobacterium para la eh
1:35:59expresión eh transitoria de proteínas.
1:36:02Eh, en este pues lo que se utiliza eh
1:36:04más que el plasmido TI eh o sea, no se
1:36:07utilizan estas regiones de integración
1:36:09al genoma, pero pues se sigue utilizando
1:36:11a la bacteria que eh pues es capaz de,
1:36:14como dicen, esta infiltración de
1:36:16introducirse a heridas o cortes que se
1:36:18hagan en las células vegetales e
1:36:20introducir pues su material genético,
1:36:22que en este caso pues uno lo puede lo
1:36:24puede controlar y y si uno no deja estas
1:36:27regiones de eh de integración o de
1:36:29recombinación al genoma, pues la
1:36:30expresión va a ser de manera episomal
1:36:32completamente transitoria.
1:36:36Eh, entonces, por ejemplo, aquí se
1:36:38muestra eh el protocolo pues muy general
1:36:41de cómo eh se hace la modificación
1:36:43genética utilizando eh Agrobaacterium y
1:36:45decíamos el plasmido, el plasmido TI.
1:36:48Aquí también pues vale la pena mencionar
1:36:51pues que se puede deseamos utilizarse
1:36:53tanto en planta completa como en cultivo
1:36:55eh invitro. En la primera parte, pues
1:36:58tenemos eh el
1:37:01diseño o la integración del gen de
1:37:03interés en el plasmido TI en eh y que
1:37:07pues este se introduzca eh a
1:37:09Agrobacterium, para lo cual pues se
1:37:11utilizan eh técnicas eh pues de de eh
1:37:15modificación genética estándar, como
1:37:17podría ser, por ejemplo, eh
1:37:19electorporación, biobalística,
1:37:22eh choque choque osmótico, entre otras,
1:37:24¿no? Entonces el, o sea, ya una vez que
1:37:27se ha generado el plasmido de interés,
1:37:29se reinserta en agrobacterium. Y por
1:37:33ejemplo, eh puede ser que las plantas, o
1:37:36sea, tenemos por ejemplo callos eh o
1:37:39cultivo eh
1:37:42celular vegetal invitro, pues podemos
1:37:45meter ese gen para que eh
1:37:49perdón, podemos exponerlo justamente con
1:37:51la bacteria, pues para que se introduzca
1:37:53eh el gen de interés y eventualmente
1:37:55también si lo deseamos eh
1:37:59estos cultivos pues se pueden también
1:38:01con diferentes fitohormonas, pues
1:38:03rediferenciar a una planta completa. O
1:38:06bien yo le agregaría una línea de acá
1:38:08para acá, este,
1:38:13eh, para que si se le hacen cortes o
1:38:16heridas a la célula, a la a la planta
1:38:18completa y se exponen a a
1:38:20Agrobaacterium, pues este puede insertar
1:38:23su plasmido TI y e
1:38:26y modificar genéticamente genéticamente
1:38:28a las células. Aquí el hecho de que se
1:38:31presente esta parte de que la
1:38:32modificación se haga a nivel de un
1:38:34cultivo invitro, pues permite también eh
1:38:36tener esta un mejor control, ¿no?, en la
1:38:39en la modificación genética o más que en
1:38:40la modificación genética, en la
1:38:42selección eh pues de las eh de las
1:38:46células
1:38:48pues con los atributos que nosotros
1:38:49deseamos para la expresión.
1:38:54En esta tabla se describen eh algunos
1:38:57medicamentos biotecnológicos
1:39:01eh bueno, medicamentos biotecnológicos y
1:39:04otras proteínas recominantes que ya
1:39:06están aprobadas para su uso eh en el
1:39:08mercado.
1:39:10Eh aquí pues lo que podemos ver es que
1:39:12tanto la expresión transitoria como
1:39:14estable de las células vegetales eh pues
1:39:17se utiliza.
1:39:20Yo quisiera
1:39:22resaltar
1:39:25estas dos de la empresa Protalic, que en
1:39:29esta este es justamente el ejemplo
1:39:32de que les enseñaba al principio de en
1:39:35células de zanahoria eh para la
1:39:38producción de la eh glucocerebrosidaza.
1:39:41Este, por ejemplo, pues tiene la lógica
1:39:43pues que se exprese eh o bueno, que el
1:39:45sistema de modificación genética haya
1:39:48sido eh una
1:39:50expresión estable con integración al
1:39:52genoma, puesto que eh por estas
1:39:54cuestiones de eh de la caracterización y
1:39:56pues de la consistencia y la calidad eh
1:39:59necesarias para los medicamentos
1:40:00biotecnológicos.
1:40:02Eh, algo [carraspeo] que vale la pena
1:40:04mencionar también pues son las especies
1:40:06que están listadas aquí en la tabla.
1:40:07Aquí hay eh células e células de
1:40:11zanahoria o algunos eh modelos vegetales
1:40:14pues mucho más comunes como nicotiana
1:40:16ventamiana o nicotiana tabaco, que o sea
1:40:19que son eh
1:40:23plantas eh que se utilizan mucho, o sea,
1:40:25como organismos modelo. Eh también
1:40:28tenemos eh maíz y otras especies. En
1:40:31cuanto a las
1:40:34a las empresas, les digo que me resalta
1:40:36mucho esto de la empresa de Protalic
1:40:38Biotherapeutics, pero también quisiera
1:40:40resaltar la empresa Medicago, que esta
1:40:42es una empresa, si no me equivoco,
1:40:44canadiense.
1:40:47canadiense o Israel, pero estoy que
1:40:49segura que es canadiense, si no me falla
1:40:50la memoria, que ahorita pues ha tenido
1:40:52un pequeño empuje derivado de la
1:40:55pandemia, pues para la producción e pues
1:40:58de vacunas de subunidades
1:41:00con estas plataformas eh vegetales.
1:41:04Aquí lo que yo quisiera resaltar o
1:41:05bueno, contarles un poquito de historia
1:41:07de este producto de Protalics
1:41:09Biotherapeutics o como se llama
1:41:11glucocerebrosidaza.
1:41:13Esta este fue el primer biofarmacéutico
1:41:18eh producido en una fuente vegetal, es
1:41:20decir, en un e en decíamos en células de
1:41:23zanahoria, o sea, a nivel de biorrector
1:41:26invitro. eh el primer eh medicamento
1:41:30producido en sistemas vegetales eh en
1:41:32ser aprobado, ¿no? Y esto se dio eh
1:41:36casualmente por una también una pequeña
1:41:39situación o una emergencia eh una
1:41:41emergencia sanitaria, no voy a decir una
1:41:43pandemia, no, ese tipo de emergencias,
1:41:45pero eh por cuestiones de desabasto de
1:41:48un medicamento.
1:41:50La glucocerebrocidaza es una enzima que
1:41:53se utiliza como terapia de reemplazo,
1:41:56particularmente para una enfermedad
1:41:58genética que se llama la enfermedad de
1:42:00gauche, que justamente pues se
1:42:02caracteriza por una deficiencia de esta
1:42:04eh de esta enzima que se encarga eh de
1:42:08la hidrólis de las glucoceramidas.
1:42:11Eh, la estas glucoceramidas que no se
1:42:13degradan tienden a eh acumularse en
1:42:17órganos y tejidos y producen eh
1:42:19malformaciones,
1:42:21eh retrasos o alteraciones eh cognitivas
1:42:24eh y pues problemas de pues de
1:42:26desarrollo y crecimiento en general.
1:42:29Eh, aquí lo que llama la atención o
1:42:32digamos que algo que promovió la
1:42:34aprobación de la glucocerebro en
1:42:36sistemas vegetales es que eh vaya, ya
1:42:39existe una terapia de reemplazo eh por
1:42:42otra empresa, creo que el producto se
1:42:44llama Cerezim, si no me equivoco, eh que
1:42:49es una glucocerebroidasa producida en
1:42:51células cho pasó que la empresa
1:42:54productora eh, pues tuvo problemas de
1:42:57contaminación en sus lotes se tuvieron
1:42:59que retirar eh del mercado eh su
1:43:02producto, pues hasta que eh resolvieron
1:43:04estos problemas de estos problemas de
1:43:06contaminación. Y fue más o menos a la
1:43:08par cuando la empresa Protalic estaba eh
1:43:11sometiendo eh pues los estudios eh
1:43:14clínicos para obtener el registro
1:43:15sanitario de su enzima producida eh
1:43:18producida en
1:43:20producida en células vegetales.
1:43:22Entonces, digamos que fue esta este
1:43:24desabasto que se dio por esta
1:43:26problemática con la otra compañía, lo
1:43:28cual pues aceleró eh su aprobación, si
1:43:31no me equivoco, en el 2012 eh en la FDA
1:43:35pues para el tratamiento pues de
1:43:37pacientes con enfermedad eh de gaucher.
1:43:44Y bueno, espero que se acase a ver esta
1:43:45tabla. Eh, aquí tenemos eh algunos
1:43:50también eh productos que en este caso
1:43:53están producidos por el molecular
1:43:55farming, eh que es así a nivel de planta
1:43:57completa, donde está eh la investigación
1:44:01o eh el estudio, la inversión en cuanto
1:44:04a la en el en esta innovación en el área
1:44:07farmacéutica utilizando sistemas
1:44:09vegetales.
1:44:11Y aquí pues podemos ver que la mayoría
1:44:12se han enfocado a la producción de
1:44:15vacunas también por esta cuestión de las
1:44:17diferencias en las glicosilaciones y que
1:44:19las células vegetales van a generar pues
1:44:20proteínas más inmunogénicas. Entonces,
1:44:22por eso este este este abordaje, ¿no?
1:44:26Tenemos vacunas
1:44:28que se han eh generado pues para atacar
1:44:32eh el COVID, pero por ahí tenemos otras
1:44:34enfermedades también igual de relevantes
1:44:37como influenza, hepatitis, rotavirus,
1:44:40ébola, eh malaria eh y dengue. Y también
1:44:45pues se han utilizado estos sistemas
1:44:47vegetales o están en desarrollo pues
1:44:49para producir deseamos también pues
1:44:52insulina,
1:44:53enzimas y otras y otras proteínas, ¿no?
1:44:57Otras proteínas humanas. Y aquí de nuevo
1:44:59tenemos eh organismos como nicotiana
1:45:02ventamiana, nicotiana tabaco, eh
1:45:06zanahoria, tomate, papa,
1:45:09eh maíz, entre entre otras, ¿no? Y las
1:45:14empresas que resaltan que aquí pues si
1:45:16no no son muchas las empresas
1:45:18biotecnológicas que manejen estos estas
1:45:20plataformas biológicas, tenemos
1:45:23Medicago, eh Protalic y por ahí también
1:45:27SBIOSIS también. Esta es una eh esta es
1:45:31una iniciativa que a mí se me hace eh
1:45:33bastante interesante para la producción
1:45:36de de insulina, pero a partir a a partir
1:45:39no recuerdo es eh sflower es, si no me
1:45:43equivoco, es canola. eh que aquí
1:45:45justamente esta insulina eh el objetivo
1:45:48de esta empresa es eh favorecer la
1:45:52acumulación de esa insulina en los
1:45:54cuerpos eh oleosos de de la canola, ¿no?
1:45:57Para que e por estas técnicas de
1:46:00extracción de aceites que se utilizan en
1:46:02la industria alimenticia eh pues se
1:46:04pueda purificar con, o sea, obtener con
1:46:06muy buena eh con muy buenos niveles de
1:46:09pureza eh la insulina. Entonces, este es
1:46:12un producto que está eh también en
1:46:14desarrollo y también algunos otros
1:46:16productos eh biológicos. Eh, por
1:46:19ejemplo, esta de Kentucky Bioprocessing,
1:46:22eh para la también pues para la
1:46:24producción de, si no no me equivoco, eh
1:46:27son como e partículas eh parecidas eh a
1:46:31virus y que también hay también hay
1:46:33algunas empresas eh biotecnológicas que
1:46:36le han dado este enfoque, pero no a la
1:46:37medicina humana, sino también a la a la
1:46:39medicina veterinaria.
1:46:44Bueno, las células de insecto, que es
1:46:46otra plataforma biológica que se puede
1:46:47utilizar para la producción de
1:46:49biofarmacéuticos,
1:46:50es una plataforma eh eucariota que pues
1:46:53es bastante versátil en general para la
1:46:55producción de proteínas recombinantes.
1:46:58de manera particular
1:47:01se utiliza
1:47:03en aplicaciones principalmente en la
1:47:05medicina veterinaria y donde pues se
1:47:07requiere un balance entre la complejidad
1:47:10estructural de las proteínas y
1:47:11eficiencia de producción. O sea, no es
1:47:13una línea eh tan lenta como eh una
1:47:17célula de mamífero. Eh, aquí, bueno,
1:47:19dice que los eh sistemas de insecto
1:47:22ocupan una posición intermedia entre
1:47:23levaduras y células de mamífero porque
1:47:26eh en cuanto también eh principalmente a
1:47:29términos de crecimiento, ¿no?, y
1:47:31velocidad. Eh, y y sin embargo, bueno, y
1:47:34a pesar no no a pesar, perdón, sino
1:47:36además eh que ofrece capacidades de
1:47:38plegamiento y capacidad de realizar eh
1:47:40modificaciones eh postradiccionales
1:47:43eh pero pues con menos costo que los eh
1:47:46que las células de mamífero.
1:47:48Su uso en la industria farmacéutica se
1:47:50ha enfocado principalmente en la
1:47:53medicina humana para la producción de
1:47:55vacunas recombinantes, particularmente
1:47:59partículas parecidas a virus os. Eh, y
1:48:02también en la medicina veterinaria.
1:48:05Eh, bueno, las células de insecto
1:48:07decíamos son sistemas eucariotas eh
1:48:09donde se utilizan eh líneas celulares
1:48:12continuas, usualmente eh de especies
1:48:15como eh ese flujiperda. eh que son las
1:48:19líneas eh SF9 y SF21
1:48:23eh y eh tricoplucia o
1:48:28tricopluciani o Teni eh para las células
1:48:31eh HI5.
1:48:33Eh, estas pues al ser eucariotas pues
1:48:35presentan eh organelos pues que les
1:48:37permite eh dar las condiciones
1:48:40apropiadas para eh para el plegamiento
1:48:43de proteínas complejas, modificaciones
1:48:45eh glicosilaciones, puentes de sulfuro.
1:48:49Y bueno, aquí algo interesante en
1:48:51términos tecnológicos es que para
1:48:54modificar genéticamente estas células o
1:48:57más bien para introducir genes genes de
1:49:00interés, eh se utiliza dentro de las
1:49:03células de de insecto eh sistemas de
1:49:06expresión a base de vaculovirus o
1:49:10vaculovirus expression vector system, eh
1:49:13el cual pues los vaculovirus eh son eh
1:49:16un virus, un virus, perdón,
1:49:18este polihédrico eh modificado
1:49:21genéticamente eh para introducir genes
1:49:25de interés y obviamente no generar eh
1:49:27una enfermedad en en las células. Este
1:49:29virus eh va a infectar a las células de
1:49:31insecto, eh secuestrar su maquinaria
1:49:33celular y dirigir la producción e de la
1:49:37proteína eh recombinante.
1:49:40Particularmente los vaculovirus se
1:49:43utilizan mucho en estos sistemas porque
1:49:48utilizan eh
1:49:53promotores virales, o sea, sus
1:49:54promotores son muy fuertes,
1:49:56especialmente cuando se utilizan
1:49:57promotores eh de la cápscide como la
1:50:00poliedrina.
1:50:01Eh se utilizan eh para una eh expresión
1:50:04transitoria, o sea, no eh no integra el
1:50:07material genético en el genoma de la
1:50:09célula.
1:50:10Eh, y al final el del ciclo, digamos
1:50:15celular, pues lisa eh lisa las células,
1:50:17o sea, el término del ciclo eh de
1:50:19producción. Esto pues al final implica
1:50:22que la producción utilizando estos
1:50:24vectores eh ocurra eh en un periodo
1:50:27relativamente corto.
1:50:30Eh, es decir, o sea, la el tiempo que
1:50:33puede la el la línea celular que ha sido
1:50:38este transfectada con estos váculovirus,
1:50:41pues dura eh dura pocos días, pero puede
1:50:43haber eh reinfecciones continuas de de
1:50:45los cultivos.
1:50:48E y bueno, en general las células de
1:50:50insecto presentan eh bastantes eh
1:50:52bastantes ventajas desde el punto de
1:50:54vista eh biotecnológico.
1:50:56Eh decíamos eh pues las plataforma
1:50:59eucariota pues les permite ensamblar y
1:51:02producir proteínas complejas con
1:51:04modificaciones postraduccionales.
1:51:06Además, pues el tiempo de desarrollo es
1:51:09relativamente corto, o sea, este sistema
1:51:11de vaculovirus se puede establecer
1:51:15rápidamente en comparación con el
1:51:17desarrollo de las líneas celulares
1:51:19estables en las células de mamífero.
1:51:22También el pues hay menor riesgo de la
1:51:25transmisión de patógenos hacia los
1:51:27humanos, algo similar con lo que sucede
1:51:28con las células vegetales.
1:51:32lo las células de insecto pues como tal
1:51:34no son hospedadoras naturales de virus
1:51:37humanos. Entonces, pues también las hace
1:51:39una plataforma eh más segura que las
1:51:41células de mamífero. Eh, sin embargo,
1:51:44pues aún así también presentan eh
1:51:46limitaciones casi, o sea, igual que en
1:51:48otras plataformas eucariotas lejanas a
1:51:51los mamíferos, pues son las
1:51:52glicosaciones.
1:51:55Aquí las células de insecto suelen
1:51:57generar glicosilaciones tipo de
1:52:00pausimanosa o ligomanosas y no tienen
1:52:04extremos de ácido cálico, algo que si
1:52:06sucede con las células de mamífero. en
1:52:09general y si recordamos una de las
1:52:10figuras que veíamos en la unidad uno
1:52:12cuando se comparaban los patrones de
1:52:14glicosilación
1:52:15de las diferentes plataformas
1:52:17biológicas, decíamos que las células de
1:52:19insecto suelen presentar e como
1:52:22glicosilaciones eh cortas o truncas en
1:52:26este caso para los humanos, ¿no?
1:52:28Entonces, también habría que valorar qué
1:52:30consecuencias tienen esas esos patrones
1:52:32de glicoilación diferentes en la
1:52:34eficacia y la seguridad eh de los
1:52:36biofarmacéuticos que se expresen en
1:52:38estas plataformas.
1:52:40Eh,
1:52:41también, bueno, lo que mencionábamos eh
1:52:44una desventaja del uso de los
1:52:46váculovirus, como decíamos que la
1:52:48expresión es transitoria y a veces es
1:52:50necesario hacer estas retranscar
1:52:56variabilidad entre entre lotes.
1:53:01Eh, el escalamiento es moderadamente
1:53:04complejo. Aquí pues suele ser más
1:53:06sencillo que en células de mamífero,
1:53:09pero pues aún así el hecho de estar
1:53:12utilizando sistemas basados en vectores
1:53:14virales para la transfección eh pues es
1:53:17algo que se tiene que controlar y dar
1:53:19seguimiento con mucho detalle.
1:53:22Ah,
1:53:24entonces esta parte de
1:53:26de cómo se establecen los sistemas eh
1:53:29los sistemas de insectos utilizando eh
1:53:31vectores como los vaculovirus, eh
1:53:34también pues importa mucho eh el momento
1:53:36de infección en la o de la transfección
1:53:39de la línea celular utilizando eh estos
1:53:41vectores.
1:53:44Aquí pues la mayoría de las líneas
1:53:46celulares de insecto permiten crecer en
1:53:49suspensión a diferencia de muchas líneas
1:53:51celulares de mamífero que casi siempre
1:53:53crecen en monocapa, eh lo cual pues
1:53:56también eh pues tenemos esta limitante
1:53:59eh del área de contacto eh pues o de la
1:54:02biomasa que densidad celular que se
1:54:04puede alcanzar durante el cultivo con
1:54:06las células de mamífero. En este caso,
1:54:08las células de insecto pues sí permiten
1:54:10hacer esto, o sea, crecer en suspensión.
1:54:13eh
1:54:14y aguantan un poquito más este estrés
1:54:16mecánico
1:54:18frente frente a la agitación, lo que
1:54:21facilita eh pues su uso en ciertos
1:54:23biorreactores.
1:54:25Eh, de nuevo, pues esta agitación no va
1:54:26a ser comparable a la que se presenta
1:54:28con eh biorreactores de bacterias o de
1:54:31levaduras. Eh, sin embargo, eh, lo que
1:54:34decíamos eh la transfección con estos
1:54:36vectores sí altera el metabolismo, puede
1:54:40alterar el el metabolismo celular, por
1:54:42lo que aquí el control eh de nutrientes
1:54:44y oxígeno es esencial. Además, eh pues
1:54:48sí, hay que tener eh un control eh
1:54:50bastante eh riguroso, pues para
1:54:53determinar en qué momento eh pues es
1:54:56necesario eh hacer como otra inoculación
1:55:00u otra transfección eh con los
1:55:02vaculovirus.
1:55:04Eh,
1:55:06también esta plataforma eh permite la
1:55:08secreción a proteínas del medio, como
1:55:10decíamos, eh pues esto facilita eh el
1:55:13procesamiento downstream y eh ya con el
1:55:17desarrollo de la tecnología, pues
1:55:18también se han podido eh establecer
1:55:21modificaciones o estrategias de
1:55:23optimización para esta plataforma eh
1:55:25biológica. Eh, por ejemplo, pues se ha
1:55:27trabajado en estrategias para la
1:55:31transfección que no requieran eh de
1:55:33váculovirus para que pues los las
1:55:36construcciones sean menos variables.
1:55:38También eh se pueden modificar las rutas
1:55:40de glicosilación en estas células, pues
1:55:42para que se parezcan más a las humanas.
1:55:45E
1:55:47entonces
1:55:49aquí pues lo como como podemos ver en la
1:55:51tabla que se muestra en la diapositiva,
1:55:55eh vemos que la pues en realidad la
1:55:57mayoría de los productos que están en el
1:55:59mercado, que estos son algunos, eh hay
1:56:01muchos más, eh pues tienen este enfoque
1:56:04en la medicina eh veterinaria, por
1:56:06ejemplo, para la producción, si se
1:56:08fijan, eh pues de vacunas
1:56:12este
1:56:13y también Hay algunos productos
1:56:15aprobados
1:56:17para uso humano que pues si se fijan
1:56:19también son vacunas y esto pues también
1:56:21está dado pues por esas diferencias en
1:56:23las en las glicosilaciones.
1:56:27Aquí pues tal vez, o sea, podía ser
1:56:28interesante mencionar
1:56:32el CERX,
1:56:34el Servic sería una vacuna contra el
1:56:38virus del papíloma humano que le hace
1:56:39esta competencia a la vacuna que
1:56:42mencionábamos en en levaduras o también
1:56:45pues con la pandemia la empresa Novabax
1:56:47fue capaz de crear una vacuna de
1:56:49subunidades donde se expresa la proteína
1:56:52spike en células en células de insecto.
1:56:57Eh, y bien, en esta figura se muestra
1:56:59justamente eh el proceso de producción
1:57:01de esta vacuna de Novax contra el
1:57:04SARSCOV 2, que decíamos es una proteína
1:57:07de subunidades que se basa eh en la
1:57:10producción de manera recombinante de la
1:57:13eh de la proteína spike del coronavirus,
1:57:16el cual obviamente pues bueno, aquí eh
1:57:18el gen eh que codifica para la proteína
1:57:21spike eh se inserta eh en la caps de eh
1:57:25del vaculovirus y esto se transfecta eh
1:57:28bueno, se expone a los cultivos de
1:57:31células de insecto, en este caso las
1:57:33células SF9, que es de una polilla.
1:57:37Y pues ya una vez que se entrega el gel,
1:57:40pues utiliza la maquinaria de la célula
1:57:42para expresar
1:57:45el ARN mensajero y se traduzca en este
1:57:47caso la proteína spike, la cual eh en
1:57:52este caso se va eh expresar en la
1:57:55superficie celular. se lizan las
1:57:57células, se recupera la eh la proteína
1:58:01spike, la proteína y esta se acopla a
1:58:04nanopartículas,
1:58:06eh que lo cual pues le permite tener eh
1:58:08un tamaño eh mucho mayor eh pues, o sea,
1:58:13que sea una partícula más grande, no
1:58:15nada más eh la partícula individual, o
1:58:17sea, perdón, la proteína individual y
1:58:19esto pues la hace eh la hace más eh
1:58:21inmunogénica y a esto pues también se le
1:58:24adiciona eh diferentes ayudantes. antes
1:58:26eh para que sea la para que sea más eh
1:58:29más inmunogénica.
1:58:33Y bueno, ahora vamos a hablar con la
1:58:36estrella de todas estas plataformas que
1:58:39son las células eh de mamífero. Estas,
1:58:42como ya vimos en las primeras
1:58:44diapositivas, pues son la plataforma
1:58:45predominante para la producción de los
1:58:48biofarmacéuticos,
1:58:50eh especialmente para proteínas
1:58:52complejas como los anticuerpos eh
1:58:54monoclonales eh y vectores virales,
1:58:57entre otras. Eh, y esto pues se da, a
1:59:01pesar de que tienen múltiples eh
1:59:02desventajas por la única ventaja que
1:59:05tienen de el su capacidad para
1:59:07reproducir con alta eh fidelidad las
1:59:11condiciones celulares, pues para
1:59:13producir eh proteínas eh proteínas
1:59:16humanas.
1:59:17Eh este eh por lo mismo es el sistema a
1:59:20nivel regulatorio eh más consolidado,
1:59:22además de eh Ecoel y para la producción
1:59:25de biofarmacéuticos.
1:59:26Sin embargo, pues también es la
1:59:28plataforma eh más costosa y exigente en
1:59:31términos eh operativos. Es una
1:59:34plataforma bastante eh bastante
1:59:36complicada eh delicada de manejar.
1:59:40Ah, bueno, entonces las células de
1:59:42mamífero pues una maquinaria eh celular
1:59:44compleja eh que permite eh pues el
1:59:49ensamblaje y las glicosiones más
1:59:51parecidas a las humanas, dependiendo
1:59:53también eh de la especie eh o la línea
1:59:55de qué especie sea la línea célula que
1:59:56estamos utilizando, incluyendo estas
1:59:59glicosaciones acopladas a moléculas de
2:00:01ácido cálico. también permite una
2:00:04secreción eficiente de proteínas y esto,
2:00:06por ejemplo, para la producción de
2:00:08anticuerpos monoclonales, pues también
2:00:10puede generar una ventaja en términos de
2:00:13de purificación.
2:00:16Eh, aquí eh un punto importante que hay
2:00:19que mencionar sobre el manejo de las
2:00:21células de mamífero es que eh pues en la
2:00:23industria farmacéutica eh lo ideal eh
2:00:26sería trabajar con líneas celulares eh a
2:00:30diferencia, por ejemplo, de cultivos
2:00:31primarios de células eh de mamífero.
2:00:35Es importante notar que las células, los
2:00:38cultivos primarios, o sea, que se
2:00:40obtienen directamente del tejido, tienen
2:00:42una capacidad eh limitada de división en
2:00:46el laboratorio, lo que se llama
2:00:48senescencia.
2:00:49Ah, esto, por ejemplo, eh el manejo de
2:00:52cultivos primarios puede ser eh muy
2:00:54relevante para la investigación, dado
2:00:57que e estas células como vienen eh pues
2:01:00extraídas directamente eh de un tejido,
2:01:03que es básicamente, digamos, por
2:01:05ejemplo, si habláramos de células
2:01:06pancreáticas, se hace una disección,
2:01:09digamos, de un animal del páncreas, eh
2:01:11se tripsiniza, o sea, se se deshace la
2:01:14matriz extracelular en el laboratorio
2:01:16para que se disgregue eh el órgano, se
2:01:18siembre
2:01:19en una caja de Petri, este, y con eso
2:01:22pues hacer pruebas, ¿no? Eh, con,
2:01:24decíamos con esta limitante de que
2:01:26tienen estas en esencia una eh capacidad
2:01:29limitada de división, o sea, no pueden
2:01:31hacerse muchos subcultivos con estos con
2:01:34estos cultivos primarios, pero a nivel
2:01:36de investigación se usan mucho porque
2:01:38pues son las que asemejan en mayor
2:01:40medida eh la morfología y el
2:01:42comportamiento eh pues del tejido eh
2:01:45como si hubiera sido invivo, ¿no? lo más
2:01:47parecido. Una línea celular,
2:01:52por otro lado, ha pasado por un proceso
2:01:55de inmortalización, de manera que pues
2:01:58no exista esta enesencia o las
2:02:00enesencias se prolonguen mucho más y
2:02:02puedan utilizarse muchos pases eh
2:02:04subcultivos y lotes de eh de las mismas
2:02:07células eh conservando las mismas
2:02:09características.
2:02:10Esto obviamente las líneas celulares
2:02:12también se utilizan eh para
2:02:13investigación, pero eh pues si le damos
2:02:16el enfoque a nivel industrial, pues sí
2:02:18es importante el uso o la generación de
2:02:20esas líneas celulares eh inmortalizadas
2:02:23para que puedan proliferar
2:02:24indefinidamente y si bien que no eh no
2:02:28repliquen eh al 100% eh un ambiente
2:02:31fisiológico invivo, pues en este caso no
2:02:33importa, lo que interesa es que pues
2:02:35sean capaces simplemente de producir la
2:02:38proteína de interés. Y lo claro que lo
2:02:40pueden hacer. Entonces, eh para obtener
2:02:43una línea celular previo a la eh, o sea,
2:02:47independientemente de cuál va a ser la
2:02:49proteína que va a expresar o para qué se
2:02:50va a utilizar, pues es importante
2:02:53establecer esta inmortalización.
2:02:55Esto usualmente se puede hacer con la
2:02:58introducción, por ejemplo, de oncogenes
2:03:00virales, o sea, se hace una
2:03:02inmortalización usualmente, por ejemplo,
2:03:04con el virus SB40, que es un virus eh
2:03:07que infecta eh o sea, eh un virus que
2:03:10ataca eh aimios eh pero se utiliza para
2:03:13inmortalizar muchas eh líneas celulares
2:03:16eh humanas y de y de otros mamíferos.
2:03:19Ah, este, por ejemplo, es el esta
2:03:21inmortalización con estos con partículas
2:03:24virales. Eh, pues sí, e
2:03:27da implicaciones a nivel de eh de
2:03:30bioseguridad ya al momento de la
2:03:32producción industrial, porque eh pues
2:03:34como se utiliza un virus para
2:03:35inmortalizarlas, pues hay una
2:03:37probabilidad de que haya partículas de
2:03:39este virus que se estén eh sintetizando
2:03:42en el cultivo y ese y esas partículas
2:03:44virales pues podrían ser infecciosas eh
2:03:47para los humanos. Entonces, eh pues se
2:03:49debe de tener un control eh especial
2:03:51cuando se manejan estas líneas celulares
2:03:53que se inmortalizaron de esta manera. Eh
2:03:56también se pueden inmortalizar eh con
2:03:59otros eh tipos de virus o con métodos eh
2:04:03físicos o químicos. Puede ser, por
2:04:04ejemplo, con agentes intercalantes del
2:04:06ADN para inducir mutaciones, con
2:04:09radiación eh eh, por ejemplo, V o de
2:04:12otro tipo, ¿no? Al final eh lo que se lo
2:04:16que se busca es generar mutaciones que
2:04:18alteren el ciclo celular y que eviten
2:04:20estas en esencia P y que además
2:04:22mantengan la capacidad proliferativa.
2:04:26Entonces,
2:04:28ahora digamos a sabiendas que, o sea,
2:04:30esta inmortalización si va generar
2:04:33cambios en cómo se comporta la línea
2:04:35celular, pero pues es algo que se tiene
2:04:37que caracterizar y de hecho ya hay
2:04:39muchas líneas eh que pues van celulares,
2:04:41por ejemplo, como ATCC, eh pues te las
2:04:43venden, ¿no? y ya están eh bastante eh
2:04:47caracterizadas.
2:04:50E desde el punto de vista regulatorio,
2:04:53pues las líneas celulares pues deben de
2:04:56eh evaluarse cuidadosamente para
2:04:58garantizar eh la estabilidad o sea que
2:05:01sigan eh conformando eh perdón,
2:05:03conservando esta capacidad eh de
2:05:05crecimiento eh comportamiento
2:05:07metabólico, eh además de evaluar eh la
2:05:10seguridad, decíamos, por la eh
2:05:12introducción de posibles partículas
2:05:14virales o la contaminación de los medios
2:05:16de cultivo que deseamos pues si se
2:05:19contamina un cultivo de este tipo,
2:05:21generalmente pues va a estar asociado
2:05:23con agentes patógenos para humanos.
2:05:25Entonces deben implementar estrategias
2:05:27de control mucho más rigurosas.
2:05:30También pues dependiendo de la
2:05:32estrategia para la modificación genética
2:05:34que se utilice, pues también eh
2:05:37verificar la reproducibilidad eh de la
2:05:40línea celular una vez que se haya hecho.
2:05:42Entonces, las líneas celulares eh de
2:05:45mamífero que más se utilizan, la
2:05:46principal, como veíamos en el en la
2:05:48gráfica de pastel, eh pues son las
2:05:50células chock, que es la son derivadas
2:05:53de eh ovario de hámstero.
2:05:56y se han consolidado como el estándar
2:05:58debido a su robustez, su capacidad de
2:06:02adaptarse a cultivos tanto en suspensión
2:06:04como en monocapa. Esa también es una
2:06:07limitante de algunas líneas celulares
2:06:09que solamente pueden crecer en monocapa
2:06:11y que puede producir glicoproteínas eh
2:06:13con perfiles de glicos adecuados, no
2:06:15exactamente iguales a los humanos, pero
2:06:17lo suficientemente para que sean seguras
2:06:19seguros y eficaces esas proteínas.
2:06:22Ah, además, pues como ya se ha trabajado
2:06:25eh pues por muchas décadas con esta
2:06:27línea celular, ya también se han
2:06:29establecido técnicas o métodos de
2:06:31optimización eh mediante ingeniería
2:06:33genética, selección clonal para alcanzar
2:06:36niveles eh de productividad eh adecuados
2:06:39para la producción industrial, ¿no?
2:06:41Además, cuentan con un amplio historial
2:06:43regulatorio, o sea, ya las anges
2:06:44regulatorias las conocen y eso también
2:06:46facilita su aprobación para el la
2:06:49generación de productos
2:06:50biofarmacéuticos.
2:06:52Ah, otra línea celular es la son las
2:06:55células he que estas son eh derivadas de
2:06:59eh de riñón embrionario humano, que es
2:07:03Human embrionic kidney. Eh, estas eh se
2:07:07utilizan se utilizan mucho en
2:07:09investigación, pero cada vez, como ve,
2:07:11se fijan aquí en la tabla, ya hay
2:07:13productos eh producidos, perdón, ya hay
2:07:16biofarmacéuticos eh que se producen eh
2:07:20en esta en esta plataforma. eh humana
2:07:22que están eh que están aprobados. Se
2:07:25utilizan, o sea, para la producción de
2:07:27biofarmacéuticos, también para la
2:07:28producción de vectores virales o células
2:07:31empacadoras eh como células empacadoras
2:07:33y también para, o sea, para generar
2:07:35productos para terapia higiénica, como
2:07:37veíamos en el último tema de la unidad
2:07:39dos. Eh, aquí pues la ventaja eh que
2:07:42tiene esta línea celular pues es que son
2:07:45eh pues son una es una línea celular
2:07:48humana. Entonces, las modificaciones
2:07:51postradiccionales postraduccionales son
2:07:53auténticamente humanas, lo que reduce
2:07:57bastante, o sea, casi que llevarlo a
2:07:59cero, bueno, obviamente no a cero, pero
2:08:01casi, eh reduce bastante el riesgo de
2:08:04inmunogenicidad y mejora la
2:08:05funcionalidad de las proteínas
2:08:07terapéuticas.
2:08:09Eh, sin embargo, pues su uso, como
2:08:12recordemos la gráfica de pastel, pues se
2:08:14eh pues todavía no se utilizan eh tanto
2:08:16como las células cho eh debido a que
2:08:19pues las células cho tienen más tiempo
2:08:20en el mercado y están más acostumbradas,
2:08:22¿no? También tenemos las células de
2:08:26mieloma como la línea celular NS0 o SP20
2:08:31eh que se han utilizado para la
2:08:33producción de anticuerpos monoclonales.
2:08:37Eh,
2:08:39estas eh
2:08:42estas líneas celulares,
2:08:45a pesar de que se utilizan mucho para la
2:08:46producción de eh anticuerpos, pues
2:08:48también eh pues no son células eh
2:08:51humanas. Entonces, pues también aquí hay
2:08:53pues ligeras diferencias, mucho menores
2:08:55que con plantas
2:08:57levaduras o células de insecto, pero
2:08:59pues sí eh eh
2:09:02pues no son exactamente iguales, ¿no? Eh
2:09:05y su uso eh pues conforme ha avanzado la
2:09:07tecnología, pues ha disminuido más el
2:09:09uso de las células de mieloma eh por uso
2:09:12por plataformas más eh optimizadas como
2:09:15las células show.
2:09:18La modificación genética de las células
2:09:20de mamífero es también un punto eh
2:09:22importante que hay que que hay que
2:09:24mencionar. Eh, casi siempre eh bueno,
2:09:28igual que con otras plataformas, se
2:09:29utilizan técnicas de transfección que
2:09:31pueden ser tanto tanto transitorias eh
2:09:34como estables. Cuando hablamos de una
2:09:36transfección estable, el gel se integra
2:09:38en el genoma celular, lo cual pues es
2:09:41beneficioso porque pues permite la
2:09:42producción eh a largo plazo de eh del
2:09:45producto a través de las generaciones y
2:09:47de diferentes lotes.
2:09:50Aquí, por ejemplo,
2:09:54hablando de la selección
2:09:57de las clonas positivas, digamos, que
2:09:59han sido modificadas genéticamente, casi
2:10:01siempre se utilizan marcadores como la
2:10:04glutamina sintetasa para eh pues sí,
2:10:07como un marcador de selección utilizando
2:10:09medios de cultivo eh diferentes.
2:10:13También en los últimos años se han
2:10:15implementado herramientas de edición
2:10:17genética como Crisper
2:10:19para tanto para introducir pues genes de
2:10:22interés como optimizar o mejorar las
2:10:25rutas metabólicas o eliminar genes que
2:10:28puedan afectar eh la producción o
2:10:30modificar los patrones de glicosilación.
2:10:36También otro eh punto importante eh son
2:10:39los medios de cultivo. Esto también,
2:10:40bueno, ya lo hemos mencionado un poco eh
2:10:43a lo largo del video. Eh aquí las
2:10:46células de mamífero, pues yo creo que
2:10:48son es la plataforma biológica que
2:10:50utiliza hm
2:10:53requerimientos nutricionales eh mucho
2:10:56más estrictos. necesitan un suministro
2:10:59muy balanceado de macronutrientes, de
2:11:01proteínas, lípidos, carbohidratos y
2:11:03también de micronutrientes, como se
2:11:05lamos vitaminas, eh metales trrasa, eh
2:11:08aminoácidos,
2:11:10factores de crecimiento, entre otras, va
2:11:12a depender de la línea eh de la línea
2:11:14celular.
2:11:15Y esto pues puede afectar, o sea, la el
2:11:18este balance eh apropiado en el medio de
2:11:21cultivo va a influir en tanto en la en
2:11:26el crecimiento celular como en la
2:11:27biosíntesis de las eh de las proteínas.
2:11:30Entonces, casi siempre eh tienen una
2:11:32fuente de carbono como glucosa, eh
2:11:34aminoácidos tanto esenciales como no
2:11:37esenciales. Particularmente eh la
2:11:40glutamina eh es importante que esté
2:11:42suplementada en estos cultivos porque
2:11:44además funcionan como una fuente de
2:11:46nitrógeno además de eh de carbón.
2:11:49Eh,
2:11:52además los medios deben de tener eh
2:11:54vitaminas, sales inorgánicas,
2:11:55olioelementos,
2:11:57eh lípidos y deseamos factores de
2:11:59crecimiento.
2:12:03Actualmente, bueno, mencionábamos que
2:12:07muchos de estos requerimientos, por
2:12:08ejemplo, estos factores de crecimiento o
2:12:10elementos trazas, si bien hay algunos
2:12:12que se pueden suplementar directamente
2:12:14en el medio de cultivo, casi siempre eh
2:12:17se utilizan o se utilizaban eh sueros
2:12:21animales, suero fetal bobino, eh suelo
2:12:23de ternera, porque eh se ha visto que, o
2:12:26sea, pues crecen mucho mejor las células
2:12:27y o hay algunas que no pueden crecer sin
2:12:29ellos. eh porque proporciona una mezcla
2:12:33entre hormonas, factores de crecimiento,
2:12:35proteínas que son muy difíciles eh pues
2:12:38de replicar en el laboratorio.
2:12:41Eh, lamentablemente el uso de eh sueros
2:12:43animales pues presenta múltiples
2:12:45desventajas.
2:12:47Una es eh la variabilidad de lote a
2:12:49lote. Eh, de hecho eh pues algo que se
2:12:52tiene que asegurar
2:12:54para la el correcto funcionamiento y
2:12:56producción, o sea, el funcionamiento de
2:12:58las células y la producción de la
2:12:59proteína recombinante en este tipo de
2:13:02plataformas, pues es asegurar la
2:13:04estabilidad de la materia prima, ¿no? La
2:13:06consistencia de la materia prima y sus
2:13:07características. Y esto tiene que ver
2:13:09con eh, o sea, puede aplica directamente
2:13:13eh en el suero, ¿no? Entonces, luego a
2:13:14veces eh
2:13:17sí se ha visto que cambiar eh de suero,
2:13:21tanto del tipo que si es bobino fetal o
2:13:23de ternera, etcétera, pero también eh
2:13:25cambiar entre eh entre proveedores eh
2:13:29influye enormemente en el comportamiento
2:13:31del cultivo. Entonces eh pues eso
2:13:34también genera cierta dependencia, ¿no?
2:13:36o pues esto tiene un impacto, se deben
2:13:38de establecer convenios apropiados para
2:13:40garantizar esa e pues esa consistencia
2:13:44en la materia prima, ¿no? Y aún así
2:13:47puede haber valiabilidad dentro de la
2:13:48misma marca porque pues vienen de
2:13:50animales diferentes entre lote y lote.
2:13:52Entonces, pues los animales, eh, o sea,
2:13:56igual que con las plantas, o sea, el
2:13:58producto que vas a obtener va a ser
2:13:59diferente de las condiciones eh pues de
2:14:02estrés, este, el estado de salud del
2:14:05animal, la edad, entre otras, ¿no?
2:14:08Entonces, pues tenemos esta variabilidad
2:14:10entre el lotes por el suelo también. Eh,
2:14:12pues obviamente hay riesgos de
2:14:13contaminación y de hecho se menciona que
2:14:16para el manejo eh o bueno, para la
2:14:19obtención de estos sueros animales que
2:14:21se utilizarán para cultivo celular eh se
2:14:24sugiere el uso eh de granjas libres de
2:14:27libres de patógenos que básicamente pues
2:14:30van a estar confinadas en Australia o
2:14:33Nueva Zelanda, donde eh pues en de
2:14:36manera particular las enfermedades
2:14:39priónicas todavía no han llegado a estas
2:14:41regiones geográficas. gráficas.
2:14:42Entonces, pues eso también encarece la
2:14:44disponibilidad del producto, ¿no? O eh
2:14:47pues garantizar eh la distribución de
2:14:49estos eh de estos insumos. Eh, entonces,
2:14:53pues por todas estas razones también
2:14:55pues la industria farmacéutica pues ha
2:14:57ido migrando o ha tratado de hacerlo eh
2:15:00de cambiar hacia el uso de medios
2:15:02definidos químicamente que no requieran
2:15:05eh no requieran este suero. Sin embargo,
2:15:08eh pues estos medios pues son mucho más
2:15:10caros. eh incluso pues complejos de
2:15:12producir y a veces no son lo
2:15:14suficientemente eficaces, o sea, no son
2:15:17no se puede, depende de la línea eh de
2:15:19la línea celular.
2:15:21E también eh es importante mencionar que
2:15:25muchos de los, o sea, todos estos
2:15:27componentes que mencionamos que están en
2:15:28el medio de cultivo eh pues incluyen
2:15:32proteínas, eh seamos vitaminas eh
2:15:35complejos, perdón, compuestos que son eh
2:15:38lábiles a altas temperaturas. Eh,
2:15:41entonces también el manejo y la
2:15:43esterilización de estos medios de
2:15:45cultivo, por ejemplo, no se puede hacer
2:15:46por autoclave, a diferencia de eh un
2:15:48medio de cultivo, por ejemplo, medio
2:15:50leve para cultivar bacterias, eh no se
2:15:53puede no se pueden estilizar por
2:15:54autoclave, tienen que ser forzosamente
2:15:56eh por filtración o por radiación. Eh, y
2:15:59esto pues también incrementa eh los
2:16:01costos y dificulta eh el manejo.
2:16:04Ah, y bueno, también desde el punto de
2:16:06vista metabólico eh las células de
2:16:10mamífero también presentan algunas eh
2:16:12particularidades.
2:16:14Por ejemplo, en la hablando del
2:16:16metabolismo celular de estas células, la
2:16:19glucosa frecuentemente
2:16:21produce la producción de lactato,
2:16:23incluso en presencia de oxígeno, lo que
2:16:26puede acidificar el medio y afectar la
2:16:28viabilidad celular. Entonces, eh una vez
2:16:30que eh se trabaja en este tipo de
2:16:32biorreactores, eh pues nada más como
2:16:34dato, pues se tiene que estar
2:16:35monitoreando eh los niveles eh de
2:16:38glutamato. Hm. Además, eh decíamos que
2:16:41también estos medios es importante la
2:16:42presencia de la glutamina como una
2:16:44fuente de nitrógeno. Eh pero pues por
2:16:47ende la glutamina suele eh como tiene
2:16:49más grupos amino eh pues genera una
2:16:53mayor cantidad de amonio que también a
2:16:55su vez puede interferir con la
2:16:57glicosilación de proteínas y reducir su
2:17:00calidad. Entonces, también es algo que
2:17:01pues se tiene que definir eh muy bien.
2:17:04Entonces, en general eh pues estas
2:17:07líneas requieren estrategias de de
2:17:10alimentación eh controlada, usualmente
2:17:14eh biorreactores eh los Fedbatch, ¿no?
2:17:19donde se vayan adicionando los
2:17:21nutrientes de manera gradual, justamente
2:17:23para evitar esta acumulación muy rápida
2:17:25de estos metabolitos y para mantener las
2:17:28condiciones óptimas de producción.
2:17:31También estas plataformas
2:17:34eh se pueden implementar sistemas
2:17:36biorrectores eh de perfusión para
2:17:39mantener las concentraciones estables de
2:17:41nutrientes eh y también ayuda a
2:17:43controlar a obtener mejores rendimientos
2:17:45a nivel de densidad celular.
2:17:49Otro punto importante que hay que
2:17:51mencionar es que e las células de
2:17:53mamífero, a diferencia de las levaduras
2:17:55o de las células eh vegetales, pues no
2:17:58tienen una eh una pared, entonces son
2:18:00células muchísimo más eh delicadas.
2:18:04Entonces, a pesar de que decíamos que se
2:18:06pueden utilizar sistemas eh cultivos en
2:18:10suspensión, pues estas agitaciones eh
2:18:13pues son eh son ridículamente menores,
2:18:16prácticamente inexistentes, o sea, son
2:18:18eh muy bajas porque pues hay un estas sí
2:18:22son muy susceptibles eh al estrés eh al
2:18:25estrés mecánico.
2:18:27Además es importante controlar la
2:18:31densidad celular,
2:18:33ya que en este tipo de células ocurre lo
2:18:35que se llama inhibición por contacto,
2:18:37especialmente cuando se trabaja con
2:18:39células en monocapa, es que conforme se
2:18:41van expandiendo las células se va eh en
2:18:44un espacio eh finito eh de cultivo y
2:18:48conforme va aumentando la biomasa, pues
2:18:50la unión o digamos que se van acercando
2:18:52cada vez más, cada vez más las células
2:18:54entre sí. mientras más allá más empiezan
2:18:56a amontonar. Y este contacto célula
2:18:58célula
2:19:00para inmediatamente el crecimiento
2:19:03celular porque pues como generalmente
2:19:05están e pues son obtenidas de un tejido
2:19:08sólido compacto, eh pues mandan estas
2:19:11señales de ya llegamos a lo que se llama
2:19:13confluencia, eh ya no podemos crecer
2:19:15más. Entonces, para su crecimiento y
2:19:17esto puede eh también influir en la eh
2:19:20en la productividad.
2:19:21Entonces, esto es algo que eh se tiene
2:19:23que eh que considerar. Por otro lado, en
2:19:26el procesamiento downstream, eh pues
2:19:28existen eh potenciales eh contaminantes
2:19:31que a los que hay que ponerles mucha
2:19:33atención. Eh podemos tener eh pues sí,
2:19:36contaminantes de las propias células que
2:19:37también pueden llegar a ser
2:19:38inmunogénicos, eh ADN o partículas
2:19:41virales provenientes eh de los métodos
2:19:44de transfección o de inmortalización.
2:19:46eh
2:19:48que pues tenemos que asegurarnos que se
2:19:51que se eliminen durante el procesamiento
2:19:53downstream. De hecho, en estos en este
2:19:56en estas etapas de purificación suelen
2:19:59eh incluirse eh etapas de tanto de
2:20:02inactivación química o eliminación
2:20:04viral, por ejemplo, por eh
2:20:06ultrafiltración, así como también eh
2:20:09muchas eh diferentes pruebas de
2:20:12detección de partículas virales o de
2:20:14agente de agentes patógenos en etapas eh
2:20:17estratégicas eh de producción.
2:20:22Hm. Y bueno, también un pequeño
2:20:24paréntesis. Si se fijan, en la
2:20:26diapositiva anterior les puse una tabla
2:20:29pues bastante pequeña nada más pues para
2:20:31ilustrar específicamente las líneas
2:20:33celulares humanas que se pueden utilizar
2:20:36eh para la producción de
2:20:37biofarmacéuticos y que ya hay productos
2:20:38aprobados con esta línea. Se fijan, no
2:20:40les he mostrado ejemplos de células show
2:20:42o de BHK. Eh, aquí eh pues solamente voy
2:20:46a decir que los productos que se
2:20:48expresan en estas líneas celulares eh
2:20:50son muchísimos. eh pues van a ver que
2:20:53pues la mayoría de los medicamentos
2:20:54biotecnológicos se expresan en estas
2:20:56plataformas.
2:20:58Eh, bueno, ahora vamos a hablar eh de
2:21:01otra plataforma biológica bastante
2:21:03interesante y que ha ido lento, pero
2:21:07pues ya ha ido ganando un poquito de
2:21:08terreno eh
2:21:11en la industria farmacéutica, que es el
2:21:14manejo eh de animales eh transgénicos.
2:21:18Esta es una estrategia alternativa a las
2:21:22células eh de mamífero, las líneas
2:21:24celulares. O sea, al hablar de animales,
2:21:27pues estamos hablando de eh sistemas eh
2:21:31de mamíferos, o sea, más cercanos eh a
2:21:34nosotros y que va a estar orientada a la
2:21:37obtención también por lo mismo de las
2:21:39especies de la a la producción de
2:21:41proteínas eh complejas. Y aquí eh a gran
2:21:45escala el enfoque o la e el objetivo de
2:21:49utilizar eh animales transgénicos para
2:21:52producir biofarmacéuticos
2:21:54consiste en modificar genéticamente
2:21:56animales para que expresen eh proteínas
2:21:59terapéuticas en tejidos tejidos o
2:22:01fluidos específicos.
2:22:04Generalmente, como dice aquí, con el
2:22:05objetivo de secretarlas en fluidos
2:22:07biológicos de fácil eh recolección
2:22:11como eh la leche, la sangre, la orina y
2:22:15el huevo. En la en este caso la clara de
2:22:18huevo.
2:22:20Yo creo que en términos de seguridad y
2:22:23de niveles de producción y de facilidad
2:22:25de obtención, eh la
2:22:29eh la
2:22:33dirección de la expresión o acumulación
2:22:36de las proteínas recombinantes se ha
2:22:38dirigido principalmente a la leche.
2:22:42Y bueno, los animales transgénicos, a
2:22:45diferencia de las líneas celulares,
2:22:47donde la producción de los
2:22:50biofarmacéuticos o de las proteínas
2:22:51recombinantes va a ocurrir en ambientes
2:22:53controlados como en biorreactores.
2:22:56Aquí en los animales transgénicos, algo
2:22:58similar a lo que decíamos que ocurre con
2:23:00las plantas genéticamente modificadas es
2:23:04que eh el organismo, en este caso un
2:23:06animal, pues puede ser una vaca, una
2:23:08cabra, una oveja, actúa como un
2:23:11biorreactor vivo para la producción de
2:23:13la proteína
2:23:15y que eh pues exploten estas eh
2:23:20eh estas em
2:23:24equipos o plataformas industriales para,
2:23:28por ejemplo, para que se utilizan en la
2:23:29ganadería o para la obtención, por
2:23:31ejemplo, en grajas lecheras para la
2:23:33ordeña, eh pues para poder recuperar el
2:23:36producto y reducir los costos.
2:23:39E hay que tomar en cuenta que en
2:23:41términos eh de control del proceso, la
2:23:44escalabilidad, eh costos y
2:23:47consideraciones éticas, pues esta
2:23:48plataforma pues es eh es diferente. No
2:23:52voy a decir que sea buenoala, es es
2:23:54diferente. Deamos en términos de
2:23:56escalabilidad se puede utilizar eh las
2:23:58herramientas de ganadería que ya
2:24:00existen. Eh los costos pues también se
2:24:02disminuyen eh pues porque es simplemente
2:24:04crear un animal. Sin embargo, aquí hay
2:24:07que mencionar que la obtención de los
2:24:09animales genéticamente modificados para
2:24:12producir los biofarmacéuticos, pues no
2:24:13son técnicas eh sencillas eh y son
2:24:16bastante laboriosas, tardadas, eh pero
2:24:19una vez que se que se obtienen y si se
2:24:20hacen adecuadamente
2:24:22se pueden tener eh eh digamos como una
2:24:26línea eh de animales transgénicos que
2:24:30van a producir generación tras
2:24:31generación eh el biofarmacéutico. Y
2:24:34bueno, también hay que agregar,
2:24:35decíamos, las consideraciones éticas
2:24:38sobre eh aquí, por ejemplo, ya se puede
2:24:41e puede intervenir la regulación a nivel
2:24:44veterinario y asegurar el bienestar
2:24:46animal.
2:24:48Eh,
2:24:50entonces, pues estos animales
2:24:52transgénicos son aquellos en los que se
2:24:54ha introducido de manera estable, aquí
2:24:56es importante que sea estable, un gen
2:24:59exógeno a su genoma, de manera que se
2:25:02exprese en determinadas células o
2:25:04tejidos, no necesario que se exprese eh
2:25:06en todo el animal.
2:25:08Eh,
2:25:10entonces, eh, decíamos que pues la
2:25:12plataforma eh que más se utiliza
2:25:15es la leche. Eh, aquí, por ejemplo, en
2:25:19la tabla que se muestra en la
2:25:21diapositiva se muestran eh los
2:25:24rendimientos que se pueden obtener en
2:25:26términos de obtención eh o de expresión
2:25:29de proteínas eh en leche. Eh, si se
2:25:31fijan, aquí estamos en el orden de
2:25:33gramos por litro, o sea, son bastantes
2:25:36son rendimientos bastante buenos.
2:25:38Y pues también hay que considerar que
2:25:39dependiendo del tamaño del animal, eh
2:25:42pues mientras más grande el animal, pues
2:25:44mayor la eh la cantidad eh de leche y
2:25:48por ende biofarmacéutico que se puede eh
2:25:51que se puede obtener.
2:25:53Y también hay que mencionar que, por
2:25:55ejemplo, pues la leche es un vehículo
2:25:59relativamente seguro de bastante
2:26:01caracterizado, de la cual siempre y
2:26:04cuando el animal esté sano, pues no
2:26:07tiene por qué haber patógenos. es un
2:26:09producto eh estéril e y de una
2:26:13composición menos compleja que la que
2:26:16pudiera presentarse eh con el medio hm
2:26:19de lo de la el medio para suplementar a
2:26:21las líneas eh a las líneas celulares,
2:26:24justamente por la presencia de los
2:26:25sueros animales. Aquí pues la leche está
2:26:28principalmente constituida por caseína,
2:26:32lactoglobulinas, lactoalbumina,
2:26:35eh la cual pues o sea, es un es un
2:26:38fluido rico en proteínas e que pues es,
2:26:42o sea, eso facilita eh la producción
2:26:44siempre y cuando las características
2:26:45físico químicas del biofarmacéutico no
2:26:48sean muy similares a las de las eh
2:26:51proteínas de la leche. Y pues también si
2:26:53lo vemos de esta manera sobre el
2:26:55procesamiento down, el offstream, pues
2:26:58sería simplemente pues que el animal
2:27:00produzca leche. Eh, que obviamente pues
2:27:04está la limitante es que est este
2:27:06abordaje
2:27:08pues está limitado a animales hembras y
2:27:11eh pues que tiene que llegar a cierta
2:27:13edad, a la edad reproductiva pues para
2:27:15poder inducir la lactación y que
2:27:18obviamente el animal tuvo que haber
2:27:19estado preñado al menos una vez. Eh,
2:27:22pero pues sin embargo en eh pues en la
2:27:25industria lechera pues ya esto ya está
2:27:26bien establecido. Eh, además también
2:27:28recordemos que eh la producción de leche
2:27:31va a estar dada eh pues por la
2:27:33estimulación física, la succión, la
2:27:35demanda. Entonces, pues ya también
2:27:37decíamos, estas estrategias a nivel de
2:27:40ganadería en las granjas lecheras, pues
2:27:42permiten
2:27:44pues tener a un animal produciendo leche
2:27:47pues por un eh por un buen por un buen
2:27:50tiempo, ¿no?
2:27:52Y esto pues la colecta en el
2:27:54procesamiento downstream pues sería pues
2:27:56prácticamente obtener la leche en, o
2:27:59sea, un producto estéril pues de fácil
2:28:02de fácil recolección. Deseamos con una
2:28:04complejidad, una mezcla pues que no sea
2:28:07tan compleja y que sea fácilmente eh
2:28:09purificable.
2:28:11Eh,
2:28:13aquí pues también eh los contaminantes
2:28:15celulares eh que puedan estar presentes
2:28:18pues van a ser menores eh que los
2:28:21cultivos eh en suspensión.
2:28:24Eh,
2:28:26y e aquí, por ejemplo, en la tabla eh se
2:28:30muestran ejemplos, decíamos el el TPA
2:28:34producido en leche de cabra eh que se o
2:28:37sea que ya está probado. También creo
2:28:38que habíamos hablado de la de el la
2:28:42antitrombina o el atrín. Eh, en la
2:28:45unidad dos hablábamos de eso en el
2:28:46primer tema, que esa es producida
2:28:48también en leche de cabra y ese ya está
2:28:50eh aprobado para su uso para su uso
2:28:53comercial y eh en humanos.
2:28:56Eh, también pues para resaltar otro
2:28:58ejemplo de la de los que vienen aquí
2:29:01descritos en la tabla, que estos no
2:29:02necesariamente ya todos han sido
2:29:04aprobados como biofarmacéuticos, pero
2:29:07por ejemplo eh podemos ver eh la eh
2:29:11lactalbúmina alfa humana eh para eh
2:29:14producirse en vacas, que este, por
2:29:18ejemplo, es una eh se me hace
2:29:20interesante porque tal vez esta no tiene
2:29:22una aplicación biofarmacéutica, pero es
2:29:24una manera eh de producir
2:29:27leche humanizada. No hay personas que
2:29:30son intolerantes o alérgicas a la
2:29:33proteína de la leche de vaca. Entonces
2:29:35esta el introducir una eh albúmina,
2:29:38lactalbúmina humana, que es una de los
2:29:40de los componentes a los que las
2:29:41personas suelen ser alérgicas, eh pues
2:29:44es básicamente una vaca con leche eh con
2:29:47leche humanizada, pues una leche
2:29:48hipoalergénica, ¿no?
2:29:52Eh otro eh tejido o células en las que
2:29:55se puede inducir la expresión de
2:29:57proteínas recombinantes es la sangre, eh
2:30:01donde las proteínas pues van a ser
2:30:02secretadas al plasma. Eh, sin embargo,
2:30:05esta no ha tenido tanto eh tanto éxito
2:30:08como la leche, porque eh pues la
2:30:09recuperación es compleja eh o sea, se
2:30:13obtiene por métodos invasivos, el
2:30:15volumen que se puede extraer animal eh
2:30:18es limitado. Eh, por ejemplo, pues en en
2:30:22el caso de la leche, pues uno puede eh
2:30:24vaciar completamente eh eh las glándulas
2:30:27mamarias, las ubres, este a sacar toda
2:30:30la leche y no le pasa nada al animal.
2:30:32aquí pues en la sangre no le puede sacar
2:30:34todo el volumen de sangre al animal,
2:30:35tienes casi siempre el 10%. Entonces
2:30:38también eso limita, pues dependiendo del
2:30:40tamaño del animal. Eh, además eh se ha
2:30:43visto que pues al ser un una especie eh
2:30:49pues muy cercana a los humanos, estar
2:30:50hablando de mamíferos, pues habría que
2:30:53checar eh que el biofarmacéutico que
2:30:54estén produciendo eh pues no genere
2:30:57efectos como tal eh en el animal porque
2:30:59pues va a estar en la circulación eh
2:31:01sangine.
2:31:03Eh, la orina también es otra eh es otra
2:31:06plataforma. Aquí, por ejemplo, se
2:31:07utiliza o se sigue eh el uso de eh de
2:31:12promotores eh de proteínas que están de
2:31:14superficie en las células eh epiteliales
2:31:18eh para eh inducir la eh la producción o
2:31:22la acumulación de las proteínas en orina
2:31:24en las células epiteliales de la vejiga.
2:31:28Sin embargo, bueno, aquí la ventaja que
2:31:30tendría es que pues también la orina es
2:31:32un fluido estéril y a diferencia de la
2:31:35leche, pues es mucho menos complejo en
2:31:37términos de digamos de contaminantes que
2:31:40simplemente va a tener sales, eh urea, o
2:31:42sea, no es normal que haya proteínas eh
2:31:44o lípidos. en términos de purificación,
2:31:47eh, pues esto sería mucho más sencillo.
2:31:50Sin embargo, pues tenemos aquí la
2:31:51cuestión de pues los métodos de
2:31:52obtención, eh, que también, por ejemplo,
2:31:55e la la orina es un fluido que varía
2:31:58mucho dependiendo de la de las
2:31:59condiciones eh pues de la dieta o el
2:32:01estado de salud del animal, o sea, puede
2:32:03eh el pH puede variar mucho eh o la
2:32:07concentración de sales. Entonces, esto
2:32:10pues puede alterar la estabilidad del
2:32:12biofarmacéutico, además que pues se
2:32:14menciona que no es como que no es muy
2:32:16bien aceptado en términos de pues del
2:32:19mercado, ¿no?
2:32:21Eh, por otro lado tenemos eh la
2:32:24expresión en la clara de huevo
2:32:26utilizando eh aves transgénicas eh que
2:32:28esto pues permite la eh la recuperación
2:32:31de la proteína eh pues en el huevo,
2:32:33facilitando también eh la recolección.
2:32:36Eh, sin embargo, aquí tenemos la
2:32:38limitante que las eh pues los métodos de
2:32:42modificación genética eh de las aves
2:32:44pues no están tan estudiados como los en
2:32:47la modificación eh de mamíferos.
2:32:53En la figura que se muestra aquí, eh es
2:32:55para ejemplificar
2:32:57cómo suelen eh diseñarse eh las
2:33:00construcciones de los transgenes
2:33:04que se van a utilizar para eh la
2:33:07obtención de animales eh genéticamente
2:33:09modificados, específicamente para la
2:33:11producción en leche. para estos, bueno,
2:33:14lo de arriba sería como que los
2:33:15requerimientos mínimos y abajo pues un
2:33:18ejemplo de las de las una construcción
2:33:21real. Entonces, para inducir la
2:33:23acumulación de las proteínas en leche,
2:33:25casi siempre lo que se utilizan son
2:33:27promotores de proteínas de la leche,
2:33:29como decíamos, eh, globulina,
2:33:31lactoglobulinas, eh lactualbúmina y
2:33:34betacaceína o también eh de la eh la
2:33:38proteína ácida del suero de la leche, eh
2:33:41que estos pues también pues son
2:33:42promotores eh bastante fuertes y si se
2:33:45fijan eh pues no es nada más eh los
2:33:48promotores casi siempre pues requieren
2:33:50eh regiones regulatorias adicionales
2:33:52como enhancers, así como eh insuladores.
2:33:56Ah, además
2:33:58eh pues también suele venir acompañado,
2:34:01o sea, como también esta construcción se
2:34:04va a integrar al genoma de las células
2:34:06del animal, o sea, no es una expresión
2:34:07eh episomal o transitoria. Eh, aquí en
2:34:12este caso pues también deben de eh de
2:34:14considerarse pues ciertos eh ciertos
2:34:17intrones y exones para eh asegurar la
2:34:20correcta expresión eh del transgéne.
2:34:26En esta tabla se enlistan algunos
2:34:28ejemplos eh de proteínas humanas eh
2:34:31recombinantes que se han expresado
2:34:34justamente en la leche de animales eh
2:34:37transgénicos. no son los únicos, también
2:34:39se han producido eh pues factores de
2:34:41crecimiento eh o sea, diferentes
2:34:44hormonas, eh anticuerpos o fragmentos de
2:34:48anticuerpos. Eh, aquí pues
2:34:50independientemente de el gen, lo que yo
2:34:52quisiera eh resaltar de esta tabla pues
2:34:54son justamente esos elementos eh
2:34:56regulatorios que se utilizan en las
2:34:58construcciones. Por ejemplo, tenemos eh
2:35:02eh decíamos promotores e insuladores de
2:35:04la betaína, de la lactoglobulina o la
2:35:08proteína ácida del suero de leche. Eh,
2:35:11también pues las especies utilizadas van
2:35:14a influir directamente en los
2:35:16rendimientos o los niveles de producción
2:35:18de proteína. eh recombinante. Aquí, por
2:35:20ejemplo, se expresa en el orden de
2:35:22miligramos eh por mililitro. Entonces,
2:35:25las especies en las que se ha trabajado
2:35:27más tenemos vacas, eh cabras, ratones,
2:35:31eh conejos y cerdos.
2:35:35Aquí decíamos que pues mientras más
2:35:37grande sea el animal, mayor va a ser el
2:35:39volumen de leche que se puede obtener y
2:35:41por ende pues la cantidad eh de proteína
2:35:45recominante que se pudiera eh obtener.
2:35:48Yo creo que en la industria
2:35:49farmacéutica, como el caso de la Trin y
2:35:51justamente del TPA, la plataforma que
2:35:53más se utiliza es cabra, que es un es un
2:35:56punto un poquito más intermedio porque
2:35:58las vacas, si bien pueden producir mucha
2:36:00más leche, el tiempo que les demora a
2:36:02llegar a la edad suficiente eh pues para
2:36:05estar en esta etapa reproductiva eh es e
2:36:10es mayor. Además, pues a nivel de la
2:36:12infraestructura pues requieren mucho más
2:36:14espacio. Digamos que en este caso pues
2:36:16una cabra pues es un formato pues mucho
2:36:18más adecuado para la producción
2:36:20industrial de biofarmacéuticos. En el
2:36:23caso de ratones y conejos, pues
2:36:25obviamente el volumen de leche que se
2:36:26puede obtener es muy bajo. Eh y esto
2:36:28pues está centrado pues simplemente como
2:36:30una etapa eh de investigación.
2:36:33Eh, aquí pues los rendimientos si se
2:36:35fijan eh varía mucho y también pues
2:36:37tiene que ver pues con los prometores
2:36:39los promotores que se utilicen. Y
2:36:42también me atrevo a decir a los métodos
2:36:45eh de modificación eh genética que de
2:36:48hecho se indican aquí. ¿Ven que dice
2:36:50aquí NT o MI? Eh, MI se refiere a a
2:36:54microinyección y NT es a transferencia
2:36:57nuclear. Eh, ahorita vamos a hablar un
2:36:59poquito de de esos métodos.
2:37:04Y bueno, aquí nada más les pongo eh pues
2:37:06un dato, una nota eh científica que
2:37:09salió hace eh hace poquito sobre una
2:37:13iniciativa que está ahorita en
2:37:15investigación para la producción o
2:37:17sorpresa de insulina humana en en leche,
2:37:20en este caso en leche de vaca.
2:37:23Entonces, o sea, nada más eh como un
2:37:25ejemplo eh pues de cómo de verdad sí eh
2:37:29pues han estado eh ganando terreno esta
2:37:32esta plataforma de producción de
2:37:34animales transgénicos.
2:37:36Eh, y pues ya eh estas pacas
2:37:40genéticamente modificadas para producir
2:37:42insulina humana en leche, pues ya están
2:37:44en etapas e en etapas clínicas, además
2:37:47de las eh de las proteínas o ejemplos
2:37:50que les ponía eh que les ponía
2:37:52previamente. Eh por ahí pueden eh buscar
2:37:56eh esta nota eh si buscan el eh el
2:37:59título, pues para profundizar un poquito
2:38:01más en esto.
2:38:05Y bueno, mencionaba previamente que el
2:38:08meollo en el asunto o un punto
2:38:10importante en el caso
2:38:14de la obtención de o el manejo de
2:38:15animales transgénicos para la producción
2:38:17de los biofarmacéuticos eh tiene que ver
2:38:20que el detalle está en cómo cuáles van a
2:38:23ser las técnicas para obtener justamente
2:38:26esos animales genéticamente modificados.
2:38:28Aquí eh pues no estamos hablando de
2:38:30modificar eh una línea celular y
2:38:32estandarizarla y producirla en un
2:38:34biorreactor, sino cómo podemos hacer eh
2:38:37para asegurarnos eh que vamos a obtener
2:38:39un animal que exprese la proteína de
2:38:41nuestro interés, pero eh que además eh
2:38:44nos permita pues transmitir esa
2:38:46información genética a lo largo de eh
2:38:49pues generaciones. Entonces, aquí si
2:38:52pues básicamente lo que se busca es la
2:38:55modificación de la línea germinal de
2:38:58estos animales. Es decir, eh los métodos
2:39:01de modificación genética para obtener
2:39:03animales transgénicos van a involucrar
2:39:05la modificación genética principalmente
2:39:08de células de células embrionarias o de
2:39:11células sexuales o eh
2:39:14de células eh pluripotenciales en en
2:39:18diferentes etapas del desarrollo
2:39:20embrionario. Eh vamos a hablar primero
2:39:23de la microinyección pronuclear. Eh,
2:39:26esta técnica se basa en la introducción
2:39:29directa del ADN exógeno de nuestro gen
2:39:32eh de interés en el núcleo de un cigoto
2:39:36en etapas tempranas del desarrollo
2:39:38embrionario con el objetivo de que la se
2:39:41integre el gen de interés en el genoma
2:39:44de ese embrión y eh pues al final eso
2:39:47garantice su transmisión eh a la
2:39:49descendencia.
2:39:50Eh, aquí, bueno, pues como fundamento
2:39:52esta técnica podríamos decir que eh pues
2:39:55obviamente eh la fertilización del óvulo
2:39:59o del lobocito eh por el espermatozoide
2:40:01pues se tiene que llevar a cabo. Eh, y
2:40:04en este proceso de fertilización
2:40:07se forman eh dos estructuras eh
2:40:10nucleares diferenciadas, o sea, en
2:40:11etapas muy muy tempranas del desarrollo,
2:40:14como se ve aquí e en la figura, don que
2:40:18se llaman pronúcleos, ¿no? O sea, el
2:40:20básicamente tenemos el óvulo y el
2:40:22espermatozoide llega y lo que hace pues
2:40:25es insertar eh el núcleo eh en el óvulo.
2:40:29Y es en este punto tenemos los dos
2:40:31pronúcleos, uno de origen masculino y el
2:40:33otro eh femenino o materno, paterno. Eh
2:40:37estos núcleos pronúcleos van a contener
2:40:39el material genético que posteriormente
2:40:41se va a fusionar y donde va este a ver
2:40:43este proceso de recombinación para
2:40:45formar el núcleo diploide del embrión.
2:40:50Entonces, en la microinyección
2:40:51pronuclear aprovecha justamente esta
2:40:54etapa, ya que uno, los pronúcleos son eh
2:40:57visibles en el microscopio y son
2:41:00accesibles eh para la manipulación
2:41:03y además que es justamente en este punto
2:41:06previo a que se haga esta integración de
2:41:09lo del eh del del genoma materno y
2:41:13paterno. Entonces, la probabilidad
2:41:17de la transfección o que se integre el
2:41:19gen de interés en el embrión, pues es
2:41:22bastante bastante alta. De hecho, e los
2:41:25términos de eficiencia o eficacia más
2:41:28bien de esta técnica de modificación
2:41:30genética es prácticamente del 100%. Eh,
2:41:33sin embargo, pues esta se tiene que
2:41:35hacer célula por célula.
2:41:37Eh,
2:41:40entonces una vez introducido el ADN,
2:41:42pues se integra de manera aleatoria en
2:41:44el genoma durante las primeras
2:41:45divisiones y da lugar eh a un organismo
2:41:48eh transgénico.
2:41:50Eh, entonces, inicialmente, o sea, los
2:41:52pasos eh como tal para obtención de
2:41:54estos animales genéticamente modificados
2:41:56es obtener los igotos eh recién
2:41:59fertilizados
2:42:01eh generalmente mediante la inducción de
2:42:04la superovulación de hembrias. hembras
2:42:06donadoras, seguida de una fertilización
2:42:09invitro, eh que esto pues también en la
2:42:12industria eh eh veterinaria o agrícola,
2:42:17pues la fertilización invitro pues es
2:42:18bastante y está bastante estandarizada,
2:42:21es algo que se hace mucho. Eh, estos
2:42:24igotos se recolectan justamente en esta
2:42:26etapa cuando los pronúcleos aún se
2:42:28distinguen.
2:42:30Posteriormente, los igotos se colojan
2:42:32bajo un microscopio invertido y equipado
2:42:35con micromanipuladores o con
2:42:36micropipetas.
2:42:38Eh, o sea, son sujetadas y movilizadas.
2:42:41Y con una eh micropíipeta eh bastante
2:42:44bastante fina se introduce una solución,
2:42:47sería aquí en esta etapa que contiene el
2:42:51ADN eh recombinante directamente en el
2:42:55pronúcleo. Sí, en este caso eh me parece
2:42:58es el pronúcleo más grande. Si no me
2:42:59equivoco, es el pronúcleo de la hembra.
2:43:04Eh, usualmente el ADN que se utiliza
2:43:07para la transición es una construcción
2:43:09lineal que obviamente va a incluir el
2:43:11gen de interés eh y el promotor eh
2:43:14adecuado para el tejido donde queremos
2:43:16que se exprese.
2:43:18Eh, una vez realizada la microinyección,
2:43:21los embriones se cultivan brevemente
2:43:23invitro y luego se transfieren a un
2:43:26obiducto o al útero de una hembra eh
2:43:29receptora. Aquí lo que se muestra eh es
2:43:32un es una es un ratón, una ratona eh que
2:43:35va a estar eh pseudopreñada o
2:43:37sincronizada eh hormonalmente para que
2:43:40pues se facilite la transferencia y la
2:43:44implantación de este embrión donde pues
2:43:47van a continuar su desarrollo eh
2:43:50gestacional hasta que pues se generan eh
2:43:52las crías. Entonces, las crías que nacen
2:43:55se analizan mediante técnicas
2:43:56moleculares para confirmar, pues que
2:43:58efectivamente se haya eh integrado el
2:44:01transgen. Entonces, aquí en esta etapa
2:44:03pues podríamos obtener eh
2:44:07animales enteroigotos que tengan nuestro
2:44:10gen de interés y luego
2:44:12pues una vez que se selecciona
2:44:15el animal que tiene el fenotipo que
2:44:17nosotros deseamos y que también hay que
2:44:19considerar pues que sea un animal eh
2:44:22sano, que no tenga deformaciones, que no
2:44:24tenga alterado su crecimiento, que no
2:44:25sea propenso a ciertas enfermedades por
2:44:27esa modificación genética, porque de
2:44:29nuevo e la integración del ADN exógeno
2:44:33mediante esta técnica, pues va a ser al
2:44:35azar. Eh, entonces pues se selecciona eh
2:44:38los animales que sean más adecuados, o
2:44:40sea, que que eh pues sí, que cumplan con
2:44:43las características para eh producir la
2:44:45proteína recombinante y mediante eh pues
2:44:48ya cruzas entre eh pues varias eh varios
2:44:52animales con estas características, pues
2:44:54se puede obtener eh una línea eh
2:44:57transgénica, homocigota que pues a
2:45:01partir de eso pues de todas las cruzas
2:45:03pues van a obtener eh pues siempre van a
2:45:05ser capaces de producir el gen eh el gen
2:45:08de interés. Y esto, por ejemplo, pues a
2:45:11largo plazo pues tiene muchas ventajas.
2:45:13Si bien esto es un proceso, eh la
2:45:15microinyección es un proceso eh
2:45:17complicado de requiere mucha habilidad y
2:45:19pericia eh técnica pues de alguien en el
2:45:22laboratorio, pero si se hace bien es
2:45:24bastante eficiente y con estas cruzas o
2:45:27generar estas líneas homocigotas eh pues
2:45:31a largo plazo pues tenemos eh animales
2:45:33que pueden eh generar la proteína
2:45:36recombinante pues por mucho tiempo.
2:45:41Otra técnica que se puede utilizar para
2:45:44la modificación genética y obtención de
2:45:46animales transgénicos es la modificación
2:45:48de células embrionarias o
2:45:50pluripotenciales.
2:45:52Eh, esta técnica se basa en la
2:45:54manipulación genética de células madre
2:45:57capaces de diferenciarse en múltiples
2:45:59linajes celulares y posteriormente eh
2:46:02contribuir al desarrollo de un organismo
2:46:05completo. Entonces, ya sabemos que las
2:46:07células madre embrionarias derivan eh
2:46:10pues de ciertas regiones del embrión
2:46:13blastocisto, ya en etapas posteriores de
2:46:15desarrollo y pues poseen las
2:46:18características eh de autorrenovación y
2:46:21además de la pluripotencialidad, es
2:46:23decir, que pues se pueden diferenciar eh
2:46:25diferentes eh órganos.
2:46:28Eh, dependiendo de la región en el
2:46:31embrión donde se manejen, se obtengan
2:46:32estas células pluripotenciales, pues
2:46:35prácticamente podrían diferenciarse en
2:46:37todos los tipos celulares del organismo
2:46:39y proliferar indefinidamente en
2:46:41condiciones eh de cultivo de forma
2:46:43adecuada. Entonces, pues también eh
2:46:47estos eh la obtención de estas células
2:46:49madre eh embrionarias pluripotenciales,
2:46:53pues se pueden eh trabajar en el
2:46:55laboratorio.
2:46:56Y estas propiedades que tienen estas
2:46:58células ploripotenciales permiten que si
2:47:00se modifican genéticamente estas células
2:47:04puedan reincorporarse o incorporarse a
2:47:07un embrión en desarrollo y contribuir a
2:47:09la formación de tejidos, incluyendo
2:47:12decíamos las células eh germinales. Y es
2:47:15importante de nuevo que la modificación
2:47:16se haga en la línea germinal para eh que
2:47:19se pueda transmitir el transgen a la
2:47:20descendencia.
2:47:22Eh, en los últimos años también se han
2:47:25utilizado células pluripotenciales
2:47:27inducidas, es decir, que se obtienen a
2:47:29partir de células somáticas que ya han
2:47:31estado reprogramadas, pero eh que en la
2:47:35presencia eh pues de diferentes eh
2:47:37agentes químicos eh o factores,
2:47:40proteínas, hormonas, eh pues se pueden
2:47:43revertir y desdiferenciarse
2:47:45a generar pues unas células
2:47:48pluripotenciales pues aptas, ¿no?
2:47:50Incluso pues para esta técnica.
2:47:52Ah, y bueno, entonces, la metodología
2:47:55para obtener animales transgénicos
2:47:57mediante la manipulación de células
2:47:59pluripotenciales. En este caso, el
2:48:01proceso inicia con el aislamiento y el
2:48:04cultivo de células madreas.
2:48:08Y estas células se van a cultivar en
2:48:10medios especializados
2:48:12eh pues para que no eh no se
2:48:14diferencien.
2:48:16Eh en posteriormente en el laboratorio
2:48:18pues se va a introducir eh el ADN
2:48:21exógeno que puede ser eh pues mediante
2:48:24técnicas de transfección eh pues más
2:48:26estándar como electroporación, vectores
2:48:28virales, también pudiera ser
2:48:30microinyección probablemente.
2:48:33Sin embargo, a diferencia de la
2:48:35microinyección pronuclear que veíamos en
2:48:37la diapositiva pasada, en este caso, la
2:48:40modificación genética se realiza en un
2:48:42entorno controlado.
2:48:44Eh, ¿qué es lo que se dice? Lo que lo
2:48:46que viene aquí y que pues el hecho de
2:48:48que se haga de esta manera, pues permite
2:48:50eh seleccionar eh las células que han
2:48:54incorporado eh correctamente el
2:48:56transgen, o sea, desde, o sea, que no
2:48:57sea un proceso azaroso una vez que se
2:49:00van a manipular las células
2:49:01embrionarias.
2:49:03Entonces, se modifican genéticamente las
2:49:05células pluripotenciales, se seleccionan
2:49:07mediante pues marcadores eh y se
2:49:11caracterizan para confirmar la correcta
2:49:13inserción del transgen.
2:49:15Posteriormente, estas células se van a
2:49:18introducir en un embrión de otra eh
2:49:22obtenido, o sea,
2:49:24de manera independiente.
2:49:26Eh, y se van a introducir en el embrión
2:49:29en una etapa temprana, generalmente en
2:49:31el blastocisto, ¿sí? donde ya hay sufici
2:49:34hay, o sea, ya se hizo la eh la fusión
2:49:36de los pronúcleos y ya se empiezan a
2:49:38diferenciar en las diferentes eh
2:49:40regiones, pero pues dentro de este
2:49:43saquito es donde se introduce esas
2:49:45células pluripotenciales.
2:49:50Y pues eso va a permitir, o sea, las
2:49:53condiciones que están en este
2:49:54blastocisto,
2:49:55pues van a permitir pues que se sigan
2:49:58desarrollando, diferenciando las células
2:50:01pues para dar un animal completo,
2:50:02incluidas las células modificadas
2:50:04genéticamente.
2:50:06Entonces, de aquí el resultado va a ser
2:50:08un animal quimérico, es decir, un
2:50:12organismo compuesto por células
2:50:14modificadas y no modificadas, o sea, no
2:50:16todos, o sea, al final estas células que
2:50:20se modificaron genéticamente van a estar
2:50:22presentes y se van a van a ayudar a la
2:50:24formación del animal completo, pero no
2:50:27todas las células embrionarias eh que
2:50:29están aquí eh pues están modificadas
2:50:31genéticamente. Entonces, aquí si lo que
2:50:34se puede dar es que haya animales eh
2:50:37pues que tengan la modificación genética
2:50:40solamente en ciertos eh tejidos.
2:50:44Eh, entonces aquí eh lo que se tiene eh
2:50:48que hacer pues eventualmente, o sea, ya
2:50:50igual también se transfieren estos
2:50:52embriones a las hembras surrogadas que
2:50:55van a estar sincronizadas para la
2:50:57implantación, eh va a terminar la
2:50:59gestación del animal y ya una vez que
2:51:01nazca pues se van eh a caracterizar y
2:51:03ver de nuevo cuáles son las que producen
2:51:05eh pues el gen de interés. Eh, y de aquí
2:51:09eh
2:51:11igual eh pues aquellas que se hayan eh
2:51:14células, o sea, si hay un animal cuyas
2:51:16células modificadas están también en o
2:51:19están incluidas, digamos, eh lograron
2:51:21convertirse en células sexuales, eh pues
2:51:24estas también eh pues se pueden eh
2:51:27cruzar entre más eh animales que tengan
2:51:30la modificación genética para obtener eh
2:51:33líneas eh homozigotas.
2:51:38Y bueno, otra técnica que se utiliza
2:51:40para modificar eh genéticamente eh pues
2:51:43animales eh o para la obtención de
2:51:46animales transgénicos es la
2:51:47transferencia nuclear de células
2:51:49somáticas. Esta eh pues sería
2:51:52básicamente viene aquí clonación porque
2:51:55es la técnica con la que se pudo clonar
2:51:58eh a la oveja Dolly eh a finales de los
2:52:0090s.
2:52:02Eh esta técnica, a diferencia de la
2:52:04microinyección eh pronuclear o la
2:52:06modificación de células embrionarias, eh
2:52:09pues la modificación genética se hace
2:52:11sobre células somáticas, que recordemos
2:52:13las células somáticas son células no
2:52:15sexuales. Y esto se hace en el
2:52:19laboratorio, lo cual pues permite un
2:52:21control sobre el genoma del organismo
2:52:24resultante ese que se pueda caracterizar
2:52:27en el laboratorio, o sea, sería
2:52:28modificar, por ejemplo, una línea
2:52:30celular, supongamos una línea, como
2:52:33viene aquí, una línea celular de cerdo.
2:52:37este se caracteriza eh molecularmente,
2:52:40fenotípicamente
2:52:42eh
2:52:44y después el núcleo de esa célula
2:52:49proveniente de una línea celular, pues
2:52:51se transfiere a un animal o bueno, al a
2:52:54un embrión, un ovocito de un animal.
2:52:58Entonces, el principio de la
2:52:59transferencia nuclear de células
2:53:00somáticas se basa en la capacidad de la
2:53:04reprogramación eh nuclear. Eh, deseamos
2:53:08que en condiciones naturales eh una
2:53:10célula somática ya está diferenciada y
2:53:12expresa solo un subconjunto eh de genes.
2:53:16Eh, sin embargo, pues tiene toda la
2:53:18información genética pues para producir
2:53:20cualquier célula de cualquier tejido.
2:53:24Entonces, eh si esta se modifica, esta
2:53:27célula se modifica genéticamente
2:53:30y este el núcleo de esta célula se
2:53:32introduce en un obocito a la cual se le
2:53:35ha retirado el núcleo, el citoplasma del
2:53:38lobocito pues tiene toda esta maquinaria
2:53:41eh molecular para reprogramar ese núcleo
2:53:44hacia un estado eh pues totipotencial
2:53:47y por ende eh pues ya no va a ser una
2:53:49célula somática eh y va a adquirir la
2:53:53capacidad de dirigir el desarrollo
2:53:55completo de un organismo.
2:53:57Entonces, eh en para esta técnica
2:53:59deseamos pues primero se selecciona una
2:54:01célula somática, digamos, donadora, que
2:54:04puede ser, por ejemplo, un fibroblasto,
2:54:07cualquier otro tipo celular, una línea
2:54:09celular incluso eh pues de ATS, nada más
2:54:11que obviamente tiene que ser de la misma
2:54:12especie eh pues de la que se quiere
2:54:15generar el animal transgénico.
2:54:17Esta célula se modifica genéticamente en
2:54:20cultivo invitro como pues herramientas
2:54:23técnicas, herramientas, perdón, clásicas
2:54:27de transfección o incluso también de
2:54:29edición genética como Crisper
2:54:32para introducir el gen de interés.
2:54:36Eh, se hace la selección y se confirma
2:54:38la modificación genética.
2:54:41Eh, y en paralelo, o sea, digamos toda
2:54:44esta parte lo hicimos eh aquí, por
2:54:46ejemplo, aquí se muestra e una
2:54:49modificación genética mediante eh
2:54:51electrocoración.
2:54:53¿Sí? Y una vez eh que ya tenemos eh la
2:54:56línea celular, pues con las
2:54:58características que nosotros deseamos,
2:55:00pues se extrae eh se extrae el núcleo.
2:55:04Sí. A la par tenemos eh
2:55:10un ovocito
2:55:11al cual se le ha removido el núcleo, por
2:55:14ende eliminando su material genético
2:55:16original, pero pues que tiene toda esta
2:55:18configuración para eh generar eh un un
2:55:22organismo un organismo completo.
2:55:25Entonces, el núcleo de la célula
2:55:26somática modificada se transfiere a
2:55:28lobocito sin núcleo, ya sea pues
2:55:31principalmente es mediante
2:55:32microinyección, aunque también se puede
2:55:34hacer mediante eh eh fusión eh otro tipo
2:55:39de fusión celular inducida
2:55:41eléctricamente se menciona. E y entonces
2:55:45el oboscito reconstruido se activa para
2:55:50eh volver a iniciar el desarrollo
2:55:52embrionando embrionario, perdón.
2:55:55simulando pues todos estos procesos de
2:55:57eh fertilización.
2:55:59Entonces, el embrión resultante se
2:56:00cultiva invitro hasta alcanzar etapas
2:56:02tempranas, por ejemplo, de un
2:56:03blastocisto y transferirse eh
2:56:06posteriormente a la célula eh a la
2:56:08perdón, a la célula a una hembra eh
2:56:10receptora para su desarrollo completo.
2:56:14Entonces, el animal resultante de esta
2:56:16técnica es genéticamente idéntico a la
2:56:19célula somática de la, o sea, el
2:56:22material genético de la célula somática
2:56:24donadora, incluyendo pues la
2:56:27modificación genética que introducimos
2:56:29en el laboratorio.
2:56:32Aquí pues también vale la pena mencionar
2:56:35que con esta con esta técnica, la
2:56:38transferencia nuclear de células
2:56:39somáticas y la integración con
2:56:42herramientas como Crisper eh pues ha
2:56:45hecho mucho más fácil eh esta técnica,
2:56:47¿no? Actualmente es posible editar el
2:56:50genoma de células somáticas con mucha
2:56:52mejor eh precisión, especialmente pues
2:56:55para generar eh animales eh
2:56:57transgénicos.
2:57:02En esta tabla eh se enlistan algunos eh
2:57:06algunas proteínas terapéuticas
2:57:09eh en que están en investigación, por
2:57:11eso dice indicación potencial eh para
2:57:14aplicarse para la generación de eh de
2:57:16biofarmacéuticos. Entonces decíamos que
2:57:18pues muchos de estos se han enfocado en
2:57:21eh en cabras por esta plata de que son
2:57:23de un tamaño eh intermedio. También hay
2:57:26algunas otras eh para producción en
2:57:29leche eh de vaca, eh de cerdo, conejo y
2:57:33ovejas.
2:57:38Y bueno, pues con esto terminamos eh
2:57:40este video eh retomando un poquito eh
2:57:44pues la pregunta con la que inicié el
2:57:46video sobre pues cuál es la mejor
2:57:48plataforma para la producción de
2:57:50biofarmacéuticos.
2:57:51Eh pues en realidad eh pues no hay una
2:57:54respuesta correcta e incorrecta. Eh,
2:57:57aquí eh pues lo que va a definir cuál va
2:57:59a ser la plataforma más adecuada pues es
2:58:03el producto, ¿no? la proteína que eh la
2:58:06proteína recombinante que queramos
2:58:08producir, cuáles eh van a ser hm o sea,
2:58:11cuál va a ser la plataforma capaz eh de
2:58:15producir una proteína eh con las
2:58:18características, especificaciones o
2:58:20atributos de calidad eh deseados
2:58:24para que sea eh seguro y eficaz. Y eh
2:58:28además pues se deben de tomar en
2:58:30consideración pues esto, todos estos
2:58:32diversos eh factores en cuanto a costos,
2:58:34tiempos de producción, eh seguridad, eh
2:58:37el diseño del eh del proceso de la etapa
2:58:40upstream y downstream, eh también pues
2:58:42las herramientas de modificación o
2:58:44edición genética que se puedan utilizar
2:58:46para generar las líneas genéticamente
2:58:48modificadas. Eh, entonces, pues como
2:58:51dice aquí, eh, cada plataforma presenta
2:58:54ventajas y limitaciones que deben
2:58:56evaluarse en función del producto eh
2:58:59obtenido. Puede ser que haya algunas
2:59:01empresas, pues que les, por ejemplo,
2:59:03como estas que decíamos eh Medicago o
2:59:05Protalic, eh que son empresas
2:59:07biotecnológicas que se especializan en
2:59:09ciertas plataformas biológicas, en este
2:59:12caso eh plataformas eh vegetales.
2:59:17Pero pues en realidad pues se podrían
2:59:19utilizar muchas más, ¿no? Y esta eh la
2:59:22decisión pues implica justamente
2:59:24integrar todos estos conocimientos pros
2:59:27y contras que están inherentes en cada
2:59:29en cada plataforma eh pues con el
2:59:32objetivo de diseñar sistemas de
2:59:34producción robustos, escalables y
2:59:37seguros, es decir, productos eh pues con
2:59:39una calidad
2:59:41eh a lo largo de eh del tiempo y durante
2:59:43todo el ciclo de vida de eh del
2:59:45medicamento. Y también pues no olvidemos
2:59:48que ya también existen herramientas de
2:59:51diseño moleculares
2:59:54y de ingeniería genética, pues que
2:59:55permiten
2:59:58optimizar o darle propiedades nuevas a
3:00:01algunas plataformas biológicas para
3:00:03hacerlas más adecuadas para la
3:00:04producción de biofarmacéuticos.
3:00:06Entonces, pues en realidad, pues como
3:00:08vimos, incluso se pueden obtener,
3:00:11no anticuerpos, pero sí fragmentos de
3:00:13anticuerpos que son proteín que este que
3:00:16su estructura base pues es bastante eh
3:00:18compleja, pero que pues también se
3:00:19pueden producir en sistemas bastante eh
3:00:21bastante sencillos o como veíamos el
3:00:24caso pues de la insulina, la insulina
3:00:26prácticamente se puede producir en todas
3:00:28eh en todas las plataformas biológicas.
3:00:30Entonces, eh pues también hay que
3:00:32considerar, deseamos este el punto de
3:00:34vista regulatorio, qué tanto qué tanta
3:00:37experiencia tengan las agencias
3:00:39gubernamentales como las empresas
3:00:41farmacéuticas con eh con estas
3:00:45plataformas. O sea, en este sentido
3:00:47retomo esta parte de la industria
3:00:48farmacéutica conservadora. Eh, ¿de qué
3:00:51viene este dicho de que si no está roto
3:00:53no lo arregles, no? Si ya está muy
3:00:55establecida una plataforma biológica
3:00:57para producir cierto tipo de proteínas,
3:01:00pues va a ser, o sea, ya está muy bien
3:01:01estandarizada, ya se invirtieron muchos
3:01:04eh esfuerzos eh técnicos de
3:01:06infraestructura, económicos, etcétera,
3:01:08pues para mejorar esa plataforma pues va
3:01:10a ser muy difícil que se traslade eh se
3:01:13trasladen a otras, ¿no? Pero pues
3:01:15también pues eso no quita que haya otras
3:01:16empresas que prefieran utilizar otras eh
3:01:19plataformas emergentes.
3:01:22Pues entonces pues al final pues pues
3:01:25se pueden hacer muchas implementar
3:01:27muchas estrategias, ¿no? Para poder
3:01:29utilizar prácticamente prácticamente
3:01:31todas. M.

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This page contains the full transcript of 11 ¿Dónde se producen los biofarmacéuticos? by Aída Jimena Velarde Salcedo, generated from the public captions YouTube serves with the video. The transcript has 25,664 words across 4,310 segments, with the original timestamps preserved so you can click any line to jump to that moment in the embedded player.

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